Name: isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2015-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Yazarlar Baker Vakfı ve Zerina Lokmic desteğiyle Kraliyet Çocuk Vakfı &#39;Bilim Kardeşlik Kadınları&#39; kabul etmek istiyorum. Andrew G. Elefanty ve Edouard G. Stanley NHMRC Kıdemli Araştırma Fellows vardır. Onların laboratuarlarında çalışmak NHMRC ve Kök Hücre Avustralya tarafından desteklenmiştir.

Etik bildirimi: lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların toplanması için etik onay Kraliyet Çocuk Hastanesi, Melbourne, Avustralya İnsan Araştırmaları Etik Kurullarının alındı. İmzalı rıza ameliyat öncesinde hastanın ebeveynleri alındı. Doku örnekleri seçmeli sünnet geçiren klinik yönetiminin bir parçası olarak cerrahi girişim geçiren İcracı ve hastaların tanısı olan hastalarda toplandı. Tüm deneyler Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya esaslara uygun olarak yapıldı. Sünnet derisinin ve Lenfatik Malformasyon Dokular Hücre Süspansiyon 1. Hazırlık <ol><li> Tamponlar ve Medya hazırlanması. <ol><li> EGM-2 medya ısınma ve yavaşça 37 ° C su banyosunda kit bileşenlerini çözülme piyasada mevcut EGM-2 MV Bullet Kit kullanarak tam endotel hücre ortamı hazırlayın. Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, aseptikEGM-2 medya her bileşeni ekleyin. Tüm bileşenler ortama ilave edilir, &#39;tam endotel hücre medya&#39; olarak medyaya bakın. Kullanımdan önce muhtevanın karıştırılması için steril 50 ml pipet kullanın. Not: hücre kültüründe ilgili tüm adımlar bir sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilir. Bütün çözeltiler, üreticinin talimatlarına uygun olarak 4 ° C&#39;de muhafaza edilir ve kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar ısıtılır. Tam endotel hücre ortamı, hücre kültürü tampon ve enzim çözeltiler kullanımdan önce 20 dakika boyunca 37 ° C&#39;de ısıtılır. </li><li> 50 ng / ml VEGF-C ile birlikte endotel hücre ortamı Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C &#39;de 50 ml steril tüp ve deposuna ilave endotelyal hücre ortamı kısım. 4 ° C&#39;de depolanan ortam, en az 4 hafta süreyle stabildir. </li><li> 8,752 g NaCl, 1.416 gr Na 2 HPO çözülmesiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) Hazırlama 4 .2H 2 O veSu 1000 ml 0.395 gr KH 2 PO 4. 7.4&#39;e pH ayarlayın. Filtre 4 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak PBS sterilize edin. (: 100 1 kullanılan) antibiyotik / antimikotik solüsyon ilave Kullanımdan önce. </li><li> Insan fibronektin hazırlanması steril su, 10 ml fibronektin, 1 mg eritin. Mağaza -20 ° C&#39;de 100 ul hacimde çözüm yeniden. Kullanım gün fibronektin kısım 100 ul steril PBS 10 ml üzerinde (10 ug / ml&#39;lik bir son çalışma konsantrasyonu vermek üzere). </li><li> Enzim ortam için, steril PBS içinde% 0.04 Dispase II,% 0.25 kollajenaz II ve 0.01% DNase I içeren bir solüsyon hazırlanır. İlk olarak, steril bir 50 ml tüp içinde dispaz ve kolajenaz, yer ağırlığı PBS gerekli hacmi ilave edin ve eritmek için, 37 ° C&#39;de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir kez biyogüvenlik kaput filtre sterilize (0.22 mikron filtre) dispase / kollajenaz çözümü, çözünmüş. Aseptik olarak 37 ° C &#39;de, DNase I depola kadar enzimatik çözeltisini ekleyinkullanın. NOT: DNase I steril iyofilleştirilmiş toz halinde temin edilebilen bir ticari bir hücre kültürü dereceli reaktifidir. </li></ol></li></ol> Üstderi ve Lenfatik malformasyonlarından hücre süspansiyonu 2. Hazırlık <ol><li> DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik çözelti 10 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp tartılır. Bu tüp, doku toplanması için kullanılır. </li><li> Lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların cerrahi olarak çıkarılması ardından, aseptik hücre kültürü laboratuvarında buz üzerinde tüp ve transfer doku örneği ekleyin. </li><li> Doku içeren tüp tartılır ve doku ağırlığı hesaplayın. Doku sindirmek için gerekli enzimatik solüsyon hacmini hesaplamak için bu ağırlık kullanın. </li><li> Sınıf II biyogüvenlik kabini, 100 mm doku kültürü kabına doku ve medya aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ince ~ 1 mm 3 parçaya doku kıyma steril makas kullanın. </li><li> Aktarım kıyılmış doku medya i ile karıştırılırSteril, DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik solüsyon ek bir 10 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüp nGoogle&#39;a. Doku yeniden askıya tersine çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de örnek santrifüjleyin. </li><li> Süpernatantı. Doku ağırlığı üzerine dayalı olarak, önceden ısıtılmış (37 ° C), kolajenaz II kıyılmış 100 mg doku başına düşen / DNase I / II sindirimi Dispase çözeltisi 1 ml. Genel olarak, kıyılmış dokusunun yaklaşık 1 g enzim çözeltisinin 10 ml kullanımı. </li><li> Sabit 200 rpm&#39;de çalkalayarak 20-90 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde doku inkübe edin. Bu sürenin sonunda, neredeyse tüm doku ince parçalara sindirilir emin olun. Not: birincil dokular etkiler, hücre hayatta kalması ile ilgili izolasyon zamanda kolajenaz ve dispase hücrelerin maruz kalma. Biz fibrotik lenfatik malformasyon örnekleri sindirim 60-90 dk gerektirebilir oysa çoğu yenidoğan sünnet derisi örnekleri optimal sindirim 20-30 dk gerektiren deneysel bulduk. LM LEC verims Mevcut fibrozis miktarı etkilenir, daha fibröz doku muhtemelen kolajenaz II ve dispase II uzun süre maruz kalmanın zararlı etkilerine daha az hücre elde edilmiştir. </li><li> Sindirme işlemini takiben, biyo-güvenlik kabinine tüp transferi ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş, bir 70 mikron süzgecinden Sindirilmiş doku çözeltisi geçmektedir. Hücre dışı matriks sadece küçük izleri gözlenmektedir kadar lastik piston ile 3 ml şırınga pistonu kullanarak, kalan doku eziyet. </li><li> Elekten geçirilmesi ve enzimleri inaktive yapışmış hücreler geri enzim orta ayrışan hacmine endotel hücre ortamı eşdeğer bir hacmi ile hücre süzgecinden yıkayın. Örneğin, kıyılmış doku sindirmek için enzim orta ayrışan 2 ml için, enzimleri inaktive endotel hücre orta 2 ml ekleyin. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücre çözümü Santrifüj ve süpernatant aspire. R&gt; 10 ml PBS hücreler, e-askıya. 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri5 dakika boyunca, daha sonra iki kez hücre yıkama tekrarlayın süpernatant kaldırmak. &gt; Endotel hücre ortamının 20 ml hücre pelletini. Tripan mavisi daha sonra, tohum ile hücre sayımı, 2 x 10&gt; 150 cm 6 hücre&gt; 2 şişeye endotel hücre ortamının 20 ml lik bir nihai hacim içinde, fibronektin ile önceden kaplanmış. Nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde% 5 CO&gt; 2 37 ° C &#39;de kültür.&gt; Not: Bu, tripan mavisi eksklüzyonu ile tahmin edildiği üzere çekirdekli hücrelerin% 75 -90% Doku sindirimi hayatta beklenmektedir. Başlangıç ​​hücre sayısı, hücre süspansiyonu içinde tüm çekirdekli hücreleri (yani keratinositler, lökositlerin, makrofajların, bağ dokusu hücreleri ve kan daman hücrelerinin) yansıtır. 5-7 gün hücre sayımı, ekli atlattı ve hücre kültürü sırasında çoğaldı hücreleri yansıtır. Fibronektin ile doku kültürü şişeleri Kaplama ayrıca müteakip LEC ve LM LEC sağkalım geliştirir. </li><li> Gece boyunca inkübasyondan sonra, P ile üç yıkamadan uzak bağlanmamış hücreleri yıkamakBS /% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve taze endotel hücre ortamı ilave edin. Etkin bir şişede bulunan bağlanmamış hücreleri ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için üç yıkar yürütmek. Her ikinci gün medya değiştirin. Hücreler 5-7 gün sonra ~% 80 konfluent olacaktır. </li></ol> Akım Sitometrisi için Lenfatik Endotel Hücre Yüzey markerleri Hücreleri 3. Antikor Boyama <ol><li> Hücreler PBS ile% 80 izdiham, aspire orta ve durulama hücrelerini ulaşmıştır sonra. </li><li> Örneğin 150 cm, 37 ° C&#39;de 5-7 dakika boyunca 2 şişesi başına Accutase hücre ayrılma çözeltisi 7 ml ile inkübe edilmesi ile yapışmayan hücreler ayırın. </li><li> Hasat Ayrılan hücreler, endotelyal hücre ortamının 3 hacim ilave edilerek hücre kopması çözeltisi inaktive ve yeni bir steril tüpe hücre süspansiyonu aktarın. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de hücreleri santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant aspire ve PBS 5 ml hücreleri yeniden askıya. 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri, s kaldırmakupernatant daha sonra hücre yıkama tekrarlayın. PBS 5 ml hücrelerin yeniden askıya. </li><li> Canlı hücre sayısını. % 0.4 tripan mavisi 90 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. Bu süspansiyonun Transferi 10 ul sayım için hemasitometre. NOT: Nihai hücre verimi işlenmiş örneklem büyüklüğü bağlıdır. canlı hücreler 7 x 10 5-1,2 x 10 6 150 cm2 şişeye aralıkları her zamanki hücre verimi. </li><li> Hücre boyama antikor çözeltileri hazırlanır. Not: Aşağıdaki seyreltmeler 100 ul&#39;lik bir boyama hacminde 1 x 10 6 lekeleme için titre edildi. <ol><li> Seyreltik PE konjuge fare anti insan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 konjüge fare anti insan konjuge CD34 (1: 200); APC-konjuge fare anti-insan CD31 (1: 100) ve Alexa 488-konjüge sıçan anti insan podoplanin (1: 200), 100 ul, doku numune başına steril% 5 FBS / PBS solüsyonu, toplam hacim içinde. Hazırlanması aşağıdakıAntikor çözeltisi, kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Aynı şekilde kapılar akış sitometrisi ayarını kolaylaştıracak seyreltilmiş izotip kontrol antikor karışımı hazırlandı. </li></ol></li><li> Antikorların bağlanma, spesifik olmayan azaltmak için, santrifüj hücreler 2 dakika boyunca 300 x g&#39;de, yüzer madde daha sonra steril bir% 5 FBS / numune başına PBS çözeltisi lekeli 100 ul hücrelerin süspansiyonu çıkarın. 4 ° C&#39;de 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de Santrifüj hücreleri, konjuge antikor kokteyli hücreleri askıya sonra yeniden süpernatant kaldırmak. Ayrıca 100 ul izotip kontrol antikor karışımı hücreleri (1 x 10 5) daha küçük bir kısım leke. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri. </li><li> , Bağlanmamış antikor kaldırmak 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de FBS / PBS çözüme ve Santrifüj hücreleri% 2 2 ml ekleyin. Süpernatantı aspire ve yıkama tekrarlayın. </li><li> Izotip kontrolü ve antikor lekeli örnek hücre pelletini / ml propidyum io 0.5 mg 300 ul sıralanacakdide /% 2 FBS / PBS solüsyonu. Sıralama kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin. </li></ol> 4. Hücre Ayırma <ol><li> Cihazı kurmak için aşağıdaki malzemeleri kullanın; örneğin Accudrop flüoresan boncuklar gibi ticari olarak temin edilebilen, floresan parçacıkların, fosfat-tamponlu tuzlu su bazlı kılıf sıvısı ve bırakma geciktirme boncuklar gibi hizalama boncuklar. </li><li> Çok parametreli floresans ile aktive edilen hücre tasnif cihazı üzerinde saflaştırılmış insan LECS izole edin. Cihazı Kurma ve üreticinin önerilerine göre hizalayın. Buna ek olarak, tazminat matris oluşturmak için her tür tek leke tazminat kontrolleri çalıştırmak ve böylece bu tür PE-Cy kanal içine PE olarak fluorochromes emisyon yoluyla önemli kanama ortadan kaldırmak için. NOT: 100 mikron nozul kullanılır ve hücreler endotel hücre ortama sıralanır eğer hücreler sıralanmış FACS daha yüksek bir oranda izolasyon hayatta. </li></ol> 5. Hücre Kültürü Mesaj FACS sıralaing <ol><li> 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de sıralama, santrifüj hücreleri ardından. Süpernatantı aspire ve (hücrenin tohum için kullanılan balonun bağlı olarak) medya 5-10 ml hücreleri tekrar süspansiyon. En az 50.000 hücre kriteri ise, hücreler fibronektin kaplı 25 cm2 şişeye kültürlenmiştir. </li><li> Aksi takdirde, kültür% 5 CO2, hava ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 75 cm2 fibronektin kaplı şişede hücreleri. 2 gün sonra ortam değiştirin. NOT: Ortam değişiklikleri arasındaki süreyi uzatmak olmayan endotel hücrelerinin hayatta lehine görünüyor çünkü Hücre ortamı her ikinci gün değiştirilir. Hücreler daha fazla genişleme 15 ilk bölünmüş zaman PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 ve CD31: Biz belirteçlerin immünohistokimyasal algılama kullanarak lenfatik endotel hücre fenotipi doğrulamak. </li></ol>

<ol>
	<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+specialized+junctions+between+endothelial+cells+of+lymphatic+vessels.">Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels.</a> J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).</li><li>Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+button-like+junctions+in+the+endothelium+of+airway+lymphatics+in+development+and+inflammation.">Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).</li><li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+physiology+of+lymphatics.">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li><li>Witte, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function+relationships+in+the+lymphatic+system+and+implications+for+cancer+biology.">Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology.</a> Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).</li><li>Andrade, M., Jacomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+lymphatic+system.">Anatomy of the human lymphatic system.</a> Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).</li><li>Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).</li><li>Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+cancer+metastasis:+bridging+the+gaps.">Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps.</a> Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).</li><li>Bellini, C., Hennekam, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+disorders+of+primary+malfunctioning+of+the+lymphatic+system.">Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).</li><li>Schook, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+lymphedema:+clinical+features+and+management+in+138+pediatric+patients.">Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).</li><li>Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lymphatic+anomalies.">Genetics of lymphatic anomalies.</a> J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=for+the+Study+of+Vascular+Anomalies+(ISSVA)+classification.">for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification.</a> Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+malformation+endothelial+cells,+their+in+vitro+characterization+and+in+vivo+survival+in+a+mouse+xenograft+model.">Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model.</a> Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).</li><li>Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+malformations.">Lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+histologic+features+and+immunohistochemical+staining+in+microcystic+and+macrocystic+lymphatic+malformations.">Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).</li><li>Norgall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+expression+of+VEGFR-3+in+lymphatic+endothelial+cells+from+lymphangiomas.">Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas.</a> BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).</li><li>Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+malformations.">Vascular malformations.</a> Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).</li><li>Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).</li><li>Baluk, P., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+microscopic+imaging+of+lymphangiogenesis+and+angiogenesis.">Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+microcirculation.+Tissue+engineering.">Engineering the microcirculation. Tissue engineering.</a> Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+and+stereological+assessment+of+blood+and+lymphatic+vessels.">Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels.</a> Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).</li><li>Hagerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lymphatic+vessel+development,+growth,+and+function.">Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Kaipainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+fms-like+tyrosine+kinase+4+gene+becomes+restricted+to+lymphatic+endothelium+during+development.">Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).</li><li>Schacht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1alpha/podoplanin+deficiency+disrupts+normal+lymphatic+vasculature+formation+and+causes+lymphedema.">T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema.</a> EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Florez-Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+D2-40+and+LYVE-1+immunostaiing+in+lymphatic+malformations.">Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations.</a> Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Connell, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

LECS sıvı homeostazı, yabancı antijenler ve emilim ve bazı besin taşımaya bağışıklık karşılığının muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. LEC homeostazı, örneğin bakteriyel enfeksiyonlar ve tümör metastazı gibi hastalık süreçlerinde etkilenebilir fakat LECS etkilenen hastalar için işlevsiz lenfatik damarların oluşumu ve önemli hastalıklara yol açtığı somatik mutasyonlara gelişebilir. In vivo implantasyonu ve ex vivo deney yoluyla lenfatik malformasyon etiyolojisi daha anlayışa ve yeni tedavi seçenekleri keşfetmek için, öncelikle CD34 Neg CD31 Pos seçim stratejisi 15 kullanılarak manyetik boncuk seçim stratejisine dayalı bir LEC izolasyon yöntemi geliştirdi. Bununla birlikte, elde edilen kültürler genellikle çıkarılması zor olan endotel hücreleri dışındaki hücre içermektedir. Daha sonra, yöntem CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 P ifade eden LECS sıralamak için FACS kullanılarak rafine edilmişos podoplanin Pos fenotip. Bu yaklaşım sonrası sıralama çeke &lt;olmayan CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos hücrelerinin% 0.5 içeren nispeten homojen LEC kültürleri sonuçlandı. Pratik açıdan, FACS ile hücrelerin sıralama avantajı &lt;% 0.5 dışı LECS varlığı bu azaltılmasıdır. Kültürlü LECS ve LM LECS tipik bir Arnavut kaldırımı morfoloji ve geçit 13 civarında yaşlanmış olur. Bu çalışmada hücre yüzey belirteçleri bir paketi (CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos) kendi ifadesine dayalı normal ve anormal dokuların izolasyonu ve zenginleştirilmiş LECS kültürü için bir akış sitometri tabanlı protokol tanımlanmıştır. Hücreler, in vitro büyütme ile 5-7 gün, izolasyon anında dokularda sıklıklarına göre LEC ciddi ölçüde zengin sonuçlanan bir aşamasını takiben primer dokulardan kriteri edildi. S sırasındaurgery biz birkaç mikrogram gelen ağırlık gram onlarca arasında değişen dokuları edinin. Bu doku, mevcut lenfatik malformasyon damarları, doku yara ve lenfatik malformasyon kist trombüslerinin varlığı hacmine göre Bileşiminde büyük ölçüde değişebilir. Tüm bu bileşenler hastalıklı doku izole edilebilir kaç hücre etkileyecektir. Dolayısıyla başlangıç ​​hücre sayısı birkaç milyon hücrelere birkaç bin hücrelerden uzanabilir. Benzer şekilde, bu hücre süspansiyonunun bileşimi etkiler ve sıralanmış hücre sayısı aynı zamanda, bir numuneden diğerine farklılık anlamına hücre sayıları başlangıç ​​olacaktır. LM LECS% 0.8 den% 12.43 arasında değişmektedir ise kültür içinde 5-7 gün sonra ayıklanmamış sünnet derisi örneklerinde LECS sıklığı, 0.52 ila% 4.7% arasında değişmektedir. LEC kültürleri oluşan&gt;% 99 CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos hücreleri yeniden analiz sıralama sonrası ve bakımı tipik cobbleston sonraolmayan endotel unsurlar tarafından büyümesi olmadan geçit yaşlılık ~ 13 kadar kültür e morfolojisi. Başlangıçtaki Doku sindirimi takip eden ve üstderi veya lenfatik malformasyon hücrelerden verimi genellikle düşüktür, çünkü ayırma hücreleri ex vivo olarak genişletmek için gereklidir. Böylece, lenfatik endotel hücreleri önceden genişleme i n vitro fare odasını tohum için gerekli ~ 2x10 6 hücre üretimi sağlar. Bu 5-7 gün bir in vitro genişlemesi aşamasını gerektirir. Bu hücre kültürü, birincil hücrelerde fenotipik değişikliklerin neden olabileceğini kabul birlikte, bu kültürlenmiş hücreler, bir fare zenograf modelinde 15 lenfatik malformasyon benzeri yapılar oluşturmak için kapasitelerini muhafaza göstermiştir. FACS hücreleri sıralarken başarı derecesini belirlemek protokolü kapsamında birçok kritik adımlar vardır. En kritik aşama kolajenaz hücrelerin maruz kalma zamanıAşama 2.7&#39;de tarif edildiği gibi primer dokulardan izolasyonu sırasında dispaz. Bu, yalnızca bir miktar, mevcut değil, aynı zamanda kullanılan enzimlerin parti halinde doku türü etkilenmez. Buna ek olarak, hücre popülasyonları için kullanılan floresan etiketli antikorlar titre tercihen monoklonal gerekmektedir. Biz tripsin / EDTA, EDTA, TrypLE Select ve hücre dekolmanı çözüm olarak birkaç farklı hücre dekolmanı çözümleri test. Biz EDTA sık sık kalan hücreleri ve artık hücre kümeleri ayırmak için uzun bir süre için kullanılmak üzere olduğunu buldu. Bunun tersine, tek hücre süspansiyonları, tripsin / EDTA, hücre kopması çözeltisi ve TrypLE seç inkübasyondan 3-5 dakika içinde elde edilmiştir. Biz, enzim çözeltilerinin herhangi biri ile tedavi sonrası CD31, CD34, podoplanin ve VEGFR-3 ekspresyonunda belirgin bir fark bulundu. Tek lekeli örnekleri de örtüşmeyen bu florokrom emisyon spektrumları sağlamak için her türlü sıralama deney yapılmalıdır veBu nedenle yanlış okumalar verin. Bu kritik adımlar da hücre protokolü değişiklikler sıralama flow sitometri sırasında gerekli ya da sorun olabilecek adımları oluşturmaktadır. LECS 15 arasında, daha önce yayınlanan bir manyetik boncuk izolasyonu ile karşılaştırıldığında, FACS ile izole LECS avantajı, aşağıdakileri kapsar: heterojen bir numune içinde, yüksek saflıkta ve kesikli hücre alt ve nadir popülasyonlarının belirlenmesi Hücrelerin daha hızlı izolasyonu. FACS tabanlı LEC ve LM LEC izolasyon önemli sınırlamalar etrafında hücre sıralama sonuçlarını izleyen doğrulama için kullanılabilir hücrelerin sayısını sınırlı etrafında döner. Her girişim bizim deneyleri ve alet set-up standardize etmek yapılırken ek olarak, bu aynı parametreler mutlaka başka laboratuvarlarda tekrarlanabilir olmayabilir. Bu nedenle sonuç olarak, bazı farklılıklar oluşabilir. Buna ek olarak, lenfatik biyologların karşı karşıya kaldığı sorunlardan bir hücre spesifik belirteçler olmamasıdırBu ilk kapiller LEC belirteçleri ve kılcal LEC belirteçleri toplamak ayırt ederim. Bu aşamada, henüz sağlıklı LECS ve LM LECS ayırt ediyorum LEC belirteçleri belirlenememiştir. Lenfatik malformasyon dokusu da içerdiğinden lenf damarlarına (Şekil 1A) normal görünümlü, ortaya çıkan CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos normal LECS oranı yanı sıra hastalıklı fenotip olanlar içerecektir. Gelecekteki çalışmalar inceleyerek LEC ve LM LEC gen ifadesi ve proteomik aynı dokuda LECS LM LECS ayırt olabilir daha spesifik LM LEC belirteçler bize doğru yönlendirmek mümkün olabilir. Gelecekte, biz de sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar LEC nüfusun seyrek alt kümeleri tanımlamak için girişimde FACS ve bu yeni LEC belirteçler kullanmaya bekliyoruz. Bu bize, bu hücre popülasyonlarının izole etmek ve lenf gelişiminde rollerini incelemek için izin verecekhatic damar sistemi ve lenfatik malformasyon. CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos dayalı Yalıtımlı LECS ve LM LECS anlamlı olmayan endotelyal hücre kontaminasyonu azalır. Ayrıca, FACS teknoloji bize CD31, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzey belirteçleri ifadesi dayalı alt tiplere LECS ayırmak ve hücre soyu kalkınma bağlamında, bu anlamanızı sağlar. Hastalıklı LECS için, bu in vitro ve hayvan ksenogref modellerinde çeşitli hücre uyaranlara yanıt LEC hastalıklar ve LEC kapasitesini neden olan genlerin üzerinde daha fazla ışık tutacak hücreye özel çalışmalar için izin verir.

Lenfatik damar sisteminin önemli bir fonksiyonu, lenf, lipidler, proteinler ve hücre bileşenleri içeren bir aşırı interstisyel sıvı emer ve kan venöz sisteme yapmaktır. Lenfatik kapilerlerin bir ağ yabancı antijenlere immün gözetim ve yabancı antijenleri nötralize etmek için beyaz kan hücrelerinin dağıtım önemli bir işlem varlığı için taranmıştır lenf düğümlerine lenf yönlendirir. tek yönlü lenfatik sistem ilk lenfatik kılcal lenf girişini 1,2 izin özelleşmiş hücre kavşaklar ince duvarlı düz endotel hücreleri süreksiz tek tabaka ile benzersiz bir yapıya sahip dokularda başlar. Bu kılcal artan interstisyel basınç 3 mevcudiyetinde damar çökmesini engellemek için filamanların ankraj ile komşu bağ dokusu matrise bağlıdır. lenfatik kılcal toplama içine boş ilk lenfatik kılcalO büyük lenfatik damarların veya damarlar içine birleşerek. Karşılaştırıldığında lenf damarları daha kalın kap duvarları, ikili lenf valfleri olan ve bir kaç düz kas hücreleri, 4 gömülü olduğu bir süreksiz bir temel zar ile kapatılmış olan toplama lenf kılcal damarlar başlangıç. Düz kas hücrelerinin koordineli açılması ve lenfatik valf kapağı ve daralma lenf 3 akışını kolaylaştırır. Torasik kanal ve sağ lenfatik kanal: İnsanlarda, vücudun çeşitli bölgelerinden lenfatik damarlar iki lenfatik kanallar oluşturacak şekilde birleştirmek lenfatik gövdelerine oluşturmak için katılın. Torasik kanal göğüs altında vücudun sol tarafında ve sağ taraftan lenf drene olurken, baş, boyun ve toraks sağ kol ve sağ taraftan sağ lenfatik kanal drene lenf. Her iki kanallar boyun 5 subklavyen damarlar içine lenf yapıyoruz. Lenfatik sistem bozuklukları geniş edinilen a halinde gruplandırılmışnd, konjenital (Tablo 1). Edinilen durumların örnekleri lenfanjit ve ikincil lenfödem vardır. Lenfanjit bakteriyel enfeksiyona lenfatik damar iltihabıdır. Etkilenen lenfatikler dilate ve eksuda içeren polimorfonükleer hücreleri ile doldurun. Deride, bu lenf sıklıkla ilişkili lenf düğümüne (lenfadenit) 6 genişlemesi ile birlikte, kırmızı, ağrılı deri altı çizgiler olarak görünür. İkincil lenfödem lenfatik damar veya lenf nodu tıkanıklığı hasar veya tıkanma sonucu olarak ortaya çıkar. Bu hasar veya tıkanma lenf distalinde birikimi kronik ilerleyici şişme yol açar. Gelişmiş ülkelerde, sekonder lenfödem en yaygın metastaz tümörlerin lenf damarlarına veya bölgesel lenf nodları engel ya da anti-kanser tedavisinin bir sonucu olarak, lenf düğümleri, radyasyon sonrası fibroz ve post-enflamatuar trombositemili cerrahi olarak çıkarılması, aşağıdaki habislik ile bağlantılı olanBosis ve skar 7. Dünyanın diğer bölgelerinde, ikincil lenfödem gibi Wuchereria bancrofti 6 olarak parazitik kurtlar neden lenfatik obstrüksiyona sekonder olabilir. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="4"> Lenfatik damar sistemi bozuklukları, </td></tr><tr><td> Edinilen </td><td colspan="3"> Doğuştan </td></tr><tr><td rowspan="3"> Lenfadenit İkincil lenfödem </td><td> İlköğretim Lenfödem 10 </td><td> Sporadik Lenfatik Malformasyonlari 13 </td><td> Sendromları 13 Lenfatik malformasyonlar İlişkili </td></tr><tr><td rowspan="2"> örneğin Milroy Sendromu Meige Sendromu </td><td> Basit: Lenfatik malformasyonlar </td><td rowspan="2"> örneğin Klippel-Tranaunay Sendromu Parklar Weber Sendromu Sturge-Weber Sendromu </td></tr><tr><td> Kombine: Kılcal-lenfatik malformasyonlar Kılcal-lenfatik-venöz malformasyon Kılcal-lenfatik-arteriyovenöz malformasyon Kılcal-lenfatik venöz-arteriyovenöz malformasyon </td></tr></tbody></table> Lenfatik damar sistemi hastalıklarının Tablo 1. Genel Bakış. Lenfatik sistemin konjenital hastalıklar, genetik mutasyonlar, lenfanjiektazi ve lenfatik sistem 8,9 anomalileri neden olduğu düşünülen birincil (idiopatik) lenfödem sayılabilir. Birincil lenfödem muhtemelen de novo mutasyonlar sonucu oluşan veya miras sporadik olabilir. Lenfatik bozukluklar ayrıca izole edilmiş olabilir ya da daha genel bir sendrom 10 bir kısmını ihtiva edebilir. Lenf pediatrik popülasyonda% 97ödem bölgesel lenf drenajı 11 bozan lenfatik damar yapısında anormallikler sporadik. Milroy hastalığı doğumda belirgin ya da kısa bir süre sonra 12 VEGFR-3 genindeki mutasyon neden birincil lenfödem bir örnektir. Çoğunlukla ailesel durumda olmasına rağmen, Milroy hastalığı da Milroy hastalığının 32 aile öyküsü olmayan bebeklerde tespit edilebilir. Herhangi bir lenfödem şiddeti lenf üretimi ve venöz dolaşımı 6 lenf geri taşıma yeteneği miktarına bağlıdır. Klinik bulgular ve yerinde endotel hücre çoğalmasında dayanarak, lenfatik sistemin anomalileri lenfatik tümörler veya lenfatik malformasyon 13 olarak sınıflandırılır. Kaposiform lenfanjiomatozis bir LEC tümör 14 örneğidir. Lenfatik malformasyonlar embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan ve çocuğa 15,16 oranında büyümeye düşünülmektedir. Onlar nadiren gerileme ama remai edebilirsinizn asemptomatik travma veya enfeksiyon klinik komplikasyonlara yol açan hızlı büyüme çöker kadar. Yukarıda tarif edilen venöz dolaşıma dokudan lenfatik ağ ve lenf iletiminin düzenli yapısı lenfatik sıvı ile dolu kistik anormal yapılar lokalize koleksiyonları oluşan lenfatik malformasyon olarak tedirgin olduğunu. Bu kistik gemiler de fonksiyonel lenfatik vanaları içeren lenfatik dolaşıma bağlı veya olduğunu hiçbir klinik veya deneysel kanıtlar olsa da, onların lenfatik kimlik gibi podoplanin, CD31, Lenf Gemi Endotel Reseptör 1 olarak lenfatik hücre belirteçleri aralığının ifadesi tarafından onaylandıktan (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) ve VEGFR-3 15,17,18. Bu kistik yapılar, ya küçük (mikrokistik) veya büyük (makrokistik) olabilir, ama en lenfatik malformasyonlar mikrokistik ve makrokistik bileşenleri (Şekil 1) 16 her ikisini de içerir. Ameliyat sonrasında, injection skleroterapi ve / veya radyofrekans lenfatik malformasyonlar genellikle yeniden ortaya çıkması ablasyona. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> İnsan lenfatik damarların ve lenfatik malformasyonlar Şekil 1. Morfoloji. Normal insan lenfatik (A) ve podoplanin antikor ile etiketlenmiş lenfatik malformasyon damarları (B ve C) (kahverengi etiket, ok). İnsan lenfatik malformasyon damarları belirgin dilatasyon ve lümen boyutu önemli değişim ile karakterizedir. Bu lokalize anormal kistik yapıları küçük (mikrokistik, *) (B), ya da büyük (makrokistik, #) (C) olabilir. En lenfatik malformasyonlar hem mikrokistik ve makrokistik bileşenleri içerir. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">rakamın büyük halini görmek için tıklayınız.</a> &lt;/ P&gt; Bazı araştırmacılar lenfatik malformasyonlar LECS anormal büyüme potansiyeli yok ama onun yerine, normal dolaşıma 19 bağlamak için başarısız olan lenfatik damar gelişimsel bozukluğu temsil ileri sürmüşlerdir. Bununla birlikte, LM LECS hızlı çoğalan ve LECS 15 LM LECS bir defekt olduğunu düşündürmektedir sünnet daha apoptoza karşı daha dirençli olduklarını bulduk. LM LECS fare ksenograft modelinde implante edilir, bunlar lenfatik malformasyon 15 hatırlatan yapılar oluştururlar. Bu lenfatik malformasyonlar, fetal gelişim sırasında LM LECS doğan bir veya daha fazla somatik mutasyonlar neden olabilir bir hipotezini desteklemektedir. Gerçekten, son raporlar fosfoinositid 3-kinaz (PIK3CA) geni 20 p110α katalitik alt birim bu tür bir mutasyon tespit ettik. DNA dizileme teknolojisinin, ilgili mutasyonlar c gelişmeler göz önüne alındığındaOuld daha kolay bu durumların gelecekteki çalışmalara rehberlik, izole LM LECS tanımlanabilir. canlı LECS izolasyonu azalmış besin durumunu veya pro-apoptotik ajanları 15 tepki olarak bu hareketi, çoğalması, tüp oluşturma yeteneği ve hayatta kalma gibi tahlillerde anormal ve normal LECS arasında karşılaştırmalar kolaylaştıracaktır. İzole LECS daha yeni LEC alt popülasyonlarını belirginleştiren, hücreye özgü gen ifadesi ve proteomik çalışmalar yapmak için bize izin ve lenfatik malformasyonlar klinik yönetimi için uygun yeni farmakolojik ajanlar keşfetmek istiyorum. Biz daha önce yenidoğan sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar 15 den LECS manyetik boncuk ayrılması dayalı bir LEC izolasyon yöntemi yayınladık. Bu CD31 pozitif seçime CD34 Neg hücre fraksiyonunun tabi tutarak, ardından CD34 ekspresyonunun bulunmaması, göre, vasküler endotel hücrelerinden normal ve hastalıklı LECS ayrılması için bir strateji bildirilmiştir.Bununla birlikte, bu yöntem artık olmayan endotel hücrelerinin mevcudiyeti ile engellenmiştir. Bu daha sonraki bağ dokusu sindirim öncesinde epidermise kaldırarak bağımsız oldu. Bu kirleticiler genellikle daha hızla çoğaldı ve böylece sonunda LEC izolasyon tekrarlamak sonraki girişimlerine rağmen endotel hücre kültürleri overgrew. Gerçekten de,% 5 ile% 2 kadar düşük olmayan endotel hücrelerinin bir başlangıç ​​kirlenmesi LEC nüfusu 15 bastırmak için yeterli olmuştur. Bu LEC hücre verim ve saflık geliştirmek için bir seçenek olarak floresan aktif hücre sıralama yöntemi keşfetmek için bize istenir. Buna ek olarak, CD34, CD31 Düşük Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra LECS tespit etmek seçim markörleri için VEGFR-3 ve podoplanin ilave LEC popülasyonlarının özgüllüğünü geliştirmek için sıralama çok parametre kullanılmıştır. Bu belirteçler seçme gerekçesi raporlarına dayandığını LECS ve kan vasküler endotelyal ce iseKan, vasküler endotel hücrelerinin 21-23 ile karşılaştırıldığında LLS örneğin CD31 gibi ortak bir çok hücre yüzeyi işaretçileri vardır LECS CD34, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzeyi marker salgılamasında fenotipik değişim gösterir. CD31 aynı zamanda trombosit endotel hücre adhezyon molekülü 1 (PECAM-1) olarak bilinen bir 130 kDa transmembran glikoproteindir. Bu kan ve lenf damarlarının 21,24,25 her türlü ifade çünkü bir pan-endotelyal hücre belirteci olarak kabul edilir. CD34 en hematopoietik progenitör hücreler üzerinde 110 kDa transmembran glikoprotein mevcut olması ve hücreler, vasküler endotel hücrelerinin ve lenf damarlarına 26 kaynaklanır. VEGFR-3, vasküler endotelyal büyüme için alıcı, C ve D faktörleri fare embriyo gelişen damarları başlangıçta mevcut olmakla birlikte, transkripsiyon düzenlenir lenf tarifnamede aşağıdaki gibidir (SOX) -18, Cı Hicken SRY ilişkili HMG-kutusu faktörleri o valbumin u pstream.p. romoter t ranscription f aktör 2 (COUPTF-II) ve PROX-1, VEGFR-3 venöz sentezleme kaybolur ve embriyonik LECS 25,27 sınırlı hale gelir. Podoplanin, 38 kDa zar mukoprotein, ilk fare embriyonik gelişim 28 yaklaşık embriyonik lenfatik damarların gün 11 (~ E11.0) üzerine kaydetti ve şiddetle mikrovasküler lenf damarları, lenf malformasyonlar makrokistik lenfatik endotele göre podoplanin ifade ile ifade edilir iken 15 daha değişkendir. Deneyler en azından bazı CD34 Yüksek CD31 Pos endotel hücreleri lenfatik işaretleyici podoplanin 29 ekspres öneririz Flow sitometri. İnsan lenfatik malformasyonlar LYVE-1 ve podoplanin boyama sistematik değerlendirme hem LYVE-1 ilk lenfatik güçlü mevcut olduğu bildirilmiştir, normal dokularda, lenfatik malformasyon endotelyumu 30 boyama etkili olduğunu göstermesine rağmenkılcal endotel ancak azaltılmış ve toplama lenfatik endotele 31 bile yok. Amacımız izole etmek olduğundan hem biz seçtiniz başlangıç ​​ve toplama lenfatik endotel hücreleri, bizim hücre seçimi stratejisinin bir parçası olarak LYVE-1 kullanmak için değil. Son olarak, bu belirteçler kullanılması kararı da mikroskopik görüntülemesi için lenf damarlarına etiketlenmesi için, teşhis amacıyla kullanılır antikorların mevcudiyeti, akış sitometrisi ve imünoflöresan çalışmalar arasındaki ilişki olanak sağlayabilecek bir özelliği dayanıyordu. Bu makale sünnet derisi ve lenfatik malformasyon gelen CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LECS başarılı izolasyonu yanı sıra CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotel hücreleri için gerekli doku sindirim yöntemi, hücre boyama ve FACS ayarlarını anlatacağız dokusu.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>11965-092</td><td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td></tr><tr><td>EGM-2 MV Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3202</td><td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;-IGF-1 and ascorbic acid.</td></tr><tr><td>VEGF-C</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>2179-VC-025</td><td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C</td></tr><tr><td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15240-062</td><td>This solution contains 10,000&amp;nbsp;U/ml of penicillin, 10,000&amp;nbsp;mg/ml of streptomycin and 25&amp;nbsp;mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td></tr><tr><td>Fibronectin from human plasma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4&amp;nbsp;&amp;#176;C and maintained sterile. Use 7&amp;nbsp;ml to coat 150 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; flask.</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>A11105-01</td><td>StemPro&amp;reg;Accutase&amp;reg; is used at 0.05 ml per cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td></tr><tr><td>0.4% Trypan Blue dye</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15250-061</td><td>Used as a viability stain.</td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>4942078001</td><td>Used at 0.04%</td></tr><tr><td>Collagenase II</td><td>Worthington Lab</td><td>4176</td><td>Used at 0.25%</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche Applied Biosciences</td><td>11284932001</td><td>Used at 0.01%</td></tr><tr><td>70 mm nylon cell strainers</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td><td>BioLegend</td><td>356204</td><td>Used at 1:50 dilution</td></tr><tr><td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td><td>BioLegend</td><td>343516</td><td>Used at 1:200 dilution</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td><td>BioLegend</td><td>303116,</td><td>Used at 1:100 dilution</td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80.</td><td>BioLegend</td><td>337006</td><td>Used at 1:200 dilution</td></tr><tr><td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400112</td><td>Used at 1:50 dilution</td></tr><tr><td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400126</td><td>Used at 1:200 dilution</td></tr><tr><td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td><td>BioLegend</td><td>400120</td><td>Used at 1:100 dilution</td></tr><tr><td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td><td>BioLegend</td><td>400525</td><td>Used at 1:200 dilution</td></tr></tbody></table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

Primer lenfödem, lenf malformasyonlar ve lenfatik tümörler gibi lenfatik sistem bozuklukları önemli morbidite nedeni ama az onların biyoloji hakkında bilinen nadir durumlardır. Hastalıklı ve sağlıklı dokudan son derece saf insan lenfatik endotel hücreleri (LECS) Ayırma, genetik, moleküler ve hücresel düzeyde lenfatik endotel çalışmalarını kolaylaştıracaktır. Bu araştırmalar, bu durumların klinik yönetimi değişebilir yeni tedaviler için hedefler ortaya çıkarabilir tahmin edilmektedir. LECS ve lenfatik malformasyon lenfatik endotel hücreleri (LM LECS) sünnet derisi insan izolasyonunu açıklayan bir protokol sunulmuştur. Elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu dokusu kıyılmış ve enzimatik dispase II ve kollajenaz II kullanılarak tedavi edildi. Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu daha sonra farklılaşması (CD) belirteçleri CD34, CD31, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü-3 (VEGFR-3) ve podoplanin kümelenmesinde antikorlar ile işaretlenmiştir. Stained canlı hücreler diğer endotelyal ve non-endotel hücrelerinden CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC nüfusu ayırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcı (FACS) üzerinde sıralanır. kriteri LM LECS kültüre ve daha deneysel kullanım için fibronektin kaplı şişeler üzerinde genişletti.

Başlangıç ​​Doku sindirimi takiben, bölünmemiş örneklerin kültür 24 saat sonra, ayrı bir endotel hücre kolonileri bir araya fibroblast benzeri hücreler ve yumuşak kas hücreleri (Şekil 2A) gözlenebilir. Izlenerek ayırma ve hücre kültüründe 24 saat sonra CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra hücreleri ekleyin ve tipik arnavut morfolojisi (Şekil 2B ve C) göstermektedir. Yukarıda tarif edilen FACS yöntemi kullanarak, biz CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotel hücreleri onları% 99.8 saflık hücreleri kadar arındırmak ve ayırt edebiliyoruz. Strateji yolluk ve Şekil 3&#39;te sunulmuştur sıralama Temsilcisi sonuçları. Bu konular manyetik boncuk izolasyon yöntemini kullanırken yaşadı karar vermiştir. Bugüne kadar, biz LM LECS ve LEC üstderi, bu geçişten sonra geçiş 13&#39;e kadar bu hücreler geçişli vars morfolojik değişiklikler ve düşük hücre bölünmesi eşliğinde yaşlanma başlar. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52691/52691fig2.jpg" /> Şekil 2. Üstderi LECS ve LM-LEC. Yirmi dört saat sonra, enzimatik sindirim, sıralanmamış endotelial hücrelere (ok) ve non-endotelyal hücreler (A), her ikisini de içerir. CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos FACS hücre izolasyonu takiben, LECS (B) ve LM-LECS (C) sünnet olmayan endotel hücreleri yoksun ve Arnavut kaldırımlı morfolojisi korumak. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig2large.jpg" target="_blank">rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52691/52691fig3.jpg" /> Hücre vasküler sıralama ve lenfatik endotel hücre için yolluk stratejileri sıralama Şekil 3. Floresan aktive hücres. (A), canlı hücreler, sırasıyla birinci VEGFR-3 ve podoplanin gating sıralamak vasküler (B) ve lenfatik endotel (C) hücreleri ile, CD34 ve CD31 ekspresyonu üzerindeki kapı takip edilir. &gt;% 98 vasküler endotelyal hücre fenotipi sıralanmış CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos hücreleri gösterir (D) Yeniden analizi. CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos fenotip sıralanır (E) LEC hücreler de&gt;% 98 saf bulunmaktadır. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig3highres.jpg" target="_blank">rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

isolation-human-lymphatic-endothelial-cells-multi-parameter

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

14.3K Görüntüleme.  The Royal Children&#146;s Hospital.  Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir. 

Video: Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

Isolation of Murine Lymph Node Stromal Cells

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and differentiation of lymphocytes. Various stromal cell subsets have been identified by the expression of the adhesion molecule CD31 and glycoprotein podoplanin (gp38), T zone reticular cells or fibroblastic reticular cells, lymphatic endothelial cells, blood endothelial cells and FRC-like pericytes within the double negative cell population. For all populations different functions are described including, separation and lining of different compartments, attraction of and interaction with different cell types, filtration of the draining fluidics and contraction of the lymphatic vessels. In the last years, different groups have described an additional role of stromal cells in orchestrating and regulating cytotoxic T cell responses potentially dangerous for the host. 
Lymph nodes are complex structures with many different cell types and therefore require a appropriate procedure for isolation of the desired cell populations. Currently, protocols for the isolation of lymph node stromal cells rely on enzymatic digestion with varying incubation times; however, stromal cells and their surface molecules are sensitive to these enzymes, which results in loss of surface marker expression and cell death. Here a short enzymatic digestion protocol combined with automated mechanical disruption to obtain viable single cells suspension of lymph node stromal cells maintaining their surface molecule expression is proposed.

Isolation of lymph node stromal cells is a multistep procedure including enzymatic digestion and mechanical disaggregation to obtain fibroblastic reticular cells, lymphatic and blood endothelial cells. In the described procedure, a short digestion is combined with automated mechanical disaggregation to minimize surface marker degradation of viable lymph node stromal cells.

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Secondary lymphoid organs including lymph nodes are composed of stromal cells that provide a structural environment for homeostasis, activation and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the skin is relatively easy to access, it provides an ideal platform to study peripheral immune regulatory mechanisms. Immune resident cells in healthy skin conduct immunosurveillance, but also play an important role in the development of inflammatory skin disorders, such as psoriasis. Despite emerging insights, our understanding of the biology underlying various inflammatory skin diseases is still limited. There is a need for good quality (single) cell populations isolated from biopsied skin samples. So far, isolation procedures have been seriously hampered by a lack of obtaining a sufficient number of viable cells. Isolation and subsequent analysis have also been affected by the loss of immune cell lineage markers, due to the mechanical and chemical stress caused by the current dissociation procedures to obtain single cell suspension. Here, we describe a modified method to isolate T cells from both healthy and involved psoriatic human skin by combining mechanical skin dissociation using an automated tissue dissociator and collagenase treatment. This methodology preserves expression of most immune lineage markers such as CD4, CD8, Foxp3 and CD11c upon the preparation of single cell suspensions. Examples of successful CD4+ T cell isolation and subsequent phenotypic and functional analysis are shown.

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Isolation of Murine Retinal Endothelial Cells for Next-Generation Sequencing

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies revealing novel paradigms in vascular biology. Applying these methods to models of vascular development requires the optimization of cell isolation techniques from embryonic and postnatal tissues. Cell yield, viability, and purity all need to be maximal to obtain accurate and reproducible results from next-generation sequencing approaches. The neonatal mouse retinal vascularization model is used by researchers to study mechanisms of vascular development. Researchers have used this model to investigate mechanisms of angiogenesis and arterial-venous fate specification during blood vessel formation and maturation. Applying next-generation sequencing techniques to study the retinal vascular development model requires optimization of a method for the isolation of retinal endothelial cells that maximizes cell yield, viability, and purity. This protocol describes a method for murine retinal tissue isolation, digestion, and purification using fluorescence-activated cell sorting (FACS). The results indicate that the FACS-purified CD31+/CD45- endothelial cell population is highly enriched for endothelial cell gene expression and exhibits no change in viability for 60 min post-FACS. Included are representative results of next-generation sequencing approaches on endothelial cells isolated using this method, including bulk RNA sequencing and single-cell RNA sequencing, demonstrating that this method for retinal endothelial cell isolation is compatible with next-generation sequencing applications. This method of retinal endothelial cell isolation will allow for advanced sequencing techniques to reveal novel mechanisms of vascular development.

This protocol describes a method for the isolation of murine postnatal retinal endothelial cells optimized for cell yield, purity, and viability. These cells are suitable for next-generation sequencing approaches.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Recent improvements in next-generation sequencing have advanced researchers&#39; knowledge of molecular and cellular biology, with several studies ...

Gelişim Biyolojisi

Isolating Lymphocytes from the Mouse Small Intestinal Immune System

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to dietary antigens and commensal bacteria while mounting effective immune responses to enteropathogenic microbes. In addition, it has become clear that local intestinal immunity has a profound impact on distant and systemic immunity. Therefore, it is important to study how an intestinal immune response is induced and what the immunologic outcome of the response is. Here, a detailed protocol is described for the isolation of lymphocytes from small intestine inductive sites like the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes and effector sites like the lamina propria and the intestinal epithelium. This technique ensures isolation of a large numbers of lymphocytes from small intestinal tissues with optimal purity and viability and minimal cross compartmental contamination within acceptable time constraints. The technical capability to isolate lymphocytes and other immune cells from intestinal tissues enables the understanding of immune responses to gastrointestinal infections, cancers, and inflammatory diseases.

Here we describe a detailed protocol for the isolation of lymphocytes from the inductive sites including the gut-associated lymphoid tissue Peyer&#39;s patches and the draining mesenteric lymph nodes, and the effector sites including the lamina propria and the intestinal epithelium of the small intestinal immune system.

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

The intestinal immune system plays an essential role in maintaining the barrier function of the gastrointestinal tract by generating tolerant responses to ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Isolation of Uterine Innate Lymphoid Cells for Analysis by Flow Cytometry

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow cytometry. The protocol describes how to set up time mating to obtain multiple synchronous dams, the mechanical and enzymatic digestion of the pregnant uterus, the staining of single-cell suspensions, and a FACS strategy to phenotype and discriminate g1 uILCs. Although this method inevitably loses the spatial information of cellular distribution within the tissue, the protocol has been successfully applied to determine uILC heterogeneity, their response to maternal and foetal factors affecting pregnancy, their gene expression profile, and their functions.

This is a method to isolate uterine lymphoid cells from both pregnant and non-pregnant mice. This method can be used for multiple downstream applications such as FACS phenotyping, cell sorting, functional assays, RNA-seq, and proteomics. The protocol here demonstrates how to phenotype group 1 uterine innate lymphoid cells by flow cytometry.

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

Described here is a simple method to isolate and phenotype mouse group 1 uterine innate lymphoid cells (g1 uILCs) from individual pregnant uterus by flow ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Tıp

Manyetik Hücre Seçimi Kullanılarak İn Vitro LLEC Kültürlerinin Oluşturulması

Harvest and Primary Culture of Leptomeningeal Lymphatic Endothelial Cells

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct from peripheral lymphatic endothelial cells. Their cellular function and clinical implications remain largely unknown. Consequently, the availability of a supply of LLECs is essential for conducting functional research in vitro. However, there is currently no existing protocol for harvesting and culturing LLECs in vitro.
This study successfully harvested LLECs using a multi-step protocol, which included coating the flask with fibronectin, dissecting the leptomeninges with the assistance of a microscope, enzymatically digesting the leptomeninges to prepare a single-cell suspension, inducing the expansion of LLECs with vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C), and selecting lymphatic vessel hyaluronic receptor-1 (LYVE-1) positive cells through magnetic-activated cell sorting (MACS). This process ultimately led to the establishment of a primary culture. The purity of the LLECs was confirmed through immunofluorescence staining and flow cytometric analysis, with a purity level exceeding 95%. This multi-step protocol has demonstrated reproducibility and feasibility, which will greatly facilitate the exploration of the cellular function and clinical implications of LLECs.

Yazar Gündemi: Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hücresel Fonksiyonlarının ve Potansiyel Klinik Etkilerinin Ortaya Çıkarılması 

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs), a recently identified intracranial cell type, have poorly understood functions. This study presents a reproducible protocol for harvesting LLECs from mice and establishing in vitro primary cultures. This protocol is designed to enable researchers to delve into the cellular functions and potential clinical implications of LLECs.

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Leptomeningeal lymphatic endothelial cells (LLECs) are a recently discovered intracranial cellular population with a unique distribution clearly distinct ...

Çoklu-parametre floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma İnsan lenfatik endotel hücreleri İzolasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Kemirgen Lenf Düğümü Stromal Hücrelerinin İzolasyonu

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Lenfositler fare küçük bağırsak bağışıklık sistemi yalıtma

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Akış Sitometrisi ile Analiz için Uterus Doğuştan Gelen Lenfoid Hücrelerin İzolasyonu

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü

Leptomeningeal Lenfatik Endotel Hücrelerinin Hasadı ve Primer Kültürü