Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support. 
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z): 
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.

NOT: Tüm işlemler Royal Victorian Göz ve Kulak Hastanesi Hayvancılık Araştırma ve Etik Kurulu tarafından onaylandı (RVEEH AEC; # 10-199AB). konular Ulusal Sağlık ve (2013) ve &quot;Hayvanları Önleme Yasası&quot; Tıbbi Araştırma Konseyi &quot;Bakım ve Bilimsel Amaçlı Hayvan Kullanım Uygulama Avustralya Kanunu&quot; na göre tedavi edildi (ve değişiklikler 1986). Tüm cerrahi, klinik değerlendirme ve elektrofizyolojik işlemler anestezi altında gerçekleştirildi ve tüm çabaları acı en aza indirmek için yapılmıştır. 1. Enükleasyon ve Fiksasyon NOT: Varsa, cihaz kabloları veya vitrektomi liman çevresinde ekstra özen, arkadaşı yazının 16 ayrıntılı olarak açıklanmıştır enükleasyon ve tespit prosedürü uygulayın. Kısaca, bu içerir: <ol><li> Transcardially soğuk nötr Buffe ardından ılık tuzlu su ile konuyu serpmekKırmızı formalin. </li><li> Görülecek şekilde hizmet etmek için göz küresi dikişlerle bağlayın. </li><li> Cihaz kabloları ve herhangi bir ek yamaları / sekmeler muhafaza, göz 16 enükleasyonu. </li><li> 36 saat - 18 Davidson&#39;un çözeltide göz Post-düzeltmek. </li><li> 8 saat - 6 için% 50 etanol transfer. </li><li> Diseksiyon kadar% 70 etanol ve buzdolabında (4 ° C) aktarın. </li></ol> 2. Elektrot Kaldırma ve Diseksiyon. NOT: Tüm epiretina implantları aynı form faktörüne sahip olacak, ama genel olarak bir elektrot dizisi ve esnek ve uyumlu taşıyıcı malzeme çeşit olacaktır. Retina kopçalanmaktadır cihazlar, metal çakmak bunları bir arada tutan, dizi ve gözün arka nüfuz yapışma delik bulunmaktadır. <ol><li> Implant ve retina tutturulur noktayı tahayyül edin. <ol><li> 15 derecelik bıçak kullanarak çevresel trans-kornea kesi yapmak ve exp kornea kapağı çıkarınaltta yatan iris ve lens ose. </li><li> 15 derecelik bıçak kullanarak, epiretinal implant ve yerinde metal tack ile arka odasını açığa lensin zonüler lifleri disinsert ve toto lensi çıkarın. </li></ol></li><li> İmplant ve çalışma yapılmaktadır bağlı olarak, daha önce diseksiyonu yabancı bileşenlerini kaldırmak. NOT: Bu örnekte, değerlendirilmekte olan Epiretinal dizi bir konformal silikon taşıyıcı içine yerleştirilmiş bir prototip hermetik elmas elektrot ve elektronik paketin oluşuyordu (evde üretilen, 20 bakınız). <ol><li> Burada, dikkatli bir neşter ile ince diseksiyon ile elmas elektrot paketi ayıklayın. Retina yapışma ve platin kablo kalıntıları (Şekil 2) ile birlikte implantın silikon gövdesini bırakın. Gömülü bir dizi / konut soruşturma kapsamında cihaz tasarımının bir parçası değilse, o zaman bu adımı (2.2) ihmal. </li></ol></li><li> Dikkatliceİstenilen yönde yapışma ve çevresindeki doku içeren bir örnek teşrih. Sklera, koroid ve retina olmak üzere gözün arka, tam kalınlıkta şeritler kesmek için ince diseksiyon makas kullanın. Yapışma bitişik tüm retina tabakaları gösteren, bir yapışkanlık uzunlamasına kesitini verir, bir örneği ele alalım (Şekil 2) NOT: numune için istenen oryantasyon istenen belirli sonuç bağlı olarak değişebilir. Örneğin, eğer bir sonra optik diski numune dahil edilmelidir optik diske çakmak hasar yakınlığı incelemek istemektedir. </li></ol> 3. Dehidrasyon, Gömme, Montaj, Taşlama, Boyama ve Görüntüleme <ol><li> Ilerleyen etanol aşamalarında üç gün boyunca örnek kurutmak: <ol><li> Iki kez 2 saat boyunca% 70 etanol içinde örnek dihidrat. </li><li> O / N sonra iki kez 2 saat boyunca% 80 etanol içinde örnek kurutmak ve. </li><li> 2 saat TWIC için% 90 etanol içinde örnek kurutmakör. </li><li> O / N sonra iki kez 2 saat süre ile% 100 etanol içinde örnek kurutmak ve. </li></ol></li><li> Iki kez 2 saat süre ile% 100 aseton içinde örnek dihidrat. <ol><li> Aseton numuneyi çıkarın ve oda sıcaklığında hava-kurudukça bir ışık mikroskobu altında gözlemlemek. Epoksi örnek aktarın o / çöküşü kıvırmak başlar hemen önce (3.4 adıma bakın). NOT: çökmüş hücreleri ve büzülme yumuşak dokular sonuçlarından sıvı çıkarılması. Doku kıvırma / çöküşü oluştuğunda bir takdir tecrübesi ile geliştirilmiştir. </li></ol></li><li> Üreticinin talimatlarına göre bir tıbbi dereceli epoksi reçine hazırlanması. Reçinenin sertleştirilmesi için, 1 saat ya da oda sıcaklığında 24 saat boyunca ya da 55 ° C kullanın. Hava kabarcıklarının bertaraf edilmesi için 50 mbar&#39;da ° &#39;de ~ 5 dakika boyunca bir vakum odasına koyun. Kaynatın epoksi karışımı neden olur aşırı vakum gibi manuel vakum düzenler ve gaz alma etkili bir meydana gelmeyeceği NOT: Adım 3.2 ile eş zamanlı olarak adım 3.3 gerçekleştirin. </li><li> Samp gömnet epoksi reçine le. Uygun bir yapışmalı kapta gazı alınmış epoksi göz dokusunu daldırın ve O bırakın / N RT&#39;de tedavi. </li><li> Yeniden boyutlandırma ve terbiyeli epoksi blok yeniden gömerek istenen yönde (Şekil 2) numune embed özen gösterin. (- Şekil 3A sarı fincan) tiramolanın uzun eksen kalıp altına paralel odaklı olacak şekilde göz dokusunu içeren resized blok-embed yeniden. </li><li> Bir taşlama numune tutucu reçine monte ve öğütülmesine - silisyum karbür kağıdı kullanarak (230 manuel taşlama, su ile 250 rpm) (800 ızgara ile başlayan, Şekil 3C ve 3E). </li><li> Boyama için, 3 toluidin mavisi boyası zemin yüzeyi daldırma - 5 dakika, ya da leke gelişene kadar (Şekil 3F). </li><li> Musluk suyu (Şekil 3G) ile durulayın. </li><li> Görüntü bir yüksek güç diseksiyon kapsamında numune zemin yüzeyi hücresel katmanları görselleştirmek içinRetina (Şekil 3H). Hava-epoksi arayüzünde kırınım pürüzsüz numune üzerinde epoksi üst yüzeyi üzerinde damıtılmış bir damla su uygulanır. Örnek aydınlatmak için bir optik fiber &#39;boyun&#39; ışık kaynağı kullanın. </li><li> Bir numunenin önceden ayarlanmış kalınlığı uzak taşlama her zaman (numune tutucu minimum hassas ve tekrarlanabilir taşlama artış 20 mikron), 3.9 - 3.6 tekrarlayın adımları. </li></ol>

<ol>
	<li>Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+prostheses+for+the+blind.">Visual prostheses for the blind.</a> Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).</li><li>Santos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preservation+of+the+inner+retina+in+retinitis+pigmentosa.">Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).</li><li>Humayun, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visual+perception+in+a+blind+subject+with+a+chronic+microelectronic+retinal+prosthesis.">Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis.</a> Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).</li><li>Roessler, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiographic+findings+folowing+tack+fixation+of+a+wireless+epiretinal+retina+implant+device+in+blind+RP+patients.">Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).</li><li>Chow, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+artificial+silicon+retina+microchip+for+the+treatment+of+vision+loss+from+retinitis+pigmentosa.">The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa.</a> Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).</li><li>Zrenner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subretinal+electronic+chips+allow+blind+patients+to+read+letters+and+combine+them+to+words.">Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words.</a> Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).</li><li>Fujikado, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+of+semichronically+implanted+retinal+prosthesis+by+suprachoroidal-transretinal+stimulation+in+patients+with+retinitis+pigmentosa.">Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).</li><li>Saunders, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+surgical+procedure+for+implantation+of+a+prototype+suprachoroidal+retinal+prosthesis.">Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis.</a> Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).</li><li>Lee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+microelectrode+arrays+for+artificial+retinal+implants+using+liquid+crystal+polymers.">Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).</li><li>Sakaguchi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transretinal+electrical+stimulation+with+a+suprachoroidal+multichannel+electrode+in+rabbit+eyes.">Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes.</a> Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).</li><li>Majji, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+histological+and+electrophysiological+results+of+an+inactive+epiretinal+electrode+array+implantation+in+dogs.">Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).</li><li>Walter, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+implantation+of+electrically+inactive+epiretinal+microelectrode+arrays+in+rabbits.">Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits.</a> Retina. 19, 546-552 (1999).</li><li>Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prolonged+stimulation+at+the+electrode-retina+interface.">Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).</li><li>Colodetti, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+of+damaging+electrical+stimulation+in+the+retina.">Pathology of damaging electrical stimulation in the retina.</a> Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+Electrical+Stimulation+with+a+Suprachoroidal+Retinal+Prosthesis:+A+Preclinical+Safety+and+Efficacy+Study.">Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study.</a> PLoS One. 9, e97182 (2014).</li><li>Nayagam, D. A. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+Processing+Eyes+Implanted+With+a+Retinal+Prosthesis+for+Localized+Histopathological+Analysis.">Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).</li><li>Laube, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+surgical+techniques+for+implantation+of+a+wireless+intraocular+epiretinal+retina+implant+in+Gottingen+minipigs.">Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs.</a> Graefe's Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).</li><li>Gerding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+evaluation+of+intraocular+titanium+tacks+for+the+mechanical+stabilization+of+posterior+segment+ocular+implants.">Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants.</a> Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).</li><li>Seo, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+retinal+tack+for+the+epiretinal+&#64257;xation+of+the+polyimide+electrode+array.">Silicon retinal tack for the epiretinal &#64257;xation of the polyimide electrode array.</a> Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).</li><li>Hadjinicolaou, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+of+retinal+ganglion+cells+with+diamond+and+the+development+of+an+all+diamond+retinal+prosthesis.">Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis.</a> Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).</li><li>Briggs, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+round+window+and+cochleostomy+approaches+with+a+prototype+hearing+preservation+electrode.">Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode.</a> Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).</li><li>Shepherd, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cochlear+implant+electrode+array+for+use+in+experimental+studies.">An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies.</a> Hear Res. 277, 20-27 (2011).</li><li>Tykocinski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+electrode+position+in+the+human+cochlea+using+various+perimodiolar+electrode+arrays.">Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays.</a> Am J Otol. 21, 205-211 (2000).</li><li>Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+imaging+and+3D+reconstruction+of+mammalian+cochlea+by+fluorescent+confocal+microscopy.">A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy.</a> Brain Res. 1000, 200-210 (2004).</li></ol>

Authors have nothing to disclose. Irfan Durmo is an employee of Cochlear Ltd.

Standart histolojik teknikler nedeniyle, metal, cam ya da elmas bıçakları ile bu nesneleri kesme sınırlamalara yerinde sert metal implantları işleme koyamıyoruz. Bizim arkadaşı kağıdı 16, biz bir modifiye bütün göz tespit tekniği kullanılması artefakt retina Delaminasyonu azaltabileceğini gösterdi. Mevcut yazıda, bir taşlama kurdu ve yerinde 21-23 retina protezler için modifiye edilmiş koklear implant görselleştirmek için teknik parlatma. Retinaya bir elektrot dizisi sabitlemek için kullanılan bir titanyum çakmak, epiretinally, çevredeki göz dokusu ile birlikte epoksi gömülü edildi. Bu reçine bloğu daha sonra metal tack hemen bitişiğinde doku morfolojisi ortaya çıkarmak için uygun odaklı ve giderek zemin / cilalı oldu. Çeşitli derinliklerde bloğun cilalanmış yüzeyinin görüntüleri güçlü bir diseksiyon mikroskobu ile alınmıştır. Görselleştirilmesi ve değerlendirme,: Bu teknik için kullanışlıdırEpiretinal implanta komşu doku yanıtı ing; İmplant implantasyonu ile ilişkili cerrahi travmayı değerlendirmek için; Sert metal bileşenleri biyolojik reaksiyonu belirlemek için; ve implantın ve retina yüzeyi arasındaki mesafeyi ölçmek için. Bu teknik gözünde retina yapışma veya diğer sert (örneğin, metalik) nesnelerin bitişik bölgenin yerinde görselleştirme için gelecekte güvenlik çalışmalarında yararlı olacaktır. Bu epiretinally retinaya tutturdu protezlerin klinik öncesi güvenliğini değerlendirmek doğrudan uygulama vardır. Aynı zamanda, alt retina konumda implantlar ile temas içinde retina bölgelerinde doku hasarını değerlendirmek için yararlı olabilir. Tekniği doğru yapılmış olduğunu doğrulamak için çeşitli yollar vardır. Her aşamada, retina gözün dış katmanlara bağlı kalmalıdır. Brüt artefakt retina dekolmanı varsa, bu Hindu olabilirtespitle ilgili bir sorun yedik. Örnek gömülü olduğu ve bloğun taşlama-yüzü ile ortogonal yakın olmalıdır retina engellemek son reçine içinde odaklı yeniden zaman; Bu eğik kesme minimize edecektir. Bu (örneğin bir retina yapışma gibi) bir nesneyi hareket için gerekli (bilinen adım boyutu) artan öğütme adım sayısı nesnesinin boyutları ile buna bağıntılı olduğunu kontrol etmek yararlıdır. Teknik, birkaç şekilde optimize edilebilir. Öğütme işlemi ile bağlantılı epoksi bloğun yüzeyinde çizikler tedricen daha ince dereceli parlatma ile azaltılabilir. Bu çalışma için, biz 800, 1000, 1200, 2400, ve 4000 grade silikon karbür kağıdı kullanıldı. Elmas macun ayrıca, yüzey geliştirmek için kullanılabilir. Bir ince yüzey yüksek kaliteli görüntü verir ama ek parlatma zaman pahasına. Bu tekniğin sonuçlarını iyileştirmek için bir başka kritik husus opti seçim ve kalitesics ve aydınlatma görüntü yakalama için kullanılan. Diğer temel histolojik lekeleri - özellikle Nissl lekeleri, toluidin mavisi yerine kullanılabilir, ancak daha da optimizasyon ihtiyacı olabilir. Bazı lekeler reçine yanı sıra doku (örneğin, Eosin), bu nedenle sığ bir lehçe arka plan renk değişimi kaldırmak için boyama sonrası gerekebilir leke olacaktır. Uzman lekeler, flüoresan boyalar ve immünohistokimyasal teşebbüs değildi, ama çok özel bir sonuç arzu edildiği takdirde, her bir taşlama seviyesinde bu lekeleri gerçekleştirmek için gereken zaman engelleyici olması muhtemeldir. Bununla birlikte, yerleştirme basamak (adım 3.4) 24 önce, bir bütün olarak doku leke mümkün olabilir. Bu tekniğin ana sınırlama bu nedenle taşlama ve parlatma her aşamasında büyütme çeşitli birçok (muhtemelen gereksiz) görüntüleri yakalamak için ihtiyatlı olduğunu, ilgi bölgesi uzak zemin edildikten sonra, bu alınamaz olmasıdır. ÖyleAyrıca önemli her taşlama derinlik ayarı için küçük artışlarla kullanmak için. Bu tekniğin bir başka sınırlama olduğu dokuya cam slayt üzerine monte edilmiş ve bir standart (iletim) ışık mikroskobu ile inceledi ile karşılaştırıldığında optik büyütme ve çözünürlük. Prototip ve yeni bir implant cihazının güvenliğini değerlendirmek amacıyla, brüt patolojik değerlendirme birincil ilgi olduğunu. Bu teknik, bir retina yapışma ile ilişkili klinik olarak önemli hasar gözlemlemek için etkili bir yöntem sağlar. Uygulamada, eziyet, cila toplamak ve (bir zamanlar gömülü) verilen örnek fotoğraflamak için gerekli genel Zamanla bu bölümüne bir parafin blok veya dondurulmuş bölümü alacağını zaman karşılaştırılabilir. Retina implantların kapsamı dışında uygulamalara uzatılabilir mevcut tekniklerin potansiyeli de vardır. Bu teknik, implant ekstre feasib olmayan bir sabit implant bitişik doku değerlendirmek için uygundurle veya arayüz zarar olacaktır. Örneğin, bu yöntem, ilaç iletimi için derin beyin ya da periferal sinir elektrot kanüller gibi geleneksel histolojik teknikler ile kesilemezler metal (örneğin, platin, nitinol, vs.) yapılmış implantlar değerlendirmek için genişletilebilir, vasküler stentler veya ortopedik protezler.

Retinitis pigmentosa (RP) nöral aktivitenin içine, fotonların şeklinde, ışık transdüklenmesinden sorumlu retinanın en dış tabakasındaki hücreler olan fotoreseptör, yaygın kaybına neden olur kalıtsal bir hastalıktır. Önemlisi, RP hastalar genellikle hala işlevsel onların retinanın diğer katmanları artık nöronlar var. Retina protezleri görsel yolu 1,2 etkinleştirmek için elektrik stimülasyonu ile bu hayatta nöronlar hedefleyerek bu hastalara bazı sınırlı vizyon geri yeteneğine sahiptir. Klinik çalışmalarda Algısal sonuçları erken dönem sonuçları umut verici gösterilmiştir ve son zamanlarda bazı cihazlar ticari kullanım için onaylanmıştır. Subretinally 5,6 ve 7,8 suprachoroidally epiretinally 3,4,: Şu anda, üç ana anatomik klinik retina protezleri yerleştirilmiş edildiği yerleri vardır. Farklı cihazlar farklı malzemeler kullanmak ve onların formu özelleştirilmişOnlar implante edildiği yere. Ancak, tüm elektrik darbeleri ile retinanın kalan nöronlar aktive ederek görsel gözlemleri oluşturun. Herhangi bir tıbbi protez nedeniyle ilk yerleştirme mekanik etkilere veya sonradan devam eden kuvvetler çevre dokulara zarar için potansiyeli vardır. Retinal protezler gibi implante uyarıcıları, durumunda, elektriksel parametre güvenli sınırlar içinde olması gereken ek bir düşünce de bulunmaktadır. Hasta güvenliği her şeyden önemlidir, bu nedenle cihazların titizlikle klinik 9-15 ayar geçmeden önce preklinik çalışmalarda test edilmelidir. Bizim tamamlayıcı madde olarak, suprakoroidal boşluk 16 içinde yer alan bir implant çevreleyen göz lokalize histopatolojik değerlendirilmesi için bir yöntem açıklamıştır. Bu yazıda, (fe bir klinik öncesi de epiretinally retinaya tutturdu bir elektrot dizisi, çevredeki göz dokusunu görselleştirmek için bir teknik tarifçizgi) modeli (Şekil 1). Epiretinal konumu görsel protez bulmak için en sık kullanılan konumdur. Burada yer alan elektrot diziler genellikle göz 17-20 tüm katmanları nüfuz metal tack ile retina yapıştırılmıştır. Önce bu yazıda anlatılan teknikleri, doğru bir retinal ve hemen bir yapışmaya çevreleyen diğer dokulara değerlendirmek zor oldu. Nötr tamponlu formalin kullanarak standart göz fiksasyon nedeniyle tack sabit noktaya karşı retina ve sklera diferansiyel hareketine artefakt retina hasarına neden olmuştur. Bu nedenle tack ve Epiretinal dizi kaynaklanan herhangi bir gerçek hasar doğru tespit edilemedi. Metal nesneler kolayca geleneksel histolojik aparatı ile kesilmiş olamaz Buna ek olarak, göz dokusu kesit yerinde retina yapışma ile yapılabilir olamazdı; histolojik işlem de önce yapışma çıkarmadanBu da suni retina hasara yol açtı gibi istenmeyen. Bu çalışmanın iki amacı vardı: yapışma ve Epiretinal implant dizi kaynaklanan herhangi bir hasar güvenilir değerlendirilebilir böylece 1) retina dekolmanı eseri azaltmak için; ve 2) çıkarmadan tack bitişik retina mimari görselleştirmek için. Suni retina delaminasyona azaltır, (yardımcı madde 16 de tarif edildiği gibi) amaca 1 elde etmek için, yeni bir tespit tekniği kullanılmıştır. Amaca 2 elde etmek amacıyla, taşlama ve başlangıçta koklear implant elektrotlar 21-23 in situ gözlenmesi için geliştirilen tekniği, parlatma, bir gömme modifiye. artefakt retina hasarı en aza indirmek ve bu nedenle yapışma ve Epiretinal dizi neden olası hasar doğru değerlendirilmesini izin verirken, bu yazıda anlatılan yöntemler yerinde bir çivinin çevreleyen retina görselleştirme ve bitişik sağlar.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Chem-Supply</td><td>AA008</td><td>Propanone BHD Medical grade</td></tr><tr><td>Epo-Tek 301 Epoxy</td><td>Epoxy Technology</td><td>Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70-75% v/v</td><td>Merck PTY LTD</td><td>4.10261</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Merck PTY LTD</td><td>90143</td><td>Alcohol</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3260</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine Tetraacetic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TegraPol grinding/polishing machine</td><td>Struers</td><td>TegraPol-25</td><td></td></tr><tr><td>AccuStop specimen holder</td><td>Struers</td><td>Accustop</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Leica</td><td>MZ16</td><td></td></tr><tr><td>Objective lens</td><td>Leica</td><td>2.0x Planapo Objective</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope Camera</td><td>Leica</td><td>DFC-420C</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Software</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>Application Suite v4.1.0</td><td></td></tr></tbody></table>

techniques for processing eyes implanted with a retinal prosthesis for localized histopathological analysis: part 2 epiretinal implants with retinal tacks

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.

tespit protokolü esas artefakt dekolmanı ve retina 16 delaminasyonuna azalır. Epoksi bloğu içinde numunenin Yönlendirme tarif edilen iki adımlı gömme işlemi kullanılarak sürekli olarak elde edildi. artan öğütme işlemi en iyi sonuçları elde etmek için el becerisi orta düzeyde gerekli ama artım çözünürlüğü üzerinde ince kontrol sağlamıştır ayarlanabilir numune tutucu tarafından destekli. Tüm durumlarda (n = 5) çakmak bulunan ve oldu toprak / arzu ve tutarlı sonuçlar ile parlatılır. çiviler bitişik retinae çözülebilir ve uygun bir şekilde boyanmıştır. Bir notu P # 800 silisyum karbür kağıdı ile epoksi reçine bloğun yüzeyi parlatılması gömülü doku hücresel makro görüntü yeterli oldu. Daha yüksek dereceli kağıt, veya elmas harç madde de eğer istenirse, herhangi bir derinlikte parlatmak için kullanılabilir. Bir diseksiyon mikroskobu ve fiber optik &#39;boyun&#39; aydınlatabilirizt kaynak plan bloğu ve gömülü doku numunesinin yüzeyi görüntülenmesi için uygun olduğu bulunmuştur. ışık kaynağının konumu mikroskop ile en iyi aydınlatma ve kontrast verdi konum ve açı bulmak için deneme yanılma yoluyla değiştirilmiştir. Bloğun yüzeyine damıtılmış bir damla su ekleyerek, örnek olarak öncelikle epoksi- hava ara-yüzü en açık yolu difraksiyonu ve / veya düz bozuklukları azaltmak için yararlı olmuştur. Şekil 4, bir titanyum retina hemen bitişik görsel retina dokusunun, örneğin görüntüler gösterir Bu tekniği kullanarak çakmak. Sigara suni retina dekolmanı ve katlanır silikon (Şekil 4A) her iki tarafında görülebilir. çakmak mili silikon gömülü görünür; tack baş retina ve sklera nüfuz etmiştir. Silikon (Şekil 4C) lekelenmemiş retina iki tarafında olmayan suni retina dekolmanı bulunmaktadır. teknik Ther, bu durumda, bu göstermiştirE nedeniyle eğik bir ekleme açısına bir tarafında retina yapışma ve sıkıştırma bitişik retina düzensizlik olduğunu. Sunulan görüntüler, sadece tekniği değil, genel olarak çakmak-zarar histopatolojik temsilcisi başarı çizimler olduğunu unutmayın. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52348/52348fig1highres.jpg" /> Epiretinal elektrot dizisinin Şekil 1. Yerleştirme. (A) posterior sklera, koroid ve retina dejenere (fotoreseptörleri eksik) büyütülmüş kesitini gösteren gözün şematik. Bir elektrot dizisi. Epiretinally yapıştırılmış, mavi tasvir Epiretinal elektrot dizisinin (B) Bilgisayar destekli çizim-almaktadır. Bir entegre devre (&#39;çip&#39;) ve elektrot paketi; b titanyum retina yapışma; c tıbbi silikon konut; d kurşun çıkış noktası. Panel A, bir orijinal illustrati modifiyeBiyonik Vizyon Avustralya, telif hakkı Beth Croce verilen nezaket üzerinde. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52348/52348fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52348/52348fig2highres.jpg" /> Şekil 2. Elektrot kaldırma ve göz diseksiyonu. Yerinde Epiretinal yapışma ile enüklee kedi göz Yüksek dinamik aralık makro fotoğraflar. (A) Davidson&#39;un fiksatif ile Mesaj tespit retina mimari 16 korumak için, çıkarılan göz disseke edildi. elektrot dizisi paketi silikon taşıyıcı çıkarıldı geri kalan implantın yapışma (ok) ve silikon gövdeli (kesikli kare dış hatlıdır elektrot dizisinin orijinal konumunu gösterir). (B), göz bitişik uzunlamasına bir kesite sahip kesitlere ayrılmıştır çakmak(Kesikli çizgi). çakmak Göz yuvası (ok) posterior duvarında gömülü kalır, sklera ile ağırlıklı olarak stabilize. Kaldırılan elektrot dizi altındaki retina içeren bölüm standart histolojik işlemler 16 (sol segment) için hazırlanan ise yapışma içeren doku bölümünde, reçine gömme ve taşlama (sağ kesimi) için hazırlanmıştır. 0.5 mm&#39;lik artışlarla birlikte bir cetvel her panelin alt kenarında gösterilir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52348/52348fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52348/52348fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Epoksi gömülmesi ve yapışma ve retina dokusunun taşlama. Gömülü epoksi fotoğrafları ve hizalanmış doku örneği, taşlama, boyama ve yapışma ve retina dokusunun görüntüleme. (A) tac<html> k örnek bir epoksi reçine blok gömülü edildi. Kalıp kullanarak, numune uzunlamasına düzlem kalıbın dibine paralel olacak şekilde yönlenmiştir. Öğütme (B) yapışma numunesini ihtiva eden vulkanize epoksi bloğu. (C), epoksi blok bir öğütme numune tutucuya monte edilmiştir, hazır . (D) örnek zemin dokusunun yani görüntülü bölümleri retina hücresel katmanları ve yapışma boyuna ekseni ihtiva odaklı edildi. (E) örnek bir döner taşlama silisyum karbür kağıt kullanarak zemin oldu. (F) zemin yüzeyi Blok retina katmanları tespit etmek toluidin mavisi ile lekelenmiştir. (G) blok Boya fazlasını uzaklaştırmak için musluk suyu ile durulandı. (H), mavi lekeli retina tabakalar ve yapışmayan bir yüksek güçlü diseksiyon kapsamı kullanılarak görüntülenmiştir toluidin. reklam / 52.348 / 52348fig4highres.jpg &quot;/&gt; Yapışma ve retinanın Şekil 4. yüksek ve düşük güç görüntüler. Çeşitli noktalarda taşlama işlemi sırasında görüntü çakmak (yıldız işareti) uzunlamasına bölümleri (&#39;S&#39; sklera göz nüfuz ve çıkarken gösteren bir diseksiyon kapsamı ile alınmıştır ), silikon (hash) ve lekeli toluidin mavisi ve lekesiz retina (&#39;R&#39;) bitişik. Bu örnek görüntüler sadece mevcut görselleştirme tekniği göstermek için vardır, ve tüm Epiretinal implant veya çakmak ekleme histoloji sonuçları temsilcisi değildir unutmayın. Platin kablolama zemin kalıntıları panelleri AD (&#39;W&#39;) görebilir. (A) Düşük güç, retina ve sklera nüfuz tiramolanın lekesiz görüntüsü. (B) retina dekolmanı Yüksek enerjili görüntü ve lekesiz retina bitişik katlanır çakmak şaftının merkezinde görüntü A. (C) Düşük güç görüntüde silikon taşıyıcı. <strong&gt; (D) Ayrı bir örnekte görüntü C (E) tack merkezinin Yüksek güç görüntüsü, hiçbir silikon taşıyıcı ile, çakmak kabzası altında toluidin mavisi lekeli retina yüksek enerjili görüntü hemen önce, gösterilir . yapışmayan milini (F) Normal toluidin blue ile boyanan retina mimari taşlama (GCL: retina ganglion hücre tabakası, INL: iç nükleer tabaka; onl: Dış nükleer tabaka; PR: fotoreseptör T: kedi Tapetum lucidum) aynı taşlama tekniği kullanılarak görüntülendi . Her paneldeki Ölçek çubukları: A ve C = 2 mm; B ve D = 500 mm; E = 200 mikron; F 100 mikron =.

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks at 

Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.

Lokalize Histopatolojik Analiz için bir Retina Protez ile implant İşleme Teknikleri Gözler için: Bölüm Retina Tacks ile 2 Epiretinal İmplantlar

Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices ...

techniques-for-processing-eyes-implanted-with-retinal-prosthesis-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

11.5K Görüntüleme.  Bionics Institute. Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis. 

Video: Techniques for Processing Eyes Implanted with a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis: Part 2 Epiretinal Implants with Retinal Tacks

Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Retina Pigment Epitel Fizyoloji ve Patofizyoloji Çalışma Deneysel Modeller

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Nörobilim

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Tıp

Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis

With the recent development of retinal prostheses, it is important to develop reliable techniques for assessing the safety of these devices in preclinical studies. However, the standard fixation, preparation, and automated histology procedures are not ideal. Here we describe new procedures for evaluating the health of the retina directly adjacent to an implant. Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. Previous methods have not been able to spatially localize the ocular tissue adjacent to individual electrodes within the array. In addition, standard histological processing often results in gross artifactual detachment of the retinal layers when assessing implanted eyes. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by implantation and stimulation of an implanted electrode array. Therefore, we developed a method for identifying and localizing the ocular tissue adjacent to implanted electrodes using a (color-coded) dye marking scheme, and we modified an eye fixation technique to minimize artifactual retinal detachment. This method also rendered the sclera translucent, enabling localization of individual electrodes and specific parts of an implant. Finally, we used a matched control to increase the power of the histopathological assessments. In summary, this method enables reliable and efficient discrimination and assessment of the retinal cytoarchitecture in an implanted eye.

Techniques for visualizing retinal cytoarchitecture directly adjacent to individual electrodes within a retinal stimulator.

Lokalize histopatolojik analizi için bir Retina Protez ile implant İşleme Gözler Teknikleri

With  the recent development of retinal prostheses, it is important to develop  reliable techniques for assessing the safety of these devices in ...

A Protocol to Evaluate and Quantify Retinal Pigmented Epithelium Pathologies in Mouse Models of Age-Related Macular Degeneration

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal pigmented epithelium (RPE) is a key pathobiological event in AMD. To understand the mechanisms that lead to RPE dysfunction, mouse models can be utilized by researchers. It has been established by previous studies that mice can develop RPE pathologies, some of which are observed in the eyes of individuals diagnosed with AMD. Here, we describe a phenotyping protocol to assess RPE pathologies in mice. This protocol includes the preparation and evaluation of retinal cross-sections using light microscopy and transmission electron microscopy, as well as that of RPE flat mounts by confocal microscopy. We detail the common types of murine RPE pathologies observed by these techniques and ways to quantify them through unbiased methods for statistical testing. As proof of concept, we use this RPE phenotyping protocol to quantify the RPE pathologies observed in mice overexpressing transmembrane protein 135 (Tmem135) and aged wild-type C57BL/6J mice. The main goal of this protocol is to present standard RPE phenotyping methods with unbiased quantitative assessments for scientists using mouse models of AMD.

Mouse models can be useful tools for investigating the biology of the retinal pigmented epithelium (RPE). It has been established that mice can develop an array of RPE pathologies. Here, we describe a phenotyping protocol to elucidate and quantify RPE pathologies in mice using light, transmission electron, and confocal microscopy.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Age-related macular degeneration (AMD) is a debilitating retinal disorder in aging populations. It is widely believed that dysfunction of the retinal ...

Genetik

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

Biyoloji

Microsurgical Dissection and Tissue Clearing for High Resolution Intact Whole Retina and Vitreous Imaging

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole retina imaging techniques compared to conventional retinal flat mount preparations and sections. However, immunofluorescent imaging of intact whole retina is hindered by the opaque coatings of the eyeball, i.e., sclera, choroid, and retinal pigment epithelium (RPE) and the light scattering properties of retinal layers that prevent full thickness high resolution optical imaging. Chemical bleaching of the pigmented layers and tissue clearing protocols have been described to address these obstacles; however, currently described methods are not suitable for imaging endogenous fluorescent molecules such as green fluorescent protein (GFP) in intact whole retina. Other approaches bypassed this limitation by surgical removal of pigmented layers and the anterior segment of the eyeball allowing intact eye imaging, though the peripheral retina and hyaloid structures were disrupted. Presented here is an intact whole retina and vitreous immunofluorescent imaging protocol that combines surgical dissection of the sclera/choroid/retina pigment epithelium (RPE) layers with a modified tissue clearing method and light sheet fluorescent microscopy (LSFM). The new approach offers an unprecedented view of&#160;unperturbed vascular and neuronal elements of the retina as well as the vitreous and hyaloid vascular system in pathologic conditions.

Presented here is a protocol for intact whole retina imaging in which the outer opaque/pigmented layers of the eyeball are surgically removed, and optical clearing is applied to render retina transparent enabling the visualization of the peripheral retina and hyaloid vasculature in intact retina using light sheet fluorescent microscopy.

Neuronal and vascular structures of the retina in physiologic and pathologic conditions can be better visualized and characterized by using intact whole ...

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in retinal diseases, and testing therapeutic interventions. The ex vivo electroretinogram (ERG) allows the quantification of contributions from individual cell types in the isolated retina by addition of specific pharmacological agents and evaluation of tissue-intrinsic changes independently of systemic influences. Retinal light responses can be measured using a specialized ex vivo ERG specimen holder and recording setup, modified from existing patch clamp or microelectrode array equipment. Particularly, the study of ON-bipolar cells, but also of photoreceptors, has been hampered by the slow but progressive decline of light responses in the ex vivo ERG over time. Increased perfusion speed and adjustment of the perfusate temperature improve ex vivo retinal function and maximize response amplitude and stability. The ex vivo ERG uniquely allows the study of individual retinal neuronal cell types. In addition, improvements to maximize response amplitudes and stability allow the investigation of light responses in retina samples from large animals, as well as human donor eyes, making the ex vivo ERG a valuable addition to the repertoire of techniques used to investigate retinal function.

Optimizing the Setup and Conditions for Ex Vivo Electroretinogram to Study Retina Function in Small and Large Eyes

Modification of existing multielectrode array or patch clamp equipment makes the ex vivo electroretinogram more widely accessible. Improved methods to record and maintain ex vivo light responses facilitate the study of photoreceptor and ON-bipolar cell function in the healthy retina, animal models of eye diseases, and human donor retinas.

Ex Vivo Elektroretinogramın Küçük ve Büyük Gözlerde Retina Fonksiyonunu İncelemesi için Kurulum ve Koşulların Optimize Edilmesi

Measurements of retinal neuronal light responses are critical to investigating the physiology of the healthy retina, determining pathological changes in ...

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic nerve and retinal ganglion cell (RGC) degeneration, resulting in visual dysfunction by interrupting the transmission of visual information from the eye to the brain. Elevated intraocular pressure is the most important risk factor; thus, several models of ocular hypertension have been developed in rodents by either genetic or experimental approaches to investigate the causes and effects of the disease. Among those, some limitations have been reported such as surgical invasiveness, inadequate functional assessment, requirement of extensive training, and highly variable extension of retinal damage. The present work characterizes a simple, low-cost, and efficient method to induce ocular hypertension in rodents, based on low-temperature, full-circle cauterization of the limbal vascular plexus, a major component of aqueous humor drainage. The new model provides a technically easy, noninvasive, and reproducible subacute ocular hypertension, associated with progressive RGC and optic nerve degeneration, and a unique post-operative clinical recovery rate that allows in vivo functional studies by both electrophysiological and behavioral methods.

The goal of this protocol is to characterize a novel model of glaucomatous neurodegeneration based on 360&#176; thermic cauterization of limbal vascular plexus, inducing subacute ocular hypertension.

Kemirgenlerde Cerrahi Olarak İndüklenen Glokom için Limbal Vasküler Pleksusun Tam Daire Koterizasyonu

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Characterization of a Novel Human Organotypic Retinal Culture Technique

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal pigment epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera, the integrity of the fragile retina can easily be compromised. The aim of this study was to develop a novel HORC model that contains the retina, RPE-choroid and sclera to maintain retinal integrity when culturing retinal explants.
After cutting circumferentially along the limbus to remove iris and lens, four deep incisions were made to flatten the eyecup. In contrast to previous HORC protocols, a trephine was used to cut through not only the retina but also the RPE-choroid and sclera. The resultant triple-layered explants were cultured for 72 h. Hematoxylin and Eosin staining (H&#38;E) was used to assess anatomical structures and retinal explants were further characterized by immunohistochemistry (IHC) for apoptosis, M&#252;ller cell integrity and retinal inflammation. To confirm the possibility of disease induction, explants were exposed to high glucose (HG) and pro-inflammatory cytokines (Cyt), to mimic diabetic retinopathy (DR). The Luminex magnetic bead assay was used to measure DR-related cytokines released into the culture medium.
H&#38;E staining revealed distinct retinal lamellae and compact nuclei in retinal explants with the underlying RPE-choroid and sclera, while retinas without the underlying structures exhibited reduced thickness and severe nuclei loss. IHC results indicated absence of apoptosis and retinal inflammation as well as preserved M&#252;ller cell integrity. The Luminex&#160;assays showed significantly increased secretion of DR-associated pro-inflammatory cytokines in retinal explants exposed to HG + Cyt relative to baseline levels at 24 h.
We successfully developed and characterized a novel HORC protocol in which retinal integrity was preserved without apoptosis or retinal inflammation. Moreover, the induced secretion of DR-associated pro-inflammatory biomarkers when exposing retinal explants to HG + Cyt suggests that this model could be used for clinically translatable retinal disease studies.

This study aims to develop a novel human organotypic retinal culture (HORC) model that prevents compromising retinal integrity during explant handling. This is achieved by culturing the retina with the overlying vitreous and the underlying retinal pigment&#160;epithelium-choroid (RPE-choroid) and sclera.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Previous human organotypic retinal culture (HORC) models have utilized detached retinas; however, without the structural support conferred by retinal ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Büyük gözlü manken coğrafi Atrofi, içine insan embriyonik kök hücre elde edilen retina Pigment epitel hücrelerinin subretinal nakli

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...