Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. Mikroüretim McGill Üniversitesi&#39;nde McGill nanoTools MICROFAB imkan ve Carleton Üniversitesi Elektronik Bölümü desteğiyle gerçekleştirildi.

Kan Ottawa Üniversitesi (H11-13-06) etik kurul onayı ile sağlıklı bireylerden tahsil edilir. 1. Microchannel Fabrikasyon Mikrokanallar standart fotolitografi yöntemleri 18 dayalı üretilmektedir. <ol><li> Bilgisayar Destekli Tasarım (CAD) yazılımı kullanılarak mikrokanal geometrisi Tasarım ve şeffaflık foto maske yapılandırmayı yazdırın. Onlar fabrikasyon sürecinde ışık yolu dikte beri bu maskeler çok önemlidir. Bu durumda, mikrokanal boyutları derinlemesine kalınlığı 120 um, 60 um ve uzunluğu 7 mm. </li><li> Bir temiz oda, sıkma kaplama epoksi negatif göre arzu edilen mikro derinliği (60 um) elde etmek için 30 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de bir silikon foto-karşı dirençlidir. </li><li> Gofret ve 650 mJ / 70 sn cm 2 bir UV lamba altında fotoğraf maskesi Açığa. Sadece saydam alanlar açığa olunUV-ışık fotoğraf maskesi. saydam alanların maruz bir sertleşmesiyle elde edilen zincirleri polimerizasyonu için bir foto-karşı dirençlidir. Fazlalığını ortadan kaldırmak için bir geliştirici içine silikon parçası daldırın fotoğrafın-direnmek. </li><li> Poli-dimetil-siloksan (PDMS) ihtiva eden bir çözelti oluşturmak için 1: kalıp imal edildikten sonra, 10 arasında bir oranda bir silikon bazlı elastomer ve bir sertleştirme ajanı karıştırılır. Gaz çıkışına bir vakum odasına PDMS çözeltisi koyun. Kalıp içine dökün ve 90 dakika mikrokanallar oluşturmak için, 60 ° C&#39;de ısıtın. Daha sonra 90 saniye boyunca oksijen plazma bağlaması kullanılarak cam bir slayta, bireysel kanallar bağ. NOT: PDMS gazını proses karıştırma işlemi yol açtığı hava kabarcıklarını yok etmek için yapılmıştır. </li><li> Mikrokanal boyutları başarılı test için izin emin olun. Bu protokol, mikrokanallar 120 x 60 mm, dikdörtgen bir enine kesite sahiptir. Buna karşılık, bir ortalama eritrosit 8 um bir çapa ve 2 um arasında bir kalınlığa sahiptir.refore, mikrokanal genişliği uygun toplanmasını gözlemlemek ve doğru bir hız profillerinin belirlenmesi için yeterlidir. </li></ol> 2. Kan hazırlanması <ol><li> Bir etik kurul onayından sonra, sağlıklı gönüllü vericilerden kan toplayın. Toplama tüpleri içinde mevcut etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile kan (kanın 4 ml 7.2 mg EDTA) tedavi edin. NOT: EDTA kan pıhtılaşma önlemek için kullanılır. </li><li> Kan bileşenleri ayırmak üzere 1,400 xg (3,000 rpm) kan örnekleri 10 dakika boyunca üç kez santrifüjleyin. Santrifüj sonucu olarak, üç farklı tabaka dikkate alınmalıdır. Not: üç kat (borunun alt kısmında bulunur) RBC tabaka (RBC tabakanın üstünde yer alan, beyaz kan hücreleri ve trombositler oluşan) ince beyaz tabaka ve plazma tabakası (diğer üst kısmında bulunan bileşenler). <ol><li> İlk Santrifüj işleminden sonra, kan bir pipet kullanarak kan plazması toplanır. Herhangi c kaçınınBuffy ceket ile ontact. </li><li> Toplayın ve% 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile bir kapta buffy coat atmayın. </li><li> Kalan RBC tabakası ile tüplerin her PBS pH 7.4 içinde 3 ml ilave edilir ve santrifüjün uygun bir dengenin sağlanması. Yavaşça 10 dakika boyunca 1.400 xg (3000 rpm) yine tüpleri ve santrifüj karıştırın. NOT: Onlar hücre yapışmasını değiştirebilir beri PBS solüsyonu herhangi Magnezyum veya Kalsiyum içermediğinden emin olun. </li><li> İkinci santrifüj sonrası tüplerde PBS atınız ve varsa kalan buffy coat çıkarın. Tekrarlayın üçüncü santrifüj temiz eritrositlerde elde etmek için 2.2.3 ve 2.2.4 numaralı adımları. </li></ol></li><li> Tekabül eden (% 5 RBC-süspansiyonlar elde etmek için% 10 ve% 15 1 ml bir tüp içinde plazma (0.95, 0.9 ve 0.85 mi) temiz eritrositlerde gerekli miktar (0.05, 0.1 ve 0.15 ml) karıştırın ) hematokrit. Bir mikrosantrifüj ile hematokrite edin. </li></ol> 3. Sıvılar Hazırlık <ol><li> Floresan izleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekleyin (% 1 katı, d parçacık = 0. 86 mikron, λ = 542 nm abs ve 1 ml RBC-Süspansiyon tüplere λ emisyon = 612 nm). NOT: (dahili polistiren tanecikleri boyalı) floresan izleyici parçacıkları mikrokanalın içinde akış hızını ölçmek için kullanılır. Lazer ışınının (λ = 542 nm), karşılık gelen dalga boyuna maruz kaldığında bu parçacıklar floresan. </li><li> PBS pH 7.4 çözeltisi hazırlayın ve PBS çözeltisi 1 ml aynı floresanlı işaretleyici partikülleri solüsyonu 60 ul ekle. </li></ol> 4. Agrega Boyut Ölçümleri <ol><li> Mikrokanalda sıvıları (RBC-süspansiyonlar ve PBS) eklemek için, 25 ul ve 100 ul iki cam şırınga kullanın. Bu iradeSistemin uygunluğu azaltmaya yardımcı olur. Tüp ve giriş delikleri montaj konnektörleri yoluyla şırınga mikrokanalı bağlayın. Sıvı haznesi ve şırınga arasında varolan basınç farkı kullanılarak cam şırıngalar doldurun. Hava kabarcığı sisteminde mevcut olduğundan emin olun. Alternatif bir yöntem olarak, mikrokanal hem de sıvı sürmek için bir basınç kontrol sistemi kullanır. </li><li> Yüksek hızlı kamera ve μPIV sistemine bağlı bir ters mikroskop sahnede mikrokanalı yerleştirin. Programı (PBS Q = 8 ul / saatlik bir akış hızı sokarken kan örneğin, Q = 2 ul / saat) arzu edilen akış oranları şırınga pompası. NOT: Sadece bir şırınga pompası kullanılır. Iki farklı iç çaplara sahip iki farklı cam şırınga kullanılarak, Y-mikrokanalın her dalı giren akış oranına değiştirmek mümkündür. </li><li> Gösterildiği gibi farklı bir giriş şubesi ve farklı akış oranlarında çift Y-mikrokanalda hem sıvıları her takın <strong&gt; Şekil 1. pompa debisini, farklı kesme oranları sınamak değiştirmek için. Bu (Şekil 2 ve 3) iki koldan 19 arasında (bu durumda 4) Aynı Uygun oranını korur. Ölçümleri almadan önce kararlı duruma ulaşması akış bekleyin: görsel pürüzsüz akışı için yüksek hızlı kamera görüntüleri inceleyin. NOT: oranı kan tabakası içinde doğrusal hız profili elde önemlidir. </li><li> Yüksek hızlı kamera kullanarak eritrositlerde gözünüzde canlandırın. Sıvı akışının görüntülerini kontrol, kayıt ve kaydetmek için bir bilgisayara bağlayın. İki sıvı akar kararlı duruma ulaştıktan sonra, kaydetmeye başlayın. <ol><li> Daha iyi sonuçlar için işlem birkaç görüntü elde edin. Agrega net görüntü için optimal bir kameranın açıklık süresi belirler. NOT: Bu durumda kamera pozlama süresi 0,5 milisaniye idi. Her çerçeve arasındaki zaman aralığının seçimi kamera çerçeve hızı ve t debisine dayanmaktadırO mikrokanal. Bu prosedürde işlenen her çerçeve arasındaki süre 60 msn idi. Bu nedenle, saniyede 18 kare kayıt yapabilen bir kamera yeterlidir. NOT: Hatalı ölçümlere yol açabilecek tüp ve şırınga, kan oturmasını kaçının. </li></ol></li><li> Görüntü işleme teknikleri (bu durumda MATLAB programı) kullanılarak aşağıdaki gibi (Şekil 4&#39;te gösterilen) piksel yoğunlukları göre görüntülerin her agregatlar saptandı, görüntü kalitesini iyileştirmek için: <ol><li> Görüntüleri her kare için daha iyi bir görüntü kalitesi elde etmek histogram ekolayzır yöntemini kullanarak kontrast geliştirin. </li><li> Ikili görüntülere gri tonlama görüntüleri dönüştürün. Bu amaç için, her bir piksel dönüşümünü belirler 0-1 arasında değişen bir eşik değerini, ayarlayın. Eşik daha büyük değerlere sahip pikseller beyaz piksel olarak tespit edilecek süre eşik değerin altında görüntüdeki herhangi bir piksel, siyah bir piksel olarak algılanacaktır. </li><li> DoldurmakDaha iyi sonuçlar için, bir bütün içinde boşluklara tekabül eden delikler (bulunan ve gerekirse). </li><li> Komşu hücreler agregatlar halinde ilişkili olan, böylece ikili görüntüdeki komşu beyaz pikseller belirleyerek hücreleri algılar. </li><li> Algılandı farklı agrega Etiket ve daha iyi görüntülenmesi için bir kırmızı-yeşil-mavi (RGB) görüntü içine ikili görüntü dönüştürmek. Görüntü işleme tekniğinin etkinliğini doğrulamak ve Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi tüm hücreleri dikkate alınmasını sağlamak için gelen işlenmiş görüntülerin her orijinal kare birleştirin. Gerçekleştirin adımlar 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 Yakalanan tüm çerçeveler için, 4.5.4 ve 4.5.5. </li><li> Tespit edilen piksel sayısına göre çerçeve içinde algılanan her bir agreganın alanını hesaplar. Kullanılan mercek büyütme dayanarak, bir kalibrasyon retiküle kullanarak, dönüşüm faktörünü hesaplamak ve um 2 sonuçları dönüştürmek. Her bir tespit agrega boyutları ortalamaÇerçeve ve sonra RBC-süspansiyonlar her kayıt için ortalama agrega boyutu elde etmek için tüm karelerin sonuçları ortalama. </li><li> Algılanan her agreganın içinde eritrosit temsilcisi tahmini sayısını belirlemek için tek RBC alanını hesaplayın. Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, bu sonuçlar kullanılarak, (her bir agrega hücre tahmini sayısı ile temsil edilen) toplu boyutlarda bir fonksiyonu olarak her agreganın olan eritrosit yüzdesi dağılımını hesaplar. NOT: RBC agrega ölçmek için, ImageJ yazılımı her karede aynı görevleri gerçekleştirmek için (yerine MATLAB) kullanılabilir. </li></ol></li></ol> 5. Sıvı Hız ve Kayma Hızı Ölçümleri Akışkan hızı ve μPIV sistemini kullanarak dolayısıyla kayma oranını belirlemek. <ol><li> Veri, yüksek hızlı kamera kullanılarak elde edilir sonra, μPIV sistemi için kullanılan çift darbeli kameraya geçin. Görüntü ac için bir görüntüleme yazılımı kullanınhız alanı belirlenmesi için akış ve görüntü işleme edinirken. </li><li> Lazer açmadan önce, lazer sınıfına bağlı olarak, tüm önlemler gerekli atın. Sonra sistemde, kamera ve lazer açın. </li><li> Kullanılan mercek büyütme dayalı kamerayı ayarlayın. Bu amaçla, bir mikroskop altında 10 um hassas bir bir Mikro kullanımı ve görüntüde 1 piksel boyutunu ayarlamak. </li><li> Lazer başlatın ve her iki sıvılarında parçacıkları görselleştirmek. Akımında hızlı parçacıkların odaklanarak mikrokanalın orta düzlemi bul (yani, en hızlı parçacıklar parlak olmalıdır). </li><li> Parçacığın düzgün deplasman sağlamak için dt (iki ardışık kareler arasındaki zaman aralığı) ayarlayın. En hızlı parçacıklar her iki görüntü arasında yaklaşık 5 ila 10 piksel taşımak gerekir. </li><li> Akış kaydetmeye başlayın. Görüntülerin 100 çift, ayrı 5 milisaniye kazanmak için yazılımı ayarlayın. Tüm dif için adımları 5.4, 5.5 ve 5.6 gerçekleştirinferent RBC-süspansiyonlar ve farklı kayma oranları için. NOT: metodoloji Daha fazla bilgi Pitts ve Fenech 20 çalışmasında verilmiştir. </li><li> Görüntüleme yazılımı ile çapraz korelasyon yöntemi kullanılarak elde edilen kayıtları işleyin. NOT: Bu önceden belirlenen büyüklükteki küçük pencereler halinde görüntülerin çifti kesikli oluşur denilen korelasyon pencere ve her pencerede partiküllerin deplasman aşağıdaki gibidir (sıvı akışı ve kullanıcı tarafından seçilen zaman aralığına göre). <ol><li> Edinilen görüntüler daha iyi veri işleme (arka plan çıkarma, &quot;baz kırpma&quot; 21 veya görüntü 22,23 örtüşen dahil) ön işleme ihtiyaç Öncelikle belirlemek. </li><li> Daha sonra korelasyon pencere boyutu ve şekli, hem de bir üst üste binen görüntülerin yüzdesi seçin. Detaylı bir çalışma Pitts ve arkadaşları tarafından yapıldı. 24 kan için optimum parametreleri ve görüntü ön işleme teknikleri belirlemek içinfarklı kanal yapılandırmalarında akış. 100 görüntü çiftleri ve hızının Root Mean Square (RMS) hata hesaplanan ortalama hız alanı olarak sonuçları ifade eder. </li></ol></li><li> Şekil 7 &#39;de gösterildiği gibi. Işlenmiş verileri kanal çıkışındaki bir hız profilini ekstrakte daha iyi bir profil için, boşluk hız alanı ortalama. NOT: hız profili oluşturan çubuklar kanal genişliği göre seçilen korelasyon pencere boyutuna karşılık gelmektedir. Hız RMS hata, deney hızı tahmini hata temsil Şekil 7&#39;de gösterilmektedir. </li><li> Tüm ölçümleri ve işleme yapılmaktadır kez lazer kapatın ,. Yazılım, kameralar, hareketli sahne, bilgisayar ve lazer: Tüm sistemin bileşenlerini kapatın. </li><li> Kayma oranını hesaplamak için, ilk olarak algılamak ve yüksek hızlı kamera kayıt dayalı mikrokanaldaki kan kalınlığını tahmin ediyoruz. Bu amaçla, tüm ortalamaBelirli kayıt çerçeveler videonun bir arka plan görüntüsü elde etmek. (% 5,% 10 ve% 15 hematokrit asılı olduğunda 10 ul / sa oranında akan bir RBC-süspansiyonlar için, Şekil 8&#39;de gösterildiği gibi), kan tabakası sınırlandırmak. İlgili kan tabaka kalınlığı için hız değerini elde ve kan tabaka kalınlığı ile hız değeri bölerek kesme oranını hesaplamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Perkkio, J., Keskinen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematocrit+reduction+in+bifurcations+due+to+plasma+skimming.">Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming.</a> Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).</li><li>Chien, S., Jan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+basis+of+the+mechanism+of+rouleaux+formation.">Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation.</a> Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).</li><li>Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion-mediated+red+blood+cell+aggregation+in+polymer+solutions.">Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions.</a> Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).</li><li>Schmid-Sch&#246;nbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+shear+rate+dependence+of+red+cell+aggregation+in+vitro.">On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro.</a> J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).</li><li>Pries, A. R., Secomb, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+the+microcirculation.">Rheology of the microcirculation.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).</li><li>Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Red Blood Cell Aggregation. , (2011).</li><li>Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemorheological+disorders+in+diabetes+mellitus.">Hemorheological disorders in diabetes mellitus.</a> J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).</li><li>Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).</li><li>Lindqvist, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+viscosity+of+the+blood+in+narrow+capillary+tubes.">The viscosity of the blood in narrow capillary tubes.</a> Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).</li><li>Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F&#229;hraeus:+Evolution+of+his+concepts+in+cardiovascular+physiology.">F&#229;hraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology.</a> Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).</li><li>F&#229;hraeus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+suspension+stability+of+the+blood.">The suspension stability of the blood.</a> Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).</li><li>Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+specific+red+blood+cell+aggregation+indices+via+an+automated+system.">Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system.</a> Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).</li><li>Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+laser-assisted+optical+rotational+cell+analyzer+(lorca)+as+red+blood+cell+aggregometer.">The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer.</a> Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).</li><li>Rampling, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+cell+aggregation+and+yield+stress.">Red cell aggregation and yield stress.</a> Clinical Blood Rheology. , (1988).</li><li>Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+human+erythrocyte+velocity+field+and+aggregation+measurements+at+physiological+haematocrit+levels.">Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels.</a> J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).</li><li>Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity:+modelling+using+shear+fields+measured+by+a+&#181;PIV+based+technique.">Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a &#181;PIV based technique.</a> Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).</li><li>Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+variation+of+blood+viscosity+and+velocity+distributions+of+aggregating+and+non-aggregating+blood+in+a+bifurcating+microchannel.">Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel.</a> Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).</li><li>Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+red+blood+cell+aggregability+in+a+flow+chamber+by+computerized+image+analysis.">Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis.</a> Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).</li><li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography.">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).</li><li>Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+a+microfluidic+system+for+red+blood+cell+aggregation+investigation.">Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation.</a> J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).</li><li>Pitts, K. L., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+for+velocity+profile+measurements+of+micro+blood+flows.">Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows.</a> J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).</li><li>Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro+particle-image+velocimetry+of+bead+suspensions+and+blood+flows.">Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows.</a> Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).</li><li>Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+algorithms+for+microscale+particle+image+velocimetry.">Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry.</a> AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).</li><li>Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+measurement+accuracy+in+micro+PIV+by+image+overlapping.">Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping.</a> Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).</li><li>Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-particle+image+velocimetry+measurement+of+blood+flow:+validation+and+analysis+of+data+pre-processing+and+processing+methods.">Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods.</a> Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).</li><li>Bhamare, M. G., Patil, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic+blood+cell+analysis+by+using+digital+image+processing:+a+preliminary+study.">Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study.</a> Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).</li><li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cells+classification+using+image+processing.">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Mevcut metodoloji kullanarak, niteliksel analiz etmek mümkündür ve kantitatif RBC farklı akış koşulları ve hematokrit altında toplanır. Başarılı test ve agrega tespiti için, mikro girişinde iki akışkanlar arasında uygun hız oranını belirlemek için çok önemlidir. Bu oran, hız profili 19 yarı lineer bir optimal kan tabaka kalınlığının elde edilmesi için çok önemlidir. Başarılı test için bir başka önemli faktör iyi bir görüntü kalitesi. Yöntem görüntü işleme dayanmaktadır beri Aslında, bu görüntü arka (kanal içinde sıvı) ve tespit edilecek parçacıklar arasında bir kontrast olması çok önemlidir. Şekiller 2 ve 3&#39;te gösterildiği gibi, burada, tanecikler, toplam saptanmasında yardımcı olur arka plan, daha koyu görünmektedir. görüntü işleme tekniği için dikkat edilmesi gereken en önemli parametre threshold değer. Bu nedenle, tersine göre, Şekil 5&#39;te gösterildiği gibi, tüm gruplar, dikkate alınacak uygun eşik değerini seçmek için çok önemlidir elde edilmiştir. Bu çalışma için kullanılan mevcut olan görüntü ayrıştırması, yaygın olarak, hücre tespiti ve sayımı için kullanılan İstediğiniz ve küresel eşik değeri uygun değil gibi görüntü kalitesi değilse 25- 27., böyle bir Otsu yöntemi 28 veya uyarlanabilir bir eşik yöntemine (görüntü kesikli ve optimal eşik değerini belirlemek için farklı bir algoritma kullanabilirsiniz ) her discretized pencere için yerel bir eşik elde edilir. Dikkate alınması gereken bir diğer faktör um piksel uygun bir dönüşüm için ölçek faktörüdür. Uygun dönüşüm faktörü kullanılarak, tek çap ve agrega boyutu dağılımını belirlemek için görev yapacak biri RBC kalınlığını belirleyebilirsiniz (tahmini numbe dayalıHer toplu eritrosit r). Agrega yönüne bağlı olarak, düzgün biri RBC (frontal ya da yan görünüm) bölgeyi hesaplar. Bölüm 4 (adım 4.4.1) &#39;de belirtildiği gibi, agrega dinamik özellikleri her ardışık çerçeve arasında yakalanır sağlamak için uygun kamera pozlama süresini ve kare hızını belirlemek için önemlidir. Bu değer ölçümleri satın alırken kullanılan akış hızına dayanmaktadır. Çeşitli diğer faktörler μPIV sistemi kullanılarak sonuçlar elde dikkate alınması gerekmektedir ve Pitts ve Fenech 20 çalışmada açık bir şekilde ele alınmaktadır. metodoloji farklı hematokrit akan birkaç RBC-süspansiyonlar başarıyla test edildi. Ancak, görüntü işleme tekniği ve görüntü arka planı ve agrega arasındaki kontrast eksikliği sınırlaması nedeniyle, RBC (% 20 den% 45) daha yüksek hematokrit agregatlar tespit etmek zordur. Nitekim olarak bahsedilmektedirDaha önce, görüntü kalitesi bu metodolojinin için çok önemlidir. Bu protokol kullanılarak, RBC agrega boyutları kontrollü mikroakışkan cihaz ölçülebilir ve bu nedenle fizyolojik kesme oranlarında bir dizi için eritrosit yığın ebatları mikrosirkülasyonda dinamik rbc toplanması ile ilgili bilgi elde etmek ve elde etmek mümkündür. Kan reolojisinin sayısal ve deneysel çalışmaları tamamlayıcı ve klinik ve patolojik çalışmalar agrega boyutları ve davranışlarını ilişkilendirmek mümkündür.

An erratum was issue for <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kanın reolojik davranışlarını belirleyen çok önemli bir rol oynamaktadır. Neredeyse tek başına, in vitro ve in vivo olarak kan belli özelliklere sorumludur. Fizyolojik koşullar altında, eritrositler kan hacminin% 40 45% işgal. Mikrosirkülasyondaki, eritrositler nedeniyle sadece küçük damar çapları ve etkisi 1 kaymağını plazmaya kan hacminin% 20 kadar işgal. Mikrosirkülasyon plazma azalma Bu olgu Fåhræus etkisi olarak bilinir. Düşük kesme hızlarında, RBC bu nedenle kan Newtonian olmayan davranışlar katkıda birlikte köprü ve &quot;Rouleaux&quot; ya da agregalar olarak adlandırılan tek boyutlu veya üç boyutlu yapıları oluşturmak mümkündür. Bununla birlikte, rbc toplanması mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. İki teori eritrosit agregasyonunu model vardır: Hücreler teorisinin köprüleme nedeniyle makromoleküllerin 2 çapraz bağlanması ve kuvvet attrac içintion teorisi nedeniyle osmotik gradyan 3 moleküllerin tükenmesi neden oldu. Tipik haliyle, insan kanı, agrega 1 ila 10 saniye -1 kadar çok düşük kesme oranlarında 4 de oluşturur. Bu aralığın üstünde, RBCs bölmekte ve damar içinde ayrı akış eğilimindedir. Agrega oluşum koşullarını anlamak kanın reolojik davranışını tanımlayan açısından Hemorheology alanına büyük önem taşımaktadır. Bu agregalar genellikle makrodolaşım düzeyde (&gt; 300 um çapında) 5 görülür. Bu ölçekte, kan, bir Newton tipi sıvı ve homojen bir karışım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu agregaların nadir kılcal seviyesi (çapı 4-10 um) görülür ve genellikle diyabet 6 ve obezite gibi patolojik durumların bir göstergesidir. Rbc toplanması enflamatuar veya enfeksiyon durumları içerir değiştirebilir diğer patolojik durumlar,hipertansiyon veya ateroskleroz, genetik bozukluklar ve kronik hastalıklar 7 kardiyovasküler hastalıklar. Bu nedenle, RBC toplama mekanizmasının anlaşılması ve (bu agrega ve akış koşullarının büyüklüğü arasında bir ilişki tanımlayarak) bu varlıkları analiz kanın microrheological davranışının anlaşılmasına yol açabilir ve dolayısıyla klinik uygulamalara bunu ilgilidir. RBC agregaları gibi hematokrit (kanda eritrositler hacmi), kayma hızı, damar çapı, RBC membran sertlik ve süspansiyon ortamı bileşim 8-10 gibi çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir. Bu nedenle, kontrollü şartlar etkin RBC agrega analiz etmek için gereklidir. Çeşitli yöntemler kan davranışları hakkında gerekli bilgileri sunuyor statik toplama ölçümleri (toplama indeksi) sağlayarak toplam oluşumunu analiz edebiliyoruz. Bu yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, eritrosit sedimantasyon hızı dahilyöntem 11 ışık geçirgenliği yöntemi 12, ışık yansıma yöntemi 13 ve düşük kayma viskozitesi yöntemi 14. Birkaç çalışma RBC toplanmasını çalışma ve kontrollü akış şartlarında 15-17 toplulaştırma derecesini belirlemek için çalışmışlardır. Ancak bu çalışmalar dolaylı olarak toplama derecesi yanı sıra yerel viskozite ilgili bilgi veren mikroskobik kan görüntülerde dayalı ölçülen kesme sisteminde işgal alanı oranını belirleyerek RBC toplam boyutlarını araştırmak. Bu nedenle doğrudan RBC kontrollü ve sürekli kayma oranlarının altında, dinamik, mikrosirkülasyonda agrega ölçmek için yeni bir prosedür mevcut. Bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi bu nedenle, kan tabakasında bir kesme akışı oluşturma, (Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi) RBC-süspansiyonlar iki Y mikrokanaldaki, sürüklenir. Bu kan içinde sabit Shea katmanr oranı elde edilebilir. RBC-süspansiyonlar farklı hematokrit (H) düzeyleri (% 5,% 10 ve% 15) ve farklı kesme hızlarında (2-11 sn -1) altında test edilmiştir. Kan hızı ve kesme hızı akışı yüksek hızlı kamera ile görüntülenmiştir ise mikro Parçacık Görüntü Akımları (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar daha sonra eritrositlerde tespit ve toplam boyutlarını belirlemek için görüntü şiddetleri göre MATLAB kodu ile işlenir.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 epoxy based negative Photo-resist</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 series Plasma system&amp;nbsp;</td><td>Plasma Etch</td><td>PE-50 series</td><td></td></tr><tr><td>Blood collection tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge, &lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>Poshpate buffered saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>Tracer fluorescent particles solution (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>Aggregometer</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>Glass syringes (50 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>Tubing (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>High speed camera (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>A camera capable of recording 18 frames per second could be used.</td></tr><tr><td>Double pulsed camera&amp;nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG laser</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. and Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 and PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis software</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

controlled microfluidic environment for dynamic investigation of red blood cell aggregation

Kan, bir Newtonian olmayan biyo-sıvı olarak, Hemorheology alanında birçok çalışmalar odağı temsil eder. Kan bileşenleri, kırmızı kan hücreleri, kan plazması içinde süspansiyon haline getirilmiş olan, beyaz kan hücreleri ve trombositler bulunmaktadır. Nedeniyle eritrosit bolluğu (kan hacminin% 40 ila 45%), onların davranışları, özellikle mikrosirkülasyondaki kanın reolojik davranışını belirler. Çok düşük kesme hızlarında, eritrositler monte görülmektedir ve form kişiler kan Newtonian olmayan davranışa neden olan agrega denir. Bu mikrosirkülasyondaki kan reolojisini kavrayabilme agrega oluşum koşullarını anlamak çok önemlidir. Burada açıklanan protokol görüntü işleme dayalı, sürekli kayma hızı altında kantitatif mikrosirkülasyonda RBC büyüklüklerinin belirlenmesi deneysel prosedür ayrıntıları. Bu amaçla, RBC-süspansiyonlar test edilmiş ve 120 x 60 mm poli-dimetil-siloksan (PDMS) mikrokanallar analiz. RBC-süspansiyonlar ent vardırKan katmanı içinde bir doğrusal hız profilini elde etmek ve böylelikle sabit bir kesme oranları geniş bir aralığını elde etmek için, ikinci bir sıvı ile yağmur. RBC agrega yüksek hızlı bir kamera kullanılarak görüntülendi sırasında kesme hızı, mikro görüntüleme ölçümleri (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenir. RBC agrega çekilen videoları görüntüleri şiddetleri dayalı toplam boyutlarını belirlemek amacıyla görüntü işleme teknikleri kullanılarak analiz edilmektedir.

Çift-Y-mikrokanal içinde iki sıvı akımının bir örneği,% 5,% 10 ve% 15 hematokrit ile süspanse edildi ve 10 ul / sa oranında akan bir insan eritrositlerde, Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. Şekil 3, toplam boyutları ne zaman farkı göstermektedir kanalda akış% 10 Hematokrit için 5 ul / saat için 10 ul / saat arasında azaltılır. Hematokrit ve kesme hızı değişen bu agrega boyutlarının niteliksel kavramını verir., Üst üste üç çerçeveler için, 5 dört insan RBC agrega yerinden takip Şekil kamera kare hızı gereklidir ve niteliksel kavramının niteliksel bir ölçü sağlayan Her çerçeve içinde dağılımını toplar. Orta agregalar, sırasıyla yeşil ve kırmızı ile gösterilmiştir ve büyük agregalar (30&#39;dan daha büyük eritrositlerde tahmini) (9-30 kadar eritrositlerde tahmin edilen) ise Şekil 5 (8 ya da daha az tahmini eritrositlerde) ile, küçük agregatlar, mavi ile gösterilmiştir. Şekil 7&#39;de gösterildi sırasıyla. Ayrıca, her RBC-süspansiyon için Şekil 7&#39;de gösterilen hız RMS hataları, hız ölçümlerinin hassasiyetini belirten hızı değerleri ile karşılaştırıldığında nispeten küçüktür ve bu nedenle düşük makaslama. arayüz yerleri &#39;E&#39; olarak gösterilir ve aynı şekilde düz çizgiler olarak gösterilmiştir. (hız profilleri ve kan tabaka kalınlığına göre) farklı bir RBC-süspansiyonlar için uygun kesme hızları, Tablo 1 &#39;de gösterilmiştir. RBC-süspansiyonların her biri için belirlenen ortalama agrega boyutları tespit etmek için bir görüntü işleme yöntemine göre RBC agregatların alanı, bir fonksiyonu olarak, Şekil 9&#39;da gösterilmektedirkarşılık gelen kesme oranı iyon. Her bir agrega olan eritrosit yüzdesi dağılımın bir örneği Şekil 6&#39;da gösterilmektedir. Agrega boyutları agregalardaki RBC tahmini sayısı olarak temsil edilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52719/52719fig1.jpg" /> 1. Çift Y-mikrokanal yapılandırma ve giriş sıvıları Şekil. PBS Q = 8 ul / hr ikinci şubesini girerken kan Q = 2 ul / saat ilk şubesini girer. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig2.jpg" /> Şekil 2. Farklı hematokrit İnsan RBC-süspansiyon. Figür Q = 10 ul / saat akan insan RBC-süspansiyon Yakalanan çerçeveleri temsil (A)% 5 (B)% 10 ve (C)% 15 hematokrit. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig3.jpg" /> Şekil 3. Farklı akış oranlarında İnsan RBC-süspansiyon. Şekil (A) Q = 10 ul / saat ve (B) Q = 5 ul / saat akan% 10 hematokrit H askıya insan eritrositlerde Yakalanan çerçeveleri temsil eder. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig3highres.jpg" target="_blank">tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig4.jpg" /> Agrega tespiti için kullanılan görüntü işleme programı Şekil 4. Akış çizelgesi. Kullanılan temel metodoloji tarif gösterilen adımlar. Görüntü kalitesi c olması geliştirilmiştir<html> bir ikili görüntü onverted. agregalar algılanır ve kendi boyutlarına göre işaretlenmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig4highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig5.jpg" /> Şekil 5. RGB renk ve birkaç insan RBC net hareketi üç ardışık çerçeveler için toplanır. Şekil dört (A) t = 0 ms, (B), t = 60 ms üç ardışık çerçeve tespit agrega ve net hareketini göstermektedir (C), t = 120 msn. Büyük agrega (&gt; 30 eritrositlerde tahmini), orta agrega (9-30 tahmini eritrositler) ve küçük agrega (&lt;8 eritrositlerde tahmini), kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla gösterilmiştir. Tespit edilen agrega her siyah bir daire ile işaretlenir.&quot;_blank&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig6.jpg" /> Farklı akış oranları için% 10 H RBC-süspansiyon Şekil 6. RBC toplam boyut dağılımı.% 10 H askıya kan örnekleri için Agrega boyut dağılımı, = 10 ve 5 ul / saat Q akan. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig6highres.jpg" target="_blank">büyük halini görmek için tıklayınız Bu rakamın.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig7.jpg" /> Farklı hematokrit Şekil 7. Hız profili karşılaştırması. Hız profilleri için% 5 H (Kırmızı),% 10 H (mavi),% 15 H (yeşil) ve simülasyon 19 (düz çizgi) asılı plazma içinde eritrositler için gösterilmiştir Q = 10 ul / saat ile 120 x 60 mm çift Y-mikrokanal. arayüz yeri için E ile gösterilirdeneyler. Farklı hız profillerinin gelen RMS hatalar görüntülenir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig7highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig8.jpg" /> Kan tabaka kalınlığının farklı RBC-süspansiyonlar ve sınırlandırılması için Şekil 8. Görüntü arka plan. Şekil 10 ul akan RBC-süspansiyonlar kan tabakası kalınlığı sınırlandırmasını gösterir / saat (A)% 5, (B askıya )% 10 ve (C)% 15, H. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig8highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 9," src="/files/ftp_upload/52719/52719fig9.jpg" /> Figu9 Yeniden. İlgili kesme oranları bir fonksiyonu olarak ortalama agrega boyutları. Sonuçlar% 5 (A),% 10 (B) ve% 15 H (C) Q = 10 ul / saat akan farklı RBC-süspansiyonlar için elde edilmiştir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52719/52719fig9highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Hematokrit </td><td> Akış oranı (ul / saat) </td><td> Kayma hızı (sn -1) </td></tr><tr><td> % 5 </td><td> 10 </td><td> 11.02 </td></tr><tr><td> % 5 </td><td> 5 </td><td> 5.36 </td></tr><tr><td> % 10 </td><td> 10 </td><td> 8.17 </td></tr><tr><td> % 10 </td><td> 5 </td><td> 4.47 </td></tr><tr><td> % 15 </td><td> 10 </td><td> 7.41 </td></tr><tr><td> % 15 </td><td> 5 </td><td> 2.51 </td></tr></tbody></table> Farklı kan akımı durumlar için Tablo 1. Kayma hızı değerleri. Kayma hızı değerleri Q = 10 ul / saat akan,% 5,% 10 ve% 15 H ile farklı RBC-süspansiyonlar için μPIV veri ve görüntü işleme sonuçları kullanılarak elde edilir ve Q = 5 ul / saat.

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation at JoVE.com

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu.

Kırmızı Kan Hücresi Toplama Dinamik Soruşturma Kontrollü mikroakışkan Çevre

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

controlled-microfluidic-environment-for-dynamic-investigation-red

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.7K Görüntüleme.  University of Ottawa.  protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu. 

Video: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Biyomühendislik

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to give an accurate velocity profile. A protocol is presented for &mu;PIV measurements of blood flows in microchannels. At the scale of the microcirculation, blood cannot be considered a homogeneous fluid, as it is a suspension of flexible particles suspended in plasma, a Newtonian fluid. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate can be derived from these measurements. Several key parameters such as focal depth, particle concentration, and system compliance, are presented in order to ensure accurate, useful data along with examples and representative results for various hematocrits and flow conditions.

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows which are cross-correlated to give an accurate velocity profile. Shear rate, maximum velocity, velocity profile shape, and flow rate, each of which has clinical applications, can be derived from these measurements.

Mikro Kan akış hızı Profil ölçümleri için mikro-parçacık imaj velosimetri

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher neutrophil counts in the blood are usually an indicator of ongoing infections, while low neutrophil counts are a warning sign for higher risks for infections. To accomplish their functions, neutrophils also have to be able to move effectively from the blood where they spend most of their life, into tissues, where infections occur. Consequently, any defects in the ability of neutrophils to migrate can increase the risks for infections, even when neutrophils are present in appropriate numbers in the blood. However, measuring neutrophil migration ability in the clinic is a challenging task, which is time consuming, requires large volume of blood, and expert knowledge. To address these limitations, we designed a robust microfluidic assays for neutrophil migration, which requires a single droplet of unprocessed blood, circumvents the need for neutrophil separation, and is easy to quantify on a simple microscope. In this assay, neutrophils migrate directly from the blood droplet, through small channels, towards the source of chemoattractant. To prevent the granular flow of red blood cells through the same channels, we implemented mechanical filters with right angle turns that selectively block the advance of red blood cells. We validated the assay by comparing neutrophil migration from blood droplets collected from finger prick and venous blood. We also compared these whole blood (WB) sources with neutrophil migration from samples of purified neutrophils and found consistent speed and directionality between the three sources. This microfluidic platform will enable the study of human neutrophil migration in the clinic and the research setting to help advance our understanding of neutrophil functions in health and disease.

This protocol details an assay designed to measure human neutrophil chemotaxis from one droplet of whole blood with robust reproducibility. This approach circumvents the need for neutrophil separation and requires only a few minutes of assay preparation time. The microfluidic chip enables the repeated measure of neutrophil chemotaxis over time in infants or small mammals, where sample volume is limited.

İşlenmemiş kandan Nötrofil Kemotaksis Ölçüm mikroakışkan Platformu

Neutrophils play an essential role in protection against infections and their numbers in the blood are frequently measured in the clinic. Higher ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Biyoloji

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the concentration of specific chemoeffectors by comparing the current concentration to the concentration detected a few seconds earlier. This comparison determines the net direction of movement. Although multiple, competing gradients often coexist in nature, conventional approaches for investigating bacterial chemotaxis are suboptimal for quantifying migration in response to concentration gradients of attractants and repellents. Here, we describe the development of a microfluidic chemotaxis model for presenting precise and stable concentration gradients of chemoeffectors to bacteria and quantitatively investigating their response to the applied gradient. The device is versatile in that concentration gradients of any desired absolute concentration and gradient strength can be easily generated by diffusive mixing. The device is demonstrated using the response of Escherichia coli RP437 to gradients of amino acids and nickel ions.

This protocol describes the development of a microfluidic device for investigating bacterial chemotaxis in stable concentration gradients of chemoeffectors.

Kararlı Konsantrasyon Degradeler Bakteriyel Kemotaksis miktarının mikroakışkan Aygıt

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical gradient, known as chemotaxis, plays an important role in development, the immune response, wound healing, and cancer metastasis. While chemotaxis modulates the migration of single cells as well as collections of cells in vivo, in vitro research focuses on single-cell chemotaxis, partly due to the lack of the proper experimental tools. To fill that gap, described here is a unique experimental system that combines microfluidics and micropatterning to demonstrate the effects of chemical gradients on collective cell migration. Furthermore, traction microscopy and monolayer stress microscopy are incorporated into the system to characterize changes in cellular force on the substrate as well as between neighboring cells. As proof-of-concept, the migration of micropatterned circular islands of Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells is tested under a gradient of hepatocyte growth factor (HGF), a known scattering factor. It is found that cells located near the higher concentration of HGF migrate faster than those on the opposite side within a cell island. Within the same island, cellular traction is similar on both sides, but intercellular stress is much lower on the side of higher HGF concentration. This novel experimental system can provide new opportunities to studying the mechanics of chemotactic migration by cellular collectives.

Collective cell migration in development, wound healing, and cancer metastasis is often guided by the gradients of growth factors or signaling molecules. Described here is an experimental system combining traction microscopy with a microfluidic system and a demonstration of how to quantify the mechanics of collective migration under biochemical gradient.

Kemotaktik Kolektif Göç için Mikroakışkanlarla Entegre Çekiş Mikroskobu

Cells change migration patterns in response to chemical stimuli, including the gradients of the stimuli. Cellular migration in the direction of a chemical ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Floresan Mikropipet Aspirasyonu Kullanan Tek Hücreli Mekanobiyoloji

Fluorescence Micropipette Aspiration Assay to Investigate Red Blood Cell Mechanosensing

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to mechanical stress. This paper details an innovative adaptation of the fluorescence-coupled micropipette aspiration (fMPA) assay. The fMPA assay introduces the capability to administer precise mechanical forces while concurrently monitoring the live-cell mechanotransduction processes mediated by ion channels. The sophisticated setup incorporates a precision-engineered borosilicate glass micropipette connected to a finely regulated water reservoir and pneumatic aspiration system, facilitating controlled pressure application with increments as refined as &#177; 1 mmHg. A significant enhancement is the integration of epi-fluorescence imaging, allowing for the simultaneous observation and quantification of cell morphological changes and intracellular calcium fluxes during aspiration. The fMPA assay, through its synergistic combination of epi-fluorescence imaging with micropipette aspiration, sets a new standard for the study of cell mechanosensing within mechanically challenging environments. This multifaceted approach is adaptable to various experimental setups, providing critical insights into the single-cell mechanosensing mechanisms.

Yazar Spotlight: Floresan Mikroaspirasyon Yoluyla Canlı Hücre Mekanobiyolojisini Geliştirme

The exploration of cellular behavior under mechanical stress is pivotal for advances in cellular mechanics and mechanobiology. We introduce the Fluorescence Micropipette Aspiration (fMPA) technique, a novel method combining controlled mechanical stimulation with comprehensive analysis of intracellular signaling in single cells. This technique investigates new in-depth studies of live-cell mechanobiology.

Kırmızı Kan Hücresi Mekanosalgılamasını Araştırmak için Floresan Mikropipet Aspirasyon Testi

Micropipette aspiration assays have long been a cornerstone for the investigation of live-cell mechanics, offering insights into cellular responses to ...