Name: determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)
Uploaded: 2015-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP at JoVE.com

We wish to thank the Calcium Imaging Core Facility at CMS for their help and guidance in image capture and analysis. This study was supported by the U.S. National Institutes of Health (NIH) HL102208 to N.A.B. This approach was originally pioneered by Holger Lorenz and Jennifer Lippincott-Schwartz at NIH.

Floresan Protein Kimeralar 1. Nesil ve Doğrulama <ol><li> Standart rekombinant DNA stratejileri 13 ile ilgili proteinin amino ya da karboksil uçları da yeşil floresan protein (GFP) ekleyin. NOT: Bu yaygın olarak GFP kullanılmış olsa da, bu mavi floresan proteinin (CFP), sarı floresan proteini (YFP) gibi diğer varyantlar DsRed ve MCherry kullanılabilecektir. Fluorofor katlama verimliliği, parlaklık ve fotostabilite gelişmeler sürekli olarak yapılıyor ve araştırmacılar yeni nesil yapıları kendilerini boşuna gerekir. <ol><li> Doğru DNA sekansına edin ve GFP grup, ilgi konusu proteini ile çerçeve içinde olduğundan emin olun. Standart rekombinant DNA stratejileri 21 kullanılarak sıralamayı yapın. NOT: Birçok kurum araştırmacı ek bilgi için irtibat için teşvik edilir çekirdek DNA imkanları var. </li><li> Tek ya da çift geçişli membran proteinleri için, oluşturmakfüzyon proteinlerinin 19 amino ve karboksil terminal versiyonları. </li><li> Çok kapsayan proteinler için varsayılan extramembrane döngüler içinde GFP gibi terminaline yerleştirin. Protein ER translokon geçtikten sonra sinyal diziler genellikle proteoliz ile ayrılmaktadır hedef proteinin amino terminaline bağlı floresan füzyon proteini ile transmembran kimeralar üreten özel bir dikkat. </li><li> Sağlam bir amino terminal etiketli floresan proteini içeren olgun bir proteini üretmek üzere kaybolmamış sinyal dizileri söz konusu olduğunda, yarılma sitesi floresan füzyon proteini distalinde yerleştirin. Kimeralarının 21 nesil için standart rekombinant DNA stratejileri istihdam. </li></ol></li><li> Ilgi hücre hattı yeterli uygun lokalize floresan sinyal varlığını belirler. <ol><li> ÖDENEK altında GFP içsel floresan kullanarak Epifloresans mikroskobu altında hücreleri gözlemleyinFiltre set koşulları yedik. 510-560 nm kapsayacak GFP filtre setleri için, doğru filtreler kullanılan fluorophore için kullanılan olduğunu doğrulamaktadır. NOT: gözle değerlendirme sinyali bulunduğu hücresel yapı kolayca arka plan üzerinde giderilmiş olduğunu yeterince güçlü bir sinyal sağlar zaman yeterli sinyal elde edilir. Buna ek olarak, GFP protein boyama modeli, uygun bir organele için işaretler ile tutarlı ve ana etiketlenmemiş proteinin ya da tercihen aynı olmalıdır. </li></ol></li><li> Bir sabit veya geçici transfeksiyon yaklaşımı proteini değerlendirilen dayalı kullanılacaktır belirleyin. NOT: Kararlı transfektanları genellikle geçici sistemlere göre daha ifade düzeyi düşük göze. Geçici ifade (proteine ​​bağlı olarak ~ 5-24 saat sonra transfeksiyon) protein ve artış sinyal yoğunluğunun yüksek düzeyde ekspresyonunu elde edilir, ancak, aynı zamanda, örneğin, protein AGGR gibi aşın eserler yol açabilirhatalı hücre içi lokalizasyonu giden egation veya protein hedefleme yollarının doygunluk,. </li></ol> Hücreler ve Hücre Kültürü 2. Transfeksiyon NOT: Birçok hücre, HEK293, HeLa, COS-7 ve CHO hücreleri 14 de dahil olmak üzere, FPP analizine tabi tutulabilirler. Aşağıdaki açıklama Hek293 hücreleri membran proteinleri ifade dayanmaktadır. <ol><li> Büyüme, insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK293) uyumlu tekli katman olarak muhafaza 6 37 ° C&#39;de,% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 sodyum piruvat ve 250 ug / ml penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM), ml % 5 CO2 ile soğutuldu. Laminer akış doku kültürü kaputu hücreleri ile tüm çalışmaları gerçekleştirin. T-75 balonuna% 80 konfluent ~ kadar kültür ortamı içinde büyür. </li><li> Transien oluşturmak için lipid, vira- veya elektroporasyon-tabanlı teknolojiler de dahil olmak üzere herhangi bir standart, yüksek verimlilik, düşük toksisite transfeksiyon yöntemi kullanılarak Transfect hücrelerit veya kalıcı tanımlama. Tipik olarak, 1 x 10 6 hücre başına plazmid DNA 2 ug tekrarlanabilir protein ifadesini sağlar. CO2 sahip doku kültürü kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de, uygun bir doku kültürü ortamı içinde 5-48 saat boyunca hücrelerin muhafaza edin. </li><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak uygun bir filtre kümesi kullanılarak GFP iç floresan sinyali kullanılarak, epifloresans mikroskobu kullanılarak GFP füzyon proteininin sentezlenmesi için hücre izleyin. Floresan sinyali genellikle transfeksiyonunun takip 24-72 saat içinde maksimuma ulaşır. Floresans sinyali bir maksimum değere ulaştığı zaman hücreler kullanın. Ilgili proteinin ya da GFP kısmı ya karşı antikorlar kullanılarak immünolojik leke analiziyle protein ekspresyonu seviyesini takip edin. </li><li> Kaplanmış lamelleri deneysel analiz plaka hücreleri için. Canlı hücre yapılandırması veya aşağıdaki tespit altında ya görüntüle ve mikroskopi slaytlar monte. Plaka hücreler 24-48 saat içerisinde 60% -80% izdiham elde etmek için. <ol><li> Bütün yüzeyi kaplanana kadar poli-lizin çözeltisi (0.1 mg / ml) ile kaplayın lamelleri. 37 ° C&#39;de bir hücre kültürü kuluçka makinesi içinde, 60 dakika, ardından oda sıcaklığında bir mor ötesi ışık altında 30 dakika boyunca inkübe edin. Aşırı poli-lisin çıkarın ve PBS 3 kez lamelleri durulayın. </li><li> Seçenek olarak ise, yağ daldırma hedefleri ile doğrudan görüntülenmesine olanak vermek üzere bir optik cam alt hücre kültürü plakaları kapsayan bir bölmeli kapak camı üzerine hücreler plaka. Gerçek mikroskopi kurulum araştırmacı mevcut ekipman bağlıdır, ancak hızlı çözüm değişiklikleri yeteneğine sahip olmalıdır. Hücre tipi ve hücre şekli ile ilgili olarak, hücreler, FPP deneyinde zamanında yaklaşık% 60-90 konfluent olmalıdır. </li></ol></li></ol> 3. Floresan Mikroskopi Kurulumu <ol><li> Böyle bir 60X, 1.42 NA immersiyon yağı hedefi olarak maksimum sinyal toplama ve uzamsal çözünürlük, yüksek bir sayısal diyafram (NA) yağ daldırma hedefi kullanın. Inci kullanıne fluorophores uyarmak için lazerler aşağıdaki: argon gazı 488 nm (GFP ve YFP) ve 561 diyot (RFP, mCherry). </li><li> Her yapı için görüntülerin optimal pozlama, kazanç ve yakalama oranını belirleyin. (Adım 7.1.2 bakınız) photobleaching en aza indirmek için lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlayın. </li><li> (Örneğin, bir membran proteini markeri ile uyum içinde membran geçirgenliği için çözünür bir belirteci), uygun bir filtre tercih birden florofor ile çalışmaları için sinyal yansesi en aza indirmek ve sinyal-gürültü oranı en üst düzeye ayarlar. </li></ol> 4. Plazma membran geçirgenliği için optimal şartları oluşturulması <ol><li> (Örneğin, EGFP DsRed), sadece çözünür floresan proteinleri eksprese eden hücrelerden elde edilen hücre kültür ortamı çıkarın. KHM tampon hücreleri, 3 kez (1 dk) yıkayın (110 mM potasyum asetat, 3 mM MgCl2, 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.2). Oda sıcaklığında hücreleri ile deneyler ve reaktifler yapın. </li><li> Yer hücreleri on lamelleri bir floresan mikroskop sahnede KHM tamponunda (adım 2.4) ve kontrol &#39;olmayan geçirgenleştirildi&#39; sahne temsil ilk görüntü, toplamak. </li><li> Seçici olarak, plazma membran geçirgenliği için, hücrelere KHM tamponu digitonin (30 uM) ilave edin. 10-60 saniye için 5 ml / dakikalık bir hızla tampon (tampon + digitonin) ile hücrelerin serpmek. </li><li> Yavaş yavaş digitonin konsantrasyonu artırarak optimum digitonin konsantrasyonunu belirlemek. dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde çözünen EGFP floresan sinyalinin tamamen kaybı olduğunda uygun dijitonin konsantrasyon elde edilir. Birçok hücre için 10-50 uM digitonin uygulama hücre membran geçirgenliği için yeterli değildir. <ol><li> Için tüm uygulamalar digitonin mümkün olan en düşük konsantrasyon kullanın. Permeabilize arka plan sinyali için geçirgenliği digitonin sonra görüntü Toplama. </li></ol></li><li> Ilgi GFP proteini kimera zar olduğunu doğrulayınplazma zarı 16 digitonin permeabilization aşağıdaki floresan sinyalinin hücresel tutma onaylayarak bütünleşmiş. <ol><li> Bir organel özel floresan proteini 23 Express. Mitokondriyal proteinler, örneğin bu bağlamda 16, pDsRed2-Mito vektör iyi çalışır. Adım 2.1 açıklandığı gibi uygun ifade koşullarını belirleyin. </li><li> Hücre içi organellerin morfoloji digitonin için uzun süreli (60 dk) maruz boyunca sabit kalmasını digitonin konsantrasyon sağlayarak istihdam hücre tipi için uygun olduğundan emin olun. NOT: Bu tür lizozomlardan gibi çeşitli hücresel bölmeleri karşı antikorlar kullanarak Kullanım standart immunofloresan mikroskopi protokolleri, (örneğin, LAMP1), Golgi (örneğin, TGN38), endoplazmik retikulum (örneğin, calnexin), endozomlar (örneğin, Rab5), mitokondri (örn, sitokrom c) işlendi. Hücre içi organel morfolojisi / bütünlük değişiklikleri dramatik ove iser, 60 dakika, bu dijitonin konsantrasyonu çok yüksek olduğu muhtemeldir ve dijitonin konsantrasyonu ve / veya maruz kalma süresinde bir azalma gereklidir. NOT: Digitonin Teneffüs ve cilt ile temasında toksiktir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (KKE) giyin. </li></ol></li></ol> Floresan Protein 5. Proteaz İle Muamele <ol><li> Proteaz ekleyin (proteinaz K; KHM tamponu içinde 50 ug / ml) KHM tampon hücreleri yıkanır ve doğrudan hücreler üzerine. 5 ml sürekli hazırlama banyosu yerçekimi vasıtasıyla beslenmesini perfüzyon sistemi kullanılarak / dakikalık bir akış hızında hücreleri serpmek. <ol><li> 50 ml &#39;lik şırıngaya saklayın çözeltiler ve polietilen boru banyosu (5 ml / dk akış oranı) tek bir çıkış ile bir manifolda bağımsız rezervuar bağlı. Sabit (0.5 mi) banyo hacmi korumak ve el ile perfüzyon rezervuar arasında geçiş yaparak çözelti değişimi elde etmek için bir emme pipet yerleştirin. </li></ol></li><li> Flor belirlemek için görüntüleri toplayınescent sinyal devam ederse veya alçaltır. 30-60 saniye boyunca ilk sinyal yoğunluğunun&gt;% 90 bir kayıp GFP proteini kimera proteolitik bozulması ile tutarlıdır (Örnek Sonuçlar bakınız). </li><li> Hiçbir sinyal bozulması proteinaz K ile görülürse, bu tür kayıp beklenen zaman, KHM tamponunda tripsin (4-8 mM) ile proteinaz K çözümü değiştirin. Gerekirse, proteinaz K, tripsin bir karışımını kullanmaktadır. Proteaz aktivitesini bastırmak için bir ihtiyaç vardır. </li></ol> Dış Etki Plazma Membran Proteinleri 6. Alternatif Yaklaşım <ol><li> Plazma membran proteinleri için, geçirgenliği digitonin önce dış floresan proteinleri kimeralar için tahlil yapmak. KHM tamponu lamelleri hücreleri (5 mi / dakika x 3 dakika) yıkanır, ve ön-proteaz tedavisi için bir görüntü ve Aşama 7&#39;deki gibi ön-proteaz floresan sinyalini ölçmek. </li><li> Proteaz hücreleri Açığa (proteinaz K, 50 ug / ml veya mM KHM tamponunda 4-8 tripsin) tKHM ortam ihtiva eden bir proteaz (akış hızı 5 ml / dak) ile hücrelerin perfüze digitonin arasında da yokluğu. Sinyal kaybolur ya da ne kadar sinyal devam nasıl hızlı bir şekilde belirlemek için, floresan protein görüntüleri toplayın. </li><li> Dijitonin geçirgenliği önce,% 10 serum (FBS) ihtiva eden hücre kültür ortamı içinde hücreleri üç kez (1 dk) yıkayarak, bunların hepsi proteaz etkinliğe söndürün. </li><li> 2 dakika boyunca KHM tamponu (5 ml / dk akış oranı) ile perfüze hücreleri yıkayın. Bir ön-permeabilizasyon görüntü elde. Aşama 4&#39;te tarif edildiği gibi, hücre membran geçirgenliği. </li><li> Aşama 5&#39;te tarif edildiği gibi proteaz ilave edildikten sonra görüntü Toplama. </li></ol> 7. Görüntü Analizi <ol><li> Flüoresan sinyal kaybı gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan &quot;canlı hücre&quot; kayıt kapasitesine sahip bir ters mikroskop kullanın. Sürekli izleme için, aynı parametreler (pozlama süresi, kazanç, lazer yoğunluğu, vb) kullanır. <ol><li> Exper belirleyinKontrol koşulları altında (yani, KBH sadece tampon) altında ilgi GFP protein floresan sinyalini gözlemlenerek imental parametreleri. 10-20 dakikalık bir süre boyunca sinyal yoğunluğu kayda değer kaybı olmasını sağlamak için bilgisayar odaklı mikroskop kazanç, lazer yoğunluğu ve maruziyet süresi ayarlarını ayarlayın. NOT: Sinyal yoğunluğu bir mutlak değer değil, ama her PI mevcut mikroskop sistemi ve ayarlar dayanmaktadır. Nispi flüoresan yoğunluğundaki değişiklik izler. </li></ol></li><li> Alternatif olarak, proteaz tarafından takip digitonin set zaman noktalarında hücreleri tedavi ve önceki görüntüleme için lamelleri montaj hücreleri düzeltmek. Zaman noktaları ampirik adım 4 ve ilk soruşturma için 5. prosedürleri takip belirleyin, digitonin veya proteaz 0, 30, 60, 120 ve 300 sn sonrası ek başlayacak. <ol><li> Hücreleri (oda sıcaklığında 20 dakika) tam th daldırmak için sabitleyici yeterli bir miktarını (PBS içerisinde% 3.7 paraformaldehit) kullanarak saptamakE hücreler. </li><li> PBS, 20 mM glisin ile (3 x 5 dk) içeren hücrelerin durulanarak artık paraformaldehid söndürüldü. </li><li> Lamel fazla sıvıyı çıkarılması ve bir cam mikroskop 50 ul montaj ortamına lamel tersini Mount lamelleri görüntüleme için slaytlar. Slaytlar görüntüleme gecede önce kurumasını bekleyin. </li></ol></li><li> Floresan mikroskop görüntüleri toplayın bilgisayar kontrollü floresan mikroskop video görüntü yakalama işlevini kullanarak (uygun filtreler altında flüoroforun kullanılan uyumlu setleri). </li><li> İnkübasyon durumunun bir fonksiyonu olarak flüoresan sinyal yoğunluklarını ölçmek. Tek bir hücreyi çevreleyen faiz (ROI) bir bölgede ortalama piksel yoğunluğu edinin. </li></ol>

<ol>
	<li>Sevier, C. S., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+transfer+of+disulphide+bonds+in+living+cells.">Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 836-847 (2002).</li><li>Brodsky, J. L., Skach, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+folding+and+quality+control+in+the+endoplasmic+reticulum:+Recent+lessons+from+yeast+and+mammalian+cell+systems.">Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum: Recent lessons from yeast and mammalian cell systems.</a> Current Opinion In Cell Biology. 23, 464-475 (2011).</li><li>Kyte, J., Doolittle, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+displaying+the+hydropathic+character+of+a+protein.">A simple method for displaying the hydropathic character of a protein.</a> J Mol Biol. 157, 105-132 (1982).</li><li>Ott, C. M., Lingappa, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integral+membrane+protein+biosynthesis:+why+topology+is+hard+to+predict.">Integral membrane protein biosynthesis: why topology is hard to predict.</a> J Cell Sci. 115, 2003-2009 (2002).</li><li>Traxler, B., Boyd, D., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+topological+analysis+of+integral+cytoplasmic+membrane+proteins.">The topological analysis of integral cytoplasmic membrane proteins.</a> The Journal of Membrane Biology. 132, 1-11 (1993).</li><li>Cserzo, M., Wallin, E., Simon, I., von Heijne, G., Elofsson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+transmembrane+alpha-helices+in+prokaryotic+membrane+proteins:+the+dense+alignment+surface+method.">Prediction of transmembrane alpha-helices in prokaryotic membrane proteins: the dense alignment surface method.</a> Protein Eng. 10, 673-676 (1997).</li><li>Geest, M., Lolkema, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+topology+and+insertion+of+membrane+proteins:+search+for+topogenic+signals.">Membrane topology and insertion of membrane proteins: search for topogenic signals.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 13-33 (2000).</li><li>Bogdanov, M., Zhang, W., Xie, J., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+protein+topology+mapping+by+the+substituted+cysteine+accessibility+method+(SCAM(TM)):+application+to+lipid-specific+membrane+protein+topogenesis.">Transmembrane protein topology mapping by the substituted cysteine accessibility method (SCAM(TM)): application to lipid-specific membrane protein topogenesis.</a> Methods. 36, 148-171 (2005).</li><li>Chang, X. B., Hou, Y. X., Jensen, T. J., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+membrane+topology+by+glycosylation+site+insertion.">Mapping of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator membrane topology by glycosylation site insertion.</a> J Biol Chem. 269, 18572-18575 (1994).</li><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation.">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9, 789-798 (2002).</li><li>Zamyatnin, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+integral+membrane+protein+topology+in+living+cells.">Assessment of the integral membrane protein topology in living cells.</a> Plant J. 46, 145-154 (2006).</li><li>Lorenz, H., Hailey, D. W., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+of+GFP+chimeras+to+reveal+protein+topology+and+subcellular+localization.">Fluorescence protease protection of GFP chimeras to reveal protein topology and subcellular localization.</a> Nat Methods. 3, 205-210 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. a Laboratory Manual. , (1989).</li><li>Shah, K., McCormack, C. E., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do+you+know+the+sex+of+your+cells?+American+journal+of+physiology.">Do you know the sex of your cells? American journal of physiology.</a> Cell Physiology. 306, C3-C18 (2014).</li><li>Wang, H., Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+transmembrane+Ser/Thr+kinase+complexes+with+protein+phosphatase-1+and+inhibitor-2.">A novel transmembrane Ser/Thr kinase complexes with protein phosphatase-1 and inhibitor-2.</a> J Biol Chem. 277, 49605-49612 (2002).</li><li>Nixon, A., Jia, Y., White, C., Bradbury, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+protease+protection+reveals+the+topology+of+the+integral+membrane+protein+Lemur+Tyrosine+Kinase+2+(LMTK2).">Fluorescence protease protection reveals the topology of the integral membrane protein Lemur Tyrosine Kinase 2 (LMTK2).</a> Am J Physiol. 304 (2), C164-C169 (2012).</li><li>Tagawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+trafficking+of+caveolar+domains+in+the+cell:+caveolae+as+stable,+cargo-triggered,+vesicular+transporters.">Assembly and trafficking of caveolar domains in the cell: caveolae as stable, cargo-triggered, vesicular transporters.</a> J Cell Biol. 170, 769-779 (2005).</li><li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+specifying+subunit+VIII+of+human+cytochrome+c+oxidase+is+localized+to+chromosome+11+and+is+expressed+in+both+muscle+and+non-muscle+tissues.">A gene specifying subunit VIII of human cytochrome c oxidase is localized to chromosome 11 and is expressed in both muscle and non-muscle tissues.</a> J Biol Chem. 264, 10595-10600 (1989).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells.">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Curr Biol. 5, 635-642 (1995).</li><li>Lorenz, H., Windl, O., Kretzschmar, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+phenotyping+of+secretory+and+nuclear+prion+proteins+associated+with+inherited+prion+diseases.">Cellular phenotyping of secretory and nuclear prion proteins associated with inherited prion diseases.</a> J Biol Chem. 277, 8508-8516 (2002).</li><li>Ben-Gedalya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclosporin-A-induced+prion+protein+aggresomes+are+dynamic+quality-control+cellular+compartments.">Cyclosporin-A-induced prion protein aggresomes are dynamic quality-control cellular compartments.</a> J Cell Sci. 124, 1891-1902 (2011).</li><li>Rogers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitope+mapping+of+the+Syrian+hamster+prion+protein+utilizing+chimeric+and+mutant+genes+in+a+vaccinia+virus+expression+system.">Epitope mapping of the Syrian hamster prion protein utilizing chimeric and mutant genes in a vaccinia virus expression system.</a> J Immunol. 147, 3568-3574 (1991).</li><li>Lisenbee, C. S., Karnik, S. K., Trelease, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+mislocalization+of+a+tail-anchored+GFP+redefines+the+identity+of+peroxisomal+ER.">Overexpression and mislocalization of a tail-anchored GFP redefines the identity of peroxisomal ER.</a> Traffic. 4, 491-501 (2003).</li><li>Brandee, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mislocalization+and+degradation+of+human+P23H-Rhodopsin-GFP+in+knockin+mouse+model+of+retinitis+pigmentosa.">Mislocalization and degradation of human P23H-Rhodopsin-GFP in knockin mouse model of retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 9728-9736 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).</li></ol>

The authors declare no conflict of interest.

Membran proteinlerinin doğru yönlendirme ve topoloji bunların uygun fonksiyonu için gereklidir. Membran proteini topoloji anlama önemine rağmen, bu veriler tamamen yoksun olduğu için birçok protein vardır. SOP kolay ve verimli bir membran proteini topoloji belirleme şekli ve en laboratuvarlar tarafından yapılabilir bir sağlar. FPP yaklaşımı, protein topoloji belirlemek için önceki yöntemlere göre önemli avantajlar tanıyor. Örnek olarak, ilgili 31 proteinin tekrar çeşitli etki yönlendirilmiş çok sayıda antikor paneli için hiçbir gerek yoktur. Birçok durumda antikorların bir panelinin mevcut değildir; Bu klonlanmış proteinler için de geçerlidir. Deney, tek bir hücre seviyesinde yapılabilir gibi, proteinin büyük biyokimyasal miktarlarda alt baş biyokimyasal için gerekli olmayan bu gibi proteoliz veya SDS-PAGE olarak analiz eder. Gerçekten de, nispeten daha az transfekte edilmiş hücreler açıkça atamak için gerekli olanilgilenilen proteinin bir topoloji. Araştırmacı epitel hücreleri veya nöronlar gibi transfect zor hücrelerde topoloji değerlendirilmesi ise bu önemlidir. Proteinin karboksil veya amino terminalinde bir GFP kısmı basit eklenmesi kolaylıkla plazmidleri içeren çok ticari olarak temin edilebilir GFP kullanılarak elde edilebilir, ve çoğu durumda, GFP kısmı eklenmesi uygun protein katlanmasını veya hücre içi lokalizasyonu engellememektedir. Ilgi 23,24 proteini etkileyecek GFP için potansiyel var Ancak, araştırmacı, bu onların protein için doğru olduğunu onaylamanız gerekir. Birçok proteinler böylece topolojik çalışmaları başlatmak için minimum ek çaba gerektiren, zaten GFP füzyon proteinleri olarak mevcuttur. Floresan sürekli izleme canlı hücre için görüntüleme donanımları erişimi olmayan araştırmacılar için, protein topoloji belirleme hızlı ve etkin araçlar sağlar rağmen, tahlil kolaylıkla bir formaldehit tespit uygulaması uyarlanmıştırroach konfokal mikroskopi standart Epifloresans kullanarak. FPP tahlil uygulanabilirliği bazı sınırlamalar ancak vardır. Işleme proteolitik, ya da diğer post-translasyonel modifikasyonlar ilgi protein için biraz farklı membran topolojilere neden olursa, FPP tahlil sadece dominant protein formunu değerlendirecektir. Buna ek olarak, bazı proteinlerin terminallerine bir GFP parçasını ekleme karboksil terminal PDZ etki ile müdahale, örneğin, onların işlevini etkileyebilir. Bununla birlikte, FPP deneyi birçok membran proteinlerinin yönünü ve topoloji kuran basit bir yaklaşım tanıyor. Bu ilk deneyler, hücre içi çözünür GFP serbest bırakmak için digitonin doğru konsantrasyonunu belirlemek için yapılması önemlidir. GFP dijitonin uygulamasını takip eden hücre dışına yaygın değilse, digitonin konsantrasyonu en az konsantrasyonu yeniden belirlemek için, kademeli olarak arttırılmalıdırsalınmasını kolaylaştırmak üzere yapılması gereklidir. Bununla birlikte, çok fazla dijitonin bütünlüğü dijitonin uygulamasından sonra teyit edilmelidir hücre içi veziküller morfolojisini etkileyecektir. Bazı hücrelerde organelleri çok hassastır ve daha fazla dengeleyici tampon bileşim 25 gerektirebilir. Değerlendirilen chimera flüoresan sinyal düşük ise, daha yüksek bir ekspresyon seviyesinde tek bir klonun seçilmesi, ya da, geçici ifadeyi gerçekleştirmek genellikle kabul edilebilir seviyeye sinyal gücünü artırır. Yeni arayan, parlak plazmidler de düşük sinyal yoğunluğu dikkate alınmalıdır. Son olarak, bakım görülen sinyal kaybı proteaz bozulmasına bağlı olup fluorophores ışıkla ağartma için olduğundan emin olmak için dikkat edilmelidir. Işık yoğunluğunu ve / veya satın alma oranının azaltılması photobleaching azaltmaya yardımcı olacaktır.

plazma zarları, yanı sıra çok sayıda hücre içi zarlar, iki sulu bölmelerini ayıran engel olarak hizmet vermektedir. Plazma membranı durumunda, ayırma dış tarafı arasında ve hücrenin içinde olduğu; hücre içi organellere için sitoplazma ve organel lümen arasında. Örneğin, endoplazmik retikulum (ER) membran ortamı 1 azaltıcı sitozolik ER lümeninde bir oksitleyici ortam ayırır. Zar proteinleri, ER-bağlantılı, ribozomlar üzerinde sentezlendiği ve ER zar 2 içinde son topoloji elde edilir. proteinler için uygun membran yönelim ve topoloji edinimi normal fonksiyonu için önemlidir. Doğru topolojisi bağlanma partnerleri ile etkileşim zar proteinlerinin uygun etki sağlayan, kritik post-translasyonel modifikasyonlar meydana sağlar ve plazma zar proteinleri durumunda, hücre ile karşılıklı etkileşim ve t yanıt sağlarçevresini o. Tam bir membran proteinin fonksiyonunu değerlendirmek için, bu protein, bulunduğu olan membran, örneğin, zar topolojisine göre yönlendirilmiştir nasıl açıkça şarttır. Membran proteinleri farmakolojik hedefler 3 çoğunluğunu oluşturan bu yana bir protein yüzey yönleri farklı ortamlara maruz kalan bir membran proteini ve hangi topoloji anlamak temel bilimsel bilginin edinimi, ek olarak klinik etkileri işaretlenmiş. Yakın zamana kadar, zaman ve para önemli yatırım gerektirmiştir veya gelmek zor olan reaktifler gerektirmiştir membran proteini topoloji belirleme yaklaşımları. Hem deneysel ve silico yaklaşımlar plazma zarı içinde bulunan proteinlerin membran topolojisini belirlemek için kullanılmıştır. Bireyler değerlendirilir hidrofobisitesine göre membranlı etki ilk tahminleri yanaÇift amino asitler 3, çok sayıda öngörü algoritmalar artık internette mevcuttur ve sadece proteinin amino asit dizisinin bilgisi gerektirir. Ancak, varsayımlar genellikle topoloji 4,5 yanlış atamaları neden böyle modelleme programları, varsayımlara merkezi vardır. Bu bilgisayar tabanlı tahminler geçici zar kapsayan bölgeleri atayabilirsiniz Dahası, onlar her zaman amino ya da proteinlerin karboksi terminali organel lümen veya hücre dış, sitoplazmasında olup olmadığını belirlemek değil. Hesaplama gücü artmış, ve hatta makine-öğrenme algoritmaları 6, bu tür verilerin kullanımı hala bir modeldir ve deneysel elde edilen veriler kullanılarak valide edilmelidir. Membran topoloji doğrudan deneysel belirlenmesi onların imünoreaktivitenin değerlendirilmesi öncesi ve hücre geçirgenleştirmeden sonra yapılmış protein, dağılmış bilinen epitoplarıyla monoklonal antikor panelleri kullanılarak üstlenilmiştir. Buyaklaşım ilgili protein için mevcut olmayabilir antikorlar, bir dizi gereklidir. Alternatif bir strateji yeniden öncesi ve membran geçirgenleştirmeden sonra imünoreaktivite belirlenmesi ardından protein boyunca çeşitli yerlerde, içine myc veya hemagglutinin (HA) gibi epitop etiketleri mühendisi olduğunu. Imünojenik etiketleri ek olarak, ve bu sistein tarama gibi kimyasal değişiklikler (alkalin fosfataz, P-galaktosidaz β, β-laktamaz ya da dahil olmak üzere), enzimatik etiketler, tüm zar proteini topoloji 7,8 belirlemek için kullanılmıştır. Plazma zar proteinlerinin topolojik haritalaması için kullanılan bir başka yöntem de epitop etiketleri için biraz farklı bir yaklaşıma dayanmaktadır. Bu yöntemde etiket dizisi N-bağlantılı glikosilasyon konsensüs sekansı NXS / T&#39;dir. Bu tür bir sekans biyosentetik yolun bir luminal karşı etiketin varlığının lümeninde var olduğunda glikosilasyon yalnızca oluşur yanasitozolik bölmesi kolayca SDS-PAGE jelleri üzerinde bir kitle vardiya olarak görülmektedir. Böyle bir yaklaşım, multispanning iyon kanalının CFTR 9 uygulanmıştır. Tüm bu yaklaşımlar kullanılmıştır olmakla birlikte, bunların hepsi oluşturmak ve çeşitli yapıları sıralamak için moleküler biyoloji önemli yatırımlar gerektiren açıktır. Hücre içi organellere içinde bulunan zar proteinleri ile ilgili topolojik bilgileri belirlemek için daha zor olduğu kanıtlanmıştır. floresan tabanlı teknolojilerin uygulanması, ancak zar topoloji çok basit belirlenmesi yaptı. bimoleküler floresan komplementasyon tekniği (BiFC) o proteinin 10 floresan özelliklerinin korunması, bir fluoresan proteininin iki floresan olmayan fragmanlar arasında etkileşimine dayanmaktadır. Ilk olarak, in vivo 10 protein-protein etkileşimlerini belirlemek için tarif edilmiş olmasına rağmen, bu yaklaşım aynı zamanda kullanılmıştırBitki hücrelerinde 11 zar proteini topolojisini tespit etmek. Bununla birlikte, bu yaklaşım, ilgili protein, aynı zamanda sitosol veya organel lümenine hedeflenen füzyon proteinlerinin çeşitli füzyon proteinlerinin sadece oluşumunu da gerektirir gibi yoğun süresi de, ve ilgi bulunan hücre içi protein membranlar olan bilgi gerektirir . Zar proteini topoloji olarak belirlemenin bir alternatifi daha basit bir yaklaşım 12 tarif edilmiştir. Deney, Fluoresans Proteaz koruma (FPP), GFP ve ilgili gen arasındaki bir füzyon proteini üretilmesini gerektirir. yaklaşım GFP kısmı için spesifik olmayan proteazlar nispi erişilebilirlik üzerine dayanmaktadır; olup GFP bağlı olarak hücre içi organellerin lümeninde bulunan ile proteoliz tarafından korunduğu veya sitoplazmada mevcut olan vasıtasıyla proteolize maruz kalmaktadır. Ilgilenilen proteinin GFP kısmı sitoplazma dönük Böylece, eğer, bu maruz kalacağıproteaz aktivitesi ve floresan sinyali kaybetti. Ilgi protein GFP kısmı (örneğin Golgi lümen gibi) proteazm bir ortam &#39;korumalı&#39; karşı karşıya Tersine, daha sonra floresan sinyali devam edecektir. Proteazlar hücreye girmesine izin, ancak kolesterol bağlayıcı ilaç digitonin kullanılan hücre içi membran bölmeleri girmek değil. Kolesterol omurgalıların baskın steroldür ve özellikle hücre içi bölümlere göre plazma membranında zenginleştirilmiştir. glikozit toksini, dijitonin, bitki Digitalis purpurea&#39;nın elde edilir. Digitonin&#39;dir bu 14,16 (Şekil 1) permeabiliztion seçici membran neden kolesterol açısından zengin zarlar için afinitesi vardır. Küçük sitosolik bileşenlerin çıkış sağlayan ek olarak, dijitonin geçirgenleştirme, aynı zamanda, proteinaz K ya da tripsin gibi eksojen moleküllerin girişini mümkün kılar. FPP protokol fac yararlanırPlazma membranı, ER gibi diğer organellere, oysa, golgi endozomlarda, çok düşük bir kolesterol içeriği vardır mitokondri, 14 olduğu gibi kalır, hücresel kolesterolün 17% 80 kadar ihtiva t. plazma zarının kolesterolün seçici dahil S. gibi çeşitli ökaryotik türlerde dijitonin bağımlı plazma membran geçirgenliği kullanımını sağlayan, çok sayıda ökaryotik hücrelerde gözlenmiştir İnsan 14,18 ile cerevisiae. FPP deneyi (a) proteini zara bağlı / ilgili veya sitosol ve membran proteini, (b) etki serbestçe nüfuz olup sitosol veya organel lümeni yüzler belirlemek için bir basit, hızlı ve oldukça sağlam bir araç sağlar. Bir zar proteini birden yönelimleri varsa, sinyal baskın biçimde ortaya çıkacak ve minör form tespit edilmez. Ilgi proteine ​​GFP kısmının eklenmesi işlevini etkileyebilir ki bazı endişeler olabilir iken ve/ Veya hücre içi lokalizasyonu, bu gerçek aslında daha teorik. Gerçekten de birçok çalışmalar net bir şekilde GFP etiket protein 19,20 özelliklerini değiştirmediğini göstermiştir.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Calbiochem</td><td>300410</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Cav1-GFP</td><td>Addgene</td><td>44433</td><td></td></tr><tr><td>pAcGFP-1 Golgi</td><td>Clontech</td><td>632464</td><td></td></tr><tr><td>Polylysine</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Dako</td><td>cS704</td><td></td></tr></tbody></table>

determining membrane protein topology using fluorescence protease protection (fpp)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established for many membrane proteins. A simple technique called fluorescence protease protection (FPP) is presented, which permits the determination of membrane protein topology in living cells. This technique has numerous advantages over other methods for determining protein topology, in that it does not require the availability of multiple antibodies against various domains of the membrane protein, does not require large amounts of protein, and can be performed on living cells. The FPP method employs the spatially confined actions of proteases on the degradation of green fluorescent protein (GFP) tagged membrane proteins to determine their membrane topology and orientation. This simple approach is applicable to a wide variety of cell types, and can be used to determine membrane protein orientation in various subcellular organelles such as the mitochondria, Golgi, endoplasmic reticulum and components of the endosomal/recycling system. Membrane proteins, tagged on either the N-termini or C-termini with a GFP fusion, are expressed in a cell of interest, which is subject to selective permeabilization using the detergent digitonin. Digitonin has the ability to permeabilize the plasma membrane, while leaving intracellular organelles intact. GFP moieties exposed to the cytosol can be selectively degraded through the application of protease, whereas GFP moieties present in the lumen of organelles are protected from the protease and remain intact. The FPP assay is straightforward, and results can be obtained rapidly.

Plazma Membran Permeabilization Etkin plazma membran geçirgenleştirilmesi çözünür floresan protein (örneğin, GFP, DsRed) (Basamak 4) kullanılması ile tespit edilir. Bu proteinler, hücrelerde ifade edildiğinde, sitozol içinde dağıtmak için serbesttir ve plazma membranı (Şekil 2) digitonin ile geçirgenleştirildi zaman kaybolur. Floresan sinyalinin bir tamamen yok dijitonin uygulama 10-60 saniye içinde gerçekleşmelidir. Ilgili protein, hücre içi organellerin ilişkili onay dijitonin geçirgenliği, aşağıdaki flüoresan sinyal tutma not elde edilir. Proteaz İle Muamele Hücrelerdeki floresan protein ilgili protein ve floresan proteini (GFP YFP, vb) (Aşama 1) ve ifade arasındaki floresan kimeralar başarıyla nesil sonra (Aşama 2), tedavi<html> proteaz ile birlikte geçirgen hale hücreler fluorofor (ve onun komşu protein etki) sitosolde ve sindirim proteaz erişilebilir, ya da bir organel lümeninde bulunan ve bu nedenle proteaz sindirim (Adım 4) korunur konusunda bilgi verecektir. LMTK2 bir zara bağlı kinaz 15, ve floresan proteaz koruma deneyleri zar topoloji 16 belirlemek için kullanılmıştır. LMTK2 karboksil kuyruk GFP&#39;ye birleştirilmiş ve geçici olarak ifade edilmiştir. Floresan LMTK2-GFP sinyali LMTK2 sitosol (Şekil 3) içinde konumlanmış olan karboksil terminaline konumunu gösteren, proteinaz K ilave edildikten sonra hızlı bir şekilde kaybedildi. Kaveolin-GFP (CAV1 GFP) 17 sitosolik alana bağlı bir GFP kısmı bir plazma membran proteinidir. (Şekil 3) LMTK2 gibi, kaveolin-YFP sinyal duyarsız Digitonin&#39;dir fakat proteaz daha sonra ilave duyarlı. t &quot;&gt; lüminal çözünür proteinler de FPP protokolü kullanılarak tespit edilebilir. Bu örnekte, ER-retensiyon sinyali KDEL DsRed eklenir. LMTK2 ve kaveolin gelen sinyallerin tersine, KDEL-DsRed gelen sinyal iki karşı duyarsızdır dijitonin ER membran geçirgenliği mümkün olduğu gibi dijitonin ve proteaz flüoresan sinyal proteaz bozulmasına karşı korunur. mitokondriyal protein tarafından verilen bir organel lümeni içinde yer alan bir membran alanı örnek olarak insan sitokrom C oksidaz alt-birimi VIII 18,19. pDsRed-Mit, Discosoma sp kırmızı flöresanlı proteinin. sitokrom C oksidaz sekans hedefleme mitokondriyal kaynaşmış kodlar. pDsRed-Mito ifade eden hücreler içinde, floresan sinyalinin hücre içinde görülmektedir. dijitonin geçirgenliği sonra, floresan sinyalinin pDSRed-Mito ile ilişkili sabit kalır. Ayrıca, proteinaz K, pDsRed-Mito devam ile bağlantılı floresan con ilave edildikten sonramitokondrilerde fluorofor ile tutarlı ve (Şekil 3) sitoplazmada maruz kalan ve bu nedenle proteaz aktivitesi karşı korumalı değildir. Hücre dışı Etki Olmayan geçirgen hücrelerin Proteaz işleme hızlı bir membran proteinine bağlı floresan parçası hücre dışına bakan bir floresan sinyalini gidermek gerekmektedir. glikozil (GPI) demirlemiş proteini PrP 20 mükemmel bir örnek olarak hizmet vermektedir. Sarı floresan proteini içeren bir yapı (YFP) Kudüs İbrani Üniversitesi&#39;nden, PrP (YFP-PrP) 21,22 Dr. Ehud Cohen cömert bir hediye amino ucuna bağlı. Tedavi proteaz önce, hücre dışı YFP floresan sinyal (Şekil 4) parlak oldu. Proteaz tedavisi sonrasında, hücre dışı floresan sinyali hızla kayboldu. Zaman Hususlar <p cleşek = &quot;jove_content&quot;&gt; Adım 2 transfekte hücrelerde protein ekspresyonunu tespit etmek için, hücre sayımı, transfeksiyon ve kaplama, ayrıca, 6-24 saat için bir saat gerektirir. 4-6 ön arıtma, digitonin ve proteaz eklemeler görüntü toplama lamel başına yaklaşık 20-30 dk gerektirir Adımları. Aşama 7, veri analizi ve sinyal niceleme örnek başına bir başka 10-30 dakika gerektirir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52509/52509fig1.jpg" /> Şekil 1: plazma zarının seçici permeabilizasyon deney protokolü geçmekte tek bir hücre gösteren FPP deneyi (a) Çizgi modeli.. kırmızı sembol sitozolde kırmızı floresan proteini (RFP) temsil, yeşil ve mavi semboller organel lümen (mavi) ya da sitoplazmada (yeşil) bakan ya floresan etiketi ile transmembran proteinleri temsil eder. (B) digitonin permeabilization ardından, serbest sitozolikproteinler RFP sinyali azaltarak, uzak yayılır. Mavi sinyal organel lümeninde varlığı ile bozulmaya karşı korunan ise proteinaz K uygulanmasının ardından, (c) sitosolik yeşil sinyal düşer. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52509/52509fig2.jpg" /> Şekil 2: Digitonin&#39;dir tedavisi, plazma membranı ve bültenleri sitosolik GFP permeabilizes tek bir hücre: (a) Çizgi önce ve dijitonin tedaviden sonra çözünür GFP&#39;yi tanımlayan.. (B) Digitonin tedavisi plazma zarı ve bültenleri sitozolik GFP permeabilizes. Faiz (ROI) bir bölge çözünür GFP sentezleyen CHO hücrelerinin etrafında çizilir. Digitonin (50 uM) ile muamele sonrasında, görüntü önce ve digitonin ilave edildikten sonra ve belirli zaman noktalarında alınmıştır. Ölçek çubuğu, 10 mikron. (C) fluore ölçümütam zamanlı serisi (af) olarak scence yoğunlukları gösterilmiştir. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52509/52509fig3.jpg" /> Şekil 3: SOP endosome protein LMTK2 topolojisini ortaya (a) LMTK2-GFP (yeşil topları) olarak DsRed kaybı (kırmızı topları) ama tutma gösteren FPP&#39;nin Karikatür proteinaz K uygulanmasına ilişkin sinyal kaybı ardından, digitonin geçirgenliği aşağıdaki. ., (b) DsRed ve LMTK2-GFP eksprese eden CHO hücrelerinin FPP deneyi. Görüntüler öncesi ve belirtildiği gibi, tedavi digitonin ve proteinaz K izledikten sonra alındı. Ölçek çubuğu: 10 mikron. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52509/52509fig4.jpg" /> Şekil 4 (a) önce ve proteinaz K tedavisi sonrası YFP PrP (yeşil) topolojisi ve konumunu gösteren Çizgi modeli. Sentezleyen CHO hücreleriYFP PrP 100 saniye için de proteinez K&#39;ya tabi tutuldu. (B) Çıkan öncesi ve proteaz muameleden sonra işaret edilen zamanlarda gösterilmiştir. YFP-PrP sinyali tamamen digitonin yokluğunda proteaz takip kayboldu. (C) &#39;de gösterilen nicelleştirilmesi için de kullanılabilecektir (ROI), Sarı Şekil bölgesi.

Watch this Scientific Journal Video about Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP at JoVE.com

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP.

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

determining-membrane-protein-topology-using-fluorescence-protease

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

17.7K Görüntüleme.  Chicago Medical School. Here, we present a protocol to determine the orientation and topology of integral membrane proteins in living cells. This simple protocol relies on selective protease sensitivity of chimeras between the protein of interest and GFP. 

Video: Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

Using a GFP-tagged TMEM184A Construct for Confirmation of Heparin Receptor Identity

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies against specific peptides within the predicted sequence allow some localization experiments. However, other possible interactions with the antibodies often cannot be excluded. This situation provided an opportunity to develop a set of assays dependent on the protein sequence. Specifically, a construct containing the gene sequence coupled to the GFP coding sequence at the C-terminal end of the protein was obtained and employed for these purposes. Experiments to characterize localization, ligand affinity, and gain of function were originally designed and carried out to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor1. In addition, the construct can be employed for studies addressing membrane topology questions and detailed protein-ligand interactions. The present report presents a range of experimental protocols based on the GFP-TMEM184A construct expressed in vascular cells that could easily be adapted for other novel proteins.

A construct encoding TMEM184A with a GFP tag at the carboxy-terminus designed for eukaryotic expression, was employed in assays designed to confirm the identification of TMEM184A as a heparin receptor in vascular cells.

Bir GFP etiketli TMEM184A kullanarak Heparin Reseptör Kimliğinin Onay için Construct

When novel proteins are identified through affinity-based isolation and bioinformatics analysis, they are often largely uncharacterized. Antibodies ...

Genetik

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the availability of enough area to perform the function. Nanodiscs are used to provide a membrane surface of controlled size and lipid content. In the absence of bound extrinsic proteins, sodium phosphotungstate-stained nanodiscs appear as stacks of coins when viewed from the side by transmission electron microscopy (TEM). This protocol is therefore designed to intentionally promote stacking; consequently, the prevention of stacking can be interpreted as the binding of the membrane-binding protein to the nanodisc. In a further step, the TEM images of the protein-nanodisc complexes can be processed with standard single-particle methods to yield low-resolution structures as a basis for higher resolution cryoEM work. Furthermore, the nanodiscs provide samples suitable for either TEM or non-denaturing gel electrophoresis. To illustrate the method, Ca2+-induced binding of 5-lipoxygenase on nanodiscs is presented.

Many proteins perform their function when attached to membrane surfaces. The binding of extrinsic proteins on nanodisc membranes can be indirectly imaged by transmission electron microscopy. We show that the characteristic stacking (rouleau) of nanodiscs induced by the negative stain sodium phosphotungstate is prevented by the binding of extrinsic protein.

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Biyokimya

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to identify and characterize their interactions are necessary5. To this end, we developed the Membrane Strep-protein interaction experiment, called Membrane-SPINE6. This technique combines in vivo cross-linking using the reversible cross-linker formaldehyde with affinity purification of a Strep-tagged membrane bait protein. During the procedure, cross-linked prey proteins are co-purified with the membrane bait protein and subsequently separated by boiling. Hence, two major tasks can be executed when analyzing protein-protein interactions (PPIs) of membrane proteins using Membrane-SPINE: first, the confirmation of a proposed interaction partner by immunoblotting, and second, the identification of new interaction partners by mass spectrometry analysis. Moreover, even low affinity, transient PPIs are detectable by this technique. Finally, Membrane-SPINE is adaptable to almost any cell type, making it applicable as a powerful screening tool to identify PPIs of membrane proteins.

Membrane-SPINE: A Biochemical Tool to Identify Protein-protein Interactions of Membrane Proteins In Vivo

A biochemical approach is described to identify in vivo protein-protein interactions (PPI) of membrane proteins. The method combines protein cross-linking, affinity purification and mass spectrometry, and is adaptable to almost any cell type or organism. With this approach, even the identification of transient PPIs becomes possible.

Membran-OMURGA: Membran Proteinleri protein-protein etkileşimleri belirlemek için bir Biyokimyasal Aracı<em&gt; In Vivo</em

Membrane proteins are essential for cell viability and are therefore important therapeutic targets1-3. Since they function in complexes4, methods to ...

Biyomühendislik

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, they are important drug targets. We have developed a magnetic-agarose-bead-based assay platform for the investigation of proteolytic activity, which is based on the use of recombinant fusion protein substrates. In order to demonstrate the use of this assay system, a protocol is presented on the example of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease. The introduced assay platform can be utilized efficiently in the biochemical characterization of proteases, including enzyme activity measurements in mutagenesis, kinetic, inhibition, or specificity studies, and it may be suitable for high-throughput substrate screening or may be adapted to other proteolytic enzymes.
In this assay system, the applied substrates contain N-terminal hexahistidine (His6) and maltose-binding protein (MBP) tags, cleavage sites for tobacco etch virus (TEV) and HIV-1 proteases, and a C-terminal fluorescent protein. The substrates can be efficiently produced in Escherichia coli cells and easily purified using nickel (Ni)-chelate-coated beads. During the assay, the proteolytic cleavage of bead-attached substrates leads to the release of fluorescent cleavage fragments, which can be measured by fluorimetry. Additionally, cleavage reactions can be analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). A protocol for the in-gel renaturation of assay components is also described, as partial renaturation of fluorescent proteins enables their detection based on molecular weight and fluorescence.

Here, we present the detailed procedure of a recently developed protease assay platform utilizing N-terminal hexahistidine/maltose-binding protein and fluorescent protein-fused recombinant substrates attached to the surface of nickel-nitrilotriacetic acid magnetic agarose beads. A subsequent in-gel analysis of the assay samples separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is also presented.

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Rapid Assessment of Membrane Protein Quality by Fluorescent Size Exclusion Chromatography

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different tags, truncations, deletions, fusion partner insertions, and stabilizing mutations to find one that is not aggregated after extraction from the membrane. Furthermore, buffer screening to determine the detergent, additive, ligand, or polymer that provides the most stabilizing condition for the membrane protein is an important practice. The early characterization of membrane protein quality by fluorescent size exclusion chromatography provides a powerful tool to assess and rank different constructs or conditions without the requirement for protein purification, and this tool also minimizes the sample requirement. The membrane proteins must be fluorescently tagged, commonly by expressing them with a GFP tag or similar. The protein can be solubilized directly from whole cells and then crudely clarified by centrifugation; subsequently, the protein is passed down a size exclusion column, and a fluorescent trace is collected. Here, a method for running FSEC and representative FSEC data on the GPCR targets sphingosine-1-phosphate receptor (S1PR1) and serotonin receptor (5HT2AR) are presented.

The present protocol describes a procedure to perform fluorescent size exclusion chromatography (FSEC) on membrane proteins to assess their quality for downstream functional and structural analysis. Representative FSEC results collected for several G-protein coupled receptors (GPCRs) under detergent-solubilized and detergent-free conditions are presented.

Floresan Boyut Dışlama Kromatografisi ile Membran Protein Kalitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

During membrane protein structural elucidation and biophysical characterization, it is common to trial numerous protein constructs containing different ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biyoloji

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level. There are several methods, both in vitro and in vivo, to evaluate protein binding, and at least two methods that complement the shortcomings of each other should be conducted to obtain reliable insights. 
For an in vivo assay, the bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assay represents the most popular and least invasive approach that enables to detect protein-protein interaction within living cells, as well as identify the intracellular localization of the interacting proteins 1,2. In this assay, non-fluorescent N- and C-terminal halves of GFP or its variants are fused to tested proteins, and when the two fusion proteins are brought together due to the tested proteins&#x2019; interactions, the fluorescent signal is reconstituted3-6. Because its signal is readily detectable by epifluorescence or confocal microscopy, BiFC has emerged as a powerful tool of choice among cell biologists for studying about protein-protein interactions in living cells 3. This assay, however, can sometimes produce false positive results. For example, the fluorescent signal can be reconstituted by two GFP fragments arranged as far as 7 nm from each other due to close packing in a small subcellular compartment, rather that due to specific interactions7.
Due to these limitations, the results obtained from live cell imaging technologies should be confirmed by an independent approach based on a different principle for detecting protein interactions. Co-immunoprecipitation (Co-IP) or glutathione transferase (GST) pull-down assays represent such alternative methods that are commonly used to analyze protein-protein interactions in vitro. However, iIn these assays, however, the tested proteins must be readily soluble in the buffer that supportsused for the binding reaction. Therefore, specific interactions involving an insoluble protein cannot be assessed by these techniques.
 Here, we illustrate the protocol for the protein membrane overlay binding assay, which circumvents this difficulty. In this technique, interaction between soluble and insoluble proteins can be reliably tested because one of the proteins is immobilized on a membrane matrix. This method, in combination with in vivo experiments, such as BiFC, provides a reliable approach to investigate and characterize interactions faithfully between soluble and insoluble proteins. In this article, binding between Tobacco mosaic virus (TMV) movement protein (MP), which exerts multiple functions during viral cell-to-cell transport8-14, and a recently identified plant cellular interactor, tobacco ankyrin repeat-containing protein (ANK) 15, is demonstrated using this technique.

Protein Membrane Overlay Assay: A Protocol to Test Interaction Between Soluble and Insoluble Proteins in vitro

Testing protein-protein interaction is indispensable for dissection of protein functionality. Here, we introduce an in vitro protein-protein binding assay to probe a membrane-immobilized protein with a soluble protein. This assay provides a reliable method to test interaction between an insoluble protein and a protein in solution.

Protein Membran Kaplama Testi: Çözünür ve çözünmez Proteinler Arasında Etkileşim Test Protokolü In vitro</em

Validating interactions between different proteins is vital for investigation of their biological functions on the molecular level.  There are several ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Determination of Plasma Membrane Partitioning for Peripherally-associated Proteins

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein using the profiles of fluorescence intensity across the plasma membrane. Measured fluorescence profiles are fitted by a model for membrane and cytoplasm fluorescence distribution along a line applied perpendicularly to the cell periphery. This model is constructed from the fluorescence intensity values in reference cells expressing a fluorescently-tagged marker for cytoplasm and with FM 4-64-labeled plasma membrane. The method can be applied to various cell types and organisms; however, only plasma membranes of non-neighboring cells can be evaluated. This fast microscopy-based method is suitable for experiments, where subtle and dynamic changes of plasma membrane-associated markers are expected and need to be quantified, e.g., in the analysis of mutant versions of proteins, inhibitor treatments, and signal transduction observations. The method is implemented in a multi-platform R package that is coupled with an ImageJ macro that serves as a user-friendly interface.

Here, we present a protocol to perform a quantitative analysis of the level of plasma-membrane association for fluorescently-tagged peripherally-associated protein. The method is based on the computational decomposition of membrane and cytoplasmic component of signal observed in cells labeled with plasma membrane fluorescent marker.

Plazma zarı periferik ilişkili proteinler için bölümleme belirlenmesi

This method provides a fast approach for the determination of plasma membrane partitioning of any fluorescently-tagged peripherally-associated protein ...

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A Technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins upon Detergent Solubilization

Source: Bird, L. E., et al. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52357">Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli</a>. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a fluorescence-detection size-exclusion chromatography technique to screen for green fluorescent protein (GFP)-fused membrane protein stability in Escherichia coli following detergent solubilization. Proteins exhibiting a symmetrical peak in the size-exclusion profile with little or no free GFP indicate purified proteins with minimum degradation and aggregation, which can subsequently be selected for structure-function analysis.

Floresan Algılama Boyut Dışlama Kromatografisi: Deterjan Çözündürmesi Üzerine Floresan Membran Proteinlerinin Bütünlüğünü Belirleme Tekniği

Source: Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)
In this ...

Floresan Proteaz Koruma Kullanma Membran Protein topolojisini belirlenmesi (FPP)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler