Name: fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-µcp) and sequential nucleophilic substitution
Uploaded: 2014-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Funding for this work, GTK, TK, and JDM were provided by the Wisconsin Institute for Discovery and the Wisconsin Alumni Research Foundation.

1. Yaratma Elastomerik Pullar <ol style="margin-left: 40px;"><li> PDMS damgası en silikon ustaları oluşturmak için, bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılarak PhotoMask metraj desenleri. <ol><li> 300 mikron iç çapı (ID) ve 1,200 mikron merkez-merkez aralığı ile 600 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ilk desen tasarlayın. </li><li> 600 mikron kimliği ve 1200 mikron merkez-merkez aralığı ile 900 mikron OD ile annuli 20 x 20 dizi olarak ikinci desen tasarlayın. </li><li> Ayrıca, 45 ° açıyla 1,200 mikron merkez-merkez köşe desen aralıklı her dizi tasarım dört köşe 1 x 1 mm 2 kare referans işaretlerini yerleştirin. </li><li> Mikroakışkan dökümhane ile başka bir yerde, 15 veya işbirliği detaylı olarak, standart litografi teknikleri kullanarak bir 300 um özelliği derinliğe ilişkilendirerek, 1 boy oranları: 1 Bu deneyde kullanılmak üzere silikon ustaları imal. Not: Özellik daha düşük 100 um alt-tabaka yüzeyi ile temas etmeden önce pul anormal deformasyonuna neden olan vuruş derinlikleri. NOT: Bu protokol, özel ekipman ve yaratmak için temiz odalar gerektiren Fotorezist tarif desenleri, zaten elde silikon ustaları sahip başlar. Bu desenli ustaları oluşturmak için bir fabrikatör veya çekirdek tesisi ile danışmak en iyisidir. </li></ol></li><li> Silanize silikon ustaları (tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydroocty) triklorosilan buharı ile inkübasyon O / N. NOT: Silan buharı son derece toksik ve sadece kimyasal davlumbaz ele alınmalıdır. </li><li> PDMS nin önceden polimer ve 60 ° C&#39;de bir petri kabı O / N olarak silanize edilmiş silikon ustaların üstüne sertleştirme maddesi PDMS: 1 oranında, bir 10 sertleştirme ile silikon ustaların ters kopyaları oluşturun. </li><li> Silikon ustalardan PDMS pulları kaldırmak ve akrilonitril bütadien stiren damgalar (ABS) arkaları veya diğer herhangi bir sert malzeme bağtutkal kullanarak s. Not: seçim malzemenin şeffaf veya biyolojik olarak uyumlu olmak zorunda değildir. Bununla birlikte, PDMS daha robotik kalıp ve yüksek sağlamlığa sahip olan bir arayüz için düz bir yüzeyin sağlanması gerekir. </li></ol> 2. hazırlanması Coverslides <ol style="margin-left: 40px;"><li> Durulama mikroskop coverslides (24 mm x 50 mm # 1) hafif bir azot akımı altında, etanol ile durulanır ve kurutulur edilmeden önce 1 dakika süre ile, aseton içinde, toluen, metanol ve sonikasyon. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz toluen ve aseton tutun. </li><li> Odaklanmış bir elektron ışını buharlaştırıcı kullanılarak 18.0 nm altın (Au), ardından ~ 3.5 mil titanyum (Ti) ile kaplayın coverslides. NOT: Bu prosedür silikon ve polistiren altın dahil kaplı yüzeylerde çeşitli uyumludur. Bu yerinde oluşturmak mümkün olsa da, altın kaplanmış alt tabakalar aynı zamanda ticari tedarikçilerden yoluyla ulaşılabilir. NOT: yüzeylerde Au tabakalar olması gerekirken, Ti tabakalar, en az 3 mil kalınlığında olmalıdırı en az 5 nm kalınlığında ve son alt-tabakanın 16,17 doğru optik özelliklerine bağlı olarak kalınlığı 1 mm tüm yol arasında olabilir. Yüzeyleri imalatı için optik açık olması gerekli değildir; Bununla birlikte, imal edilen alt-tabakaların mikroskopik analizi kolaylaştırır. </li><li> Kullanımdan hemen önce yumuşak azot altında etanol ve kuru ile altın kaplı coverslides durulayın. </li></ol> 3. R-μCP dış çevresinin <ol style="margin-left: 40px;"><li> Seçici uyumlu mafsallı robot kolu (SCARA) sistemi ile R-μCP önce, sistemin yazılımını kullanarak robotik araç efektörler ve beraberindeki çift kamera sistemleri kalibre. NOT: Bu aletler Şekil 1&#39;de resmedilmiştir. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig1highres.jpg" /> Şekil 1. R μCP Sistemi ve Robotik Kol İşleme. </strong&gt; (A) tüm takım ve demirbaşlar ile R-μCP sisteminin Büyük ölçekli görünümü, (a) vakumla mandren, (b) reaktif banyo, (c) aşağı bakan kamera, (d) damga yuvalama fikstür, (e) robotik aracı. (B) Robotik kol takım resmeden (f) elmas uçlu dağlama aracı ve (g) pnömatik emme aracı (h) ABS destekli PDMS damga tutarak. <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Elle 600 mikron ID ve 900 mikron OD halkasal bölge damga yuvalama fikstür aşağı yüz çıkıntılı bir PDMS damga yerleştirin. Elle Şekil 1A görüntülenen vakum aynası, üstüne taze temizlenmiş altın kaplamalı coverslide yerleştirin ve bağlı laboratuar vakum kullanarak hareketsiz. </li><li> Robot denetimleri kullanarak, Şekil 2A gibi, altın kaplı coverslide merkez noktasının üzerinde aşağı bakan kamera hizalayın. NOT: Bu nokta başlangıçta görsel muayene ile tanımlanabilir ve büyük hassasiyet gerektirmez, PDMS damga çok larg olduğu gibialtın kaplı slayt daha er. </li><li> Dört başvuru etch robot kolu talimat &quot;X&quot; boyutları ile bir kare köşelerinde işaretleri robot koluna bağlı elmas uçlu aşındırma aracını kullanarak altın kaplı coverslide merkezli 3.8 mm 3.8 mm. (Şekil 2B&#39;de tasvir; OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Bu dört referans işaretleri aşağı bakan kamera bir görsel çerçevesinde olmasını sağlar. </li><li> Robotların pnömatik emme takım kullanarak, pick-up ve PDMS Şekil 2C olarak damga yuvalama fikstür üzerinde 1 mm damga basılı tutun. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Damganın kare referans işaretleri görselleştirmek ve damgası ortalama X, Y belirlemek için kamera yazılımı ile 10 kez onları tanımlamak, ve açısal merkezinden ofset, Şekil 2D ve E resimde yukarı bakan kamera ve LED aydınlatma halkası kullanılması robot takım ekseni. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Olduğu gibi <strong&gt; Şekil 2A, görselleştirmek ve robot takım ekseni merkezinden ofset coverslide ortalama X, Y merkezi yerleri ve açısal belirlemek için coverslide en kazınmış referans işaretlendiği 10 kez algılamak için aşağı bakan kamerayı kullanmak. (OTOMATİK SÜRECİ). NOT: Bir iç hesaplama tam hizalamak için robotik sistemin yazılımı tarafından gerçekleştirilir damga ve geleceğin R-μCP adımlarla Coverslip X, Y, merkezi yerleri ve açısal uzaklıklar. </li><li> Şekil 2F&#39;de de gösterildiği gibi 3.8)) alkantiyol bir ATRP inisiyatör, ω-mercaptoundecyl bromoizobutirat (etanol içinde 2 mM bir banyoda damga yerleştirin. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> Alkantiyol çözeltiden damga çıkarın ve Şekil 2G olarak etanolün buharlaştırılması 0.48 bar (5 psi) basınçlandı azot akımı üzerine yerleştirin. 1 dakika sonra, azot akışı basınç üniform bir kuruluğa gelene sağlamak için 1.03 bar (15 psi) kadar arttırmaktadır. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: Eksik kurutma desen sadakat tamamen veya kısmen kaybına neden olur. </li><li> Kurutma işleminden sonra, altın kaplamalı slayt hesaplanan merkez pozisyonu üzerindeki pul taşımak ve Şekil 2H&#39;de gösterildiği gibi Z eksenine motor gücünü izlerken 100 um artışlarla indirin. NOT: Bu Z-ekseni motoru yaşadığı ve robot rehberlik yazılımında görüntülenen tork iletilir. (OTOMATİK SÜRECİ) </li><li> 79.2 kPa önceden belirlenmiş bir basınç elde edildikten sonra damga düşürücü durdurmak, ve 15 saniye için altın kaplı sürgü ile temas sağlamak. (OTOMATİK SÜRECİ) NOT: basınç değerleri burada mevcut damga tasarım ve özellik yüksekliği için optimize edilmiştir. Damga tasarım deneme ve yanılma süreci bu doğrultuda özellikle boy oranı yüksek pul, ayarlamak için, değiştirilir. </li><li> Yavaşça altın kaplamalı slayt damga kaldırmak ve geri damga yuvalama fikstür damgası yer. (OTOMATİK SÜRECİ) </li></ol&gt; Micropatterned Coverslides ilgili PEGMEMA 4. SI-ATRP <ol style="margin-left: 40px;"><li> Vakum basıncı micropatterned coverslide tutarak serbest bırakın ve bir 50 ml&#39;lik bir Schlenk şişesine aktarın. Mühür ve degas savurma bir vakum pompası kullanılarak şişeyi. </li><li> Ekleme makromonomer PEGMEMA (208.75 mmol), su (34.4 mi), metanol (43.8 mi), bakır (II) bromür (1 mmol) ve 2 &#39;, 2-bipiridin (3 mmol) ihtiva eden ATRP Reaksiyon karışımı 5.5 mi Schlenk şişesi. </li><li> Reaksiyonu başlatmak için su içinde L-sodyum askorbat (454,3 mM) 0.5 ml ilave edilir, ve atıl gaz altında, oda sıcaklığında 16 saat süre ile devam etmesini sağlar. NOT: Şekil 3A-B&#39;de gösterildiği gibi, L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra, tepkime rengi koyu kahverengiye doğru açık yeşil yönelecektir. NOT: Reaksiyon 16 saat ötesine devam edebilirsiniz, ancak önemli ölçüde PEG fırçaların uzunluğunu artırmak olmayacaktır. </li></ol><imgalt = &quot;Şekil 3&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.186 / 52186fig3highres.jpg&quot; /&gt; SI-ATRP Şekil 3. başlatılması. (A) reaksiyonu ve L-sodyum askorbat ilave edildikten sonra (B), müteakip bir renk değişikliğiyle başlatılması. SI ATRP prosedür takip edilerek micropatterned coverslide yüzeyinin (C) mikroskop görüntüsü. Ölçek çubuğu 1 mm. <ol start="4" style="margin-left: 40px;"><li> Schenk şişeden micropatterned coverslide çıkarın ve hafif bir azot akımı altında, etanol, su, ve etanol ve kuru ile durulayın. Not: SI-ATRP sonra, yüzey değişiklikleri gözle görünür olmalıdır ve Şekil 3C&#39;de olduğu gibi, bir mikroskop altında görüntülenmiş ve analiz edilebilir. Not: Bu, bu alt-tabakaların immunostain ihtiyacını ortadan kaldıran şekilde deneme hassas test etmek için basit bir yöntemdir. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 5. Azit Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> N, 6 ml ilave edilir, reaksiyon şişesine, 100 mM sodyum azit ihtiva eden N-dimetilformamid (DMF). 24 saat boyunca 37 ° C &#39;de bu reaksiyon koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMF taşıyınız. Sodyum azid tartıp dikkatli olun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> Brom Fonksiyonlu PEGMEMA Chains 6. Pasivasyon <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam reaksiyon şişelerine Micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> 100 mM etanolamin ve reaksiyon şişesine, 300 mM trietilamin ihtiva eden, dimetil sülfoksit (DMSO) ve 6 ml ilave edilir. 24 saat süre ile, 40 ° C&#39;de, bu reaksiyonu tutun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO, etanolamin ve trietilamini tutun. </li><li> Tamamlandığında micropatterned coversl kaldırmakReaksiyon şişesinden ide, bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> İç anulus 7. R-μCP ve PEGMEMA SI-ATRP&#39;si <ol style="margin-left: 40px;"><li> Küçük özellikleri ile halkasal bölge önceden micropatterned anülleri içine yerleştirilir şekilde 300 mikron ID ve 600 mikron OD çıkıntılı anülleri, bir PDMS damga ikame, 3.12 - Daha önce Adımlar 3.2 ve 3.6 de açıklandığı gibi R-μCP adımları uygulayın. NOT: Bu damga basıncı eşik 132,0 kPa. Daha önce de belirtildiği gibi, bu basınç ayarlarının en düşük mühür özellikleri bu deneyde kullanılmak üzere optimize edilmiştir. </li><li> 4.4 - aşamalarında daha önce 4.1 de açıklandığı gibi SI-ATRP&#39;si adımları uygulayın. </li></ol> Micropatterned PEGMEMA Chains 8. Asetilen Functionalization <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> DMSO mM 100 ihtiva eden 6 ml ekleyinReaksiyon şişesine propargilamin. 24 saat boyunca oda sıcaklığında bu reaksiyona koruyun. NOT: Sadece bir kimyasal davlumbaz DMSO ve propargilamin tutun. </li><li> Tamamlandıktan sonra, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide çıkarmak ve bir azot akımı altında, sonra da etanol, su ve kuru ile durulayın. </li></ol> 9. Bakır-katalize &quot;Click&quot; Asetilen biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı <ol style="margin-left: 40px;"><li> 20 ml&#39;lik bir cam bir tepkime cam şişesinde micropatterned coverslide yerleştirin. </li><li> Bakır sülfat (15 mM) / tris [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amin (TBTA, 30 mM) içinde 6 ml (ekleme 1: 1 h / h su Reaksiyon şişesine 562 uM azit-PEG 4 -Biotin konjugat ihtiva / DMF). Reaksiyonu başlatmak için bu karışıma su içinde L-askorbik asit (0.15 mM) ve 1.2 ml ilave edilir. </li><li> 10 sn için, reaksiyon çözeltisi içinden kabarcık olarak, azot, Parafilm ile şişenin kapatılması, ve oda sıcaklığında 24 saat boyunca reaksiyona girer. </li><li> Completio üzerineN, reaksiyon şişesinden micropatterned coverslide kaldırmak, su ile yıkayın ve bir 12-yuvalı polistiren tabağa koyun. </li></ol> Biyotinilat Asetilen Grupların 10. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca DPBS (% 3 eşek serumu) micropatterned coverslide bloke eder. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca HAA içinde Streptavidin-546 konjugatı (2 ug / ml) (PBS içerisinde% 3 eşek serumu) ile biyotinile asetilen grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS ile 5 kez yıkayın. Not: Bu adım tamamlandıktan sonra, Şekil 4B, sürgünün bir görüntüsünü göstermektedir. </li></ol> 11. Bakır-free &quot;Click&quot; Azide&#39;da biyotinlenmesi PEGMEMA Zincirler Sonlandırıldı NOT: Arzu edildiği takdirde, bu alt-tabaka tadilat aşaması, hücre kültürü esnasında in situ gerçekleştirilebilir. <ol style="margin-left: 40px;"><li> 12-çukurlu, s micropatterned coverslide boşolystyrene çanak aşağıdaki HAA durular. </li><li> 20 uM DBCO-PEG 4 -biotin ihtiva HAA (ya da hücre kültür ortamı) olarak 2 ml ilave edilir, ve bu reaksiyon oda sıcaklığında 24 saat boyunca devam etmesine izin vermek (ya da bir inkübatör içinde 37 ° C&#39;de). </li><li> DPBS (ya da sadece bir ortam değişikliği yapılması) ile tamamlandıktan sonra, micropatterned coverslide 5 kez çalkalayın. </li></ol> Biyotinilat Azit Grupların 12. Immunofluorescent Algılama <ol style="margin-left: 40px;"><li> Oda sıcaklığında 2 saat boyunca 2 ml DPBS içinde Streptavidin-488 konjugatı (2 ug / ml) (% 3 eşek serumu) ile biyotinile azid grupları için leke. </li><li> Hafifçe çalkalama ile 10 dakika boyunca micropatterned coverslide DPBS içinde 5 kez yıkayın. </li><li> Resim konfokal floresan mikroskobu kullanılarak coverslide Micropatterned. Bu adım tamamlandıktan sonra Şekil 4A-C sürgünün görüntüleri yer almaktadır. NOT: doku kültürü deneyleri için alt tabakalar kullanırken, bölümleri 10 ve bu protokolün 12 atlayın. İstenen açıda sonraişlevsellik e, bir azot akımı altında% 100 etanol ve kurutulması her iki tarafa da durulama işlenmiş coverslide sterilize edin. Steril bir biyolojik güvenlik kabini için slayt aktarın ve hücre tohumlama ve kültürü ile geçmeden önce PBS ile beş kez slayt durulayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Senaratne, W., Andruzzi, L., Ober, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Assembled+Monolayers+and+Polymer+Brushes+in+Biotechnology:+Current+Applications+and+Future+Perspectives.">Self-Assembled Monolayers and Polymer Brushes in Biotechnology: Current Applications and Future Perspectives.</a> Biomacromolecules. 6 (5), 2427-2448 (2005).</li><li>Hucknall, A., Kim, D. -. H., Rangarajan, S., Hill, R. T., Reichert, W. M., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Fabrication+of+Antibody+Microarrays+on+Nonfouling+Polymer+Brushes+with+Femtomolar+Sensitivity+for+Protein+Analytes+in+Serum+and+Blood.">Simple Fabrication of Antibody Microarrays on Nonfouling Polymer Brushes with Femtomolar Sensitivity for Protein Analytes in Serum and Blood.</a> Advanced Materials. 21 (19), 1968-1971 (2009).</li><li>Hucknall, A., Rangarajan, S., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Pursuit+of+Zero:+Polymer+Brushes+that+Resist+the+Adsorption+of+Proteins.">In Pursuit of Zero: Polymer Brushes that Resist the Adsorption of Proteins.</a> Advanced Materials. 21 (23), 2441-2446 (2009).</li><li>Rozkiewicz, D. I., Ja&#324;czewski, D., Verboom, W., Ravoo, B. J., Reinhoudt, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click&#8221;+Chemistry+by+Microcontact+Printing.">Click&#8221; Chemistry by Microcontact Printing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (32), 5292-5296 (2006).</li><li>Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cu-free+click+cycloaddition+reactions+in+chemical+biology.">Cu-free click cycloaddition reactions in chemical biology.</a> Chemical Society Reviews. 39 (4), 1272-1279 (2010).</li><li>Sha, J., Lippmann, E. S., McNulty, J., Ma, Y., Ashton, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+Nucleophilic+Substitutions+Permit+Orthogonal+Click+Functionalization+of+Multicomponent+PEG+Brushes.">Sequential Nucleophilic Substitutions Permit Orthogonal Click Functionalization of Multicomponent PEG Brushes.</a> Biomacromolecules. 14 (9), 3294-3303 (2013).</li><li>Tugulu, S., Silacci, P., Stergiopulos, N., Klok, H. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RGD&#8212;Functionalized+polymer+brushes+as+substrates+for+the+integrin+specific+adhesion+of+human+umbilical+vein+endothelial+cells.">RGD&#8212;Functionalized polymer brushes as substrates for the integrin specific adhesion of human umbilical vein endothelial cells.</a> Biomaterials. 28 (16), 2536-2546 (2007).</li><li>Ashton, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Screening+of+Gene+Function+in+Stem+Cells+Using+Clonal+Microarrays.">High-Throughput Screening of Gene Function in Stem Cells Using Clonal Microarrays.</a> Stem Cells. 25 (11), 2928-2935 (2007).</li><li>Koepsel, J. T., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+Self-Assembled+Monolayers:+Efficient,+Chemically+Defined+Tools+for+Cell+Biology.">Patterned Self-Assembled Monolayers: Efficient, Chemically Defined Tools for Cell Biology.</a> ChemBioChem. 13 (12), 1717-1724 (2012).</li><li>Mrksich, M., Dike, L. E., Tien, J., Ingber, D. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microcontact+printing+to+pattern+the+attachment+of+mammalian+cells+to+self-assembled+monolayers+of+alkanethiolates+on+transparent+films+of+gold+and+silver.">Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver.</a> Experimental cell research. 235 (2), 305-313 (1997).</li><li>Ma, H., Hyun, J., Stiller, P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-Fouling&#8221;+Oligo(ethylene+glycol)-+Functionalized+Polymer+Brushes+Synthesized+by+Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization.">Non-Fouling&#8221; Oligo(ethylene glycol)- Functionalized Polymer Brushes Synthesized by Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization.</a> Advanced Materials. 16 (4), 338-341 (2004).</li><li>Bou Chakra, E., Hannes, B., Dilosquer, G., Mansfield, D. C., Cabrera, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+instrument+for+automated+microcontact+printing+with+stamp+load+adjustment.">A new instrument for automated microcontact printing with stamp load adjustment.</a> Review of Scientific Instruments. 79 (6), (2008).</li><li>Trinkle, C. A., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+microcontact+printing+of+interchangeable+stamps+using+an+integrated+kinematic+coupling.">High-precision microcontact printing of interchangeable stamps using an integrated kinematic coupling.</a> Lab on a Chip. 11 (3), 455 (2011).</li><li>McNulty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-precision+robotic+microcontact+printing+(R-&#956;CP)+utilizing+a+vision+guided+selectively+compliant+articulated+robotic+arm.">High-precision robotic microcontact printing (R-&#956;CP) utilizing a vision guided selectively compliant articulated robotic arm.</a> Lab on a Chip. , (2014).</li><li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscalepatterning.">Soft lithography for micro- and nanoscalepatterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li><li>Nam, Y., Chang, J. C., Wheeler, B. C., Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gold-Coated+Microelectrode+Array+With+Thiol+Linked+Self-Assembled+Monolayers+for+Engineering+Neuronal+Cultures.">Gold-Coated Microelectrode Array With Thiol Linked Self-Assembled Monolayers for Engineering Neuronal Cultures.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (1), 158-165 (2004).</li><li>Ma, H., Wells, M., Beebe, T. P., Chilkoti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface-Initiated+Atom+Transfer+Radical+Polymerization+of+Oligo(ethylene+glycol)+Methyl+Methacrylate+from+a+Mixed+Self-Assembled+Monolayer+on+Gold.">Surface-Initiated Atom Transfer Radical Polymerization of Oligo(ethylene glycol) Methyl Methacrylate from a Mixed Self-Assembled Monolayer on Gold.</a> Advanced Functional Materials. 16 (5), 640-648 (2006).</li><li>Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+stem-cell+niche+as+an+entity+of+action.">The stem-cell niche as an entity of action.</a> Nature. 441 (7097), (2006).</li><li>Codelli, J. A., Baskin, J. M., Agard, N. J., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Second-Generation+Difluorinated+Cyclooctynes+for+Copper-Free+Click+Chemistry.">Second-Generation Difluorinated Cyclooctynes for Copper-Free Click Chemistry.</a> Journal of the American Chemical Society. 130 (34), 11486-11493 (2008).</li><li>Debets, M. F., van Berkel, S. S., Schoffelen, S., Rutjes, F. P. J. T., van Hest, J. C. M., van Delft, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aza-dibenzocyclooctynes+for+fast+and+efficient+enzyme+PEGylation+via+copper-free+(3+2)+cycloaddition.">Aza-dibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3+2) cycloaddition.</a> Chemical Communications. 46 (1), 97 (2010).</li><li>DeForest, C. A., Polizzotti, B. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+click+reactions+for+synthesizing+and+patterning+three-dimensional+cell+microenvironments.">Sequential click reactions for synthesizing and patterning three-dimensional cell microenvironments.</a> Nature Materials. 8 (8), 659-664 (2009).</li><li>Roth, E. A., Xu, T., Das, M., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+for+high-throughput+cell+patterning.">Inkjet printing for high-throughput cell patterning.</a> Biomaterials. 25 (17), 3707-3715 (2004).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials.">Biomaterials.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Brouzes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+microfluidic+technology+for+single-cell+high-throughput+screening.">Droplet microfluidic technology for single-cell high-throughput screening.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (34), 14195-14200 (2009).</li><li>Meitl, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+printing+by+kinetic+control+of+adhesion+to+an+elastomeric+stamp.">Transfer printing by kinetic control of adhesion to an elastomeric stamp.</a> Nature Materials. 5 (1), 33-38 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interest.

Doku mühendisliği için ideal bir alt-tabakalar Biyolojik Tabanlı Akıllı ve böylece doğal dokuların içinde bulunan kritik bir biyolojik olarak aktif ligandlann uzamsal dağılımını özetlemek olacaktır. Ayrıca, ligandların zamansal ayarlamaları ve yönlendirilmiş doku morfojenezini izin vermek için sunulan ve mekansal olarak hücre akıbetinde indüksiyon sınırlandırıldığı uzamsal desen etkinleştirmeniz dinamik özelliklere sahip olacaktır. Bu gibi maddelerin imalatı yüzeylerde karmaşık ve son derece düzenli yönlerde birden fazla biyokimyasal ipuçlarının immobilizasyonunu gerektirmektedir. In vitro olarak, bir hücre niş tüm endojen faktörleri simüle makul olmasına rağmen, burada tarif edilen R-μCP sistemi mekansal yönlenmelerinin mikro kontrol ortogonal biyoaktif kimyaları birçok bölgesinde hareketsiz hale getirmek için sağlar. Bu alt-tabakalar artar kullanımı ayrıca, PEG fırça dizileri hareketsizleştirilmiş ligand ile bağlı iken bu göz önüne alındığındabiyospesifik etkileşimlerin ortaya çıkarabilir, bağlanmamış PEG fırçalar protein adsorpsiyonu direnç gösterir ve böylece hücre yapışmasını ve göçünü kontrol etmek için hizmet edebilir. Hücre dışı matris (ECM), protein ya da polimer-PEG konjugatlarının pasif micropatterned adsorpsiyon hücre yapışmasını ve göçünü kontrol edilmesi için basit bir yöntemdir, ancak yüzeyinde tutma tersinir 11 olduğu için, bu teknik sadece geçici bir kontrol sağlar. Aynı zamanda, moleküller öngörülemeyen yönlerde içindeki yüzeylere ve böylece kalitesini ve biyospesifik etkileşimlerin kontrolünün azaltılması rastgele konsantrasyonlarda adsorbe eder. Ayrıca, tipik olarak in situ modifikasyon sonrası yüzerme sınırlayıcı daha işlevselleştirilmesi için belirlenmiş çok reaktif bölgeye sahip olmayan, örneğin büyükbaş hayvan serum albümini veya Pluronik F127 olmayan kirlenme bölgeleri oluşturmak için kullanılan bileşikler. Alkanetiollerin SAMs ek yüzey modifikasyonu için bu tip aktif gruplar ile oluşturulan, ancak çok doku kültürü iklimlendirme sınırlı dayanıklılık sahip olabilirbağlı olarak aşılanmış PEG ile elde oksidatif koruyucu eksikliği iyonları 10,11 fırçalar. Bunun aksine olarak, PEG-fırça aşılama ve ardışık nükleofilik yer değiştirme reaksiyonları ile Ar-μCP platformların birleşme biyo-ortogonal fonksiyonları ile a priori olarak veya in situ olarak da değiştirilebilir, dayanıklı mikro cytophobic bölgeleri ile alt-tabakaların mühendisi yeteneği sağlar. Bu in vitro doku morfolojisi ve büyüme düzenler biyospesifik etkileşimlerin daha fazla kontrol izin verecektir. Sıralı mikrokontak baskılar hizalanması için, diğer sistemlere göre R μCP bir anahtar mukavemeti hala yüksektir hizalama doğruluğu 12,13 koruyarak tekrar preslenmiş arasındaki sistemi tabakayı kaldırmak için yeteneğidir. Bu, sonradan im yoğunluklarını uygulanabilir yüzey kimyaları tiplerinde daha büyük bir çeşitlilik sağlar ve yüzey modifikasyonu reaksiyonların süresi ayarlamak için değiştirilebilirseferber ligandlar 6. Bu nedenle R-μCP biyospesifik etkileşimlerin 14 aracılık biyokimyasal kuyruklarının fokal konsantrasyon değişimlerini belirlemek için kullanılabilir. Tam yerini ve biyospesifik etkileşimlerin derecesini hem kontrol kapasitesi sayesinde, R-μCP sistem doku morfogenezindeki biyoaktif ligandların rollerini araştırmak için benzersiz bir yöntem sunuyor ve biyolojik ipuçlarının sunum olarak simüle kültür substratları oluşturmak için sağlam bir sistem kurar in vivo niş. Hücresel niş bir kritik yönü, özellikle gelişme içinde, sinyalizasyon zamanmekansal modülasyonu 18 faktörleri olduğunu. Çözünür biyokimyasal işaretler zamansal olarak tanımlanmış bir şekilde kültür ortamına ilave edilebilir olsa da, hücrelerin bu ipuçlarını karşılaşanlardır boyunca uzaysal kontrolü yoktur sınırlıdır. Burada açıklandığı gibi R-μCP sistem ile terminal olarak functionaliz ile micropatterned kültür tabakaları oluşturmak mümkündüred PEG kültürde hücre kaderi üzerinde hiçbir etkisi yoktur azid fonksiyonel grupları sunmak fırçalar. Azid gruplarını alkin gösteren moleküller ile bakır ile katalize edilen bir &quot;klik&quot; reaksiyonları geçirebilen birlikte, bu bakır toksisite kültürde hücrelerin varlığında gerçekleştirilemez. Ancak, dibenzocyclooctyne gibi yüksek gerilme molekülleri (DBCO) son derece seçici ve biyouyumlu bakır serbest azid-alkin Siklokatılma reaksiyonuna 19,20 uğrar. DBCO içeren bağlayıcıların konjügasyonu yoluyla micropatterned kültür alt-tabakalar, yeni biyolojik ligandlar 21 ile in situ olarak da değiştirilebilir. Cytophilic cytophobic bölgeler oluşturmak ya da çok aşamalı bir sinyalleme prosedürlerinde kullanım için farklı biyokimyasal ipuçlarını ekleme yeteneğine sahip olan, bu yöntem ile üretilen bir kültür alt-tabakalar yeni bir uyum özelliğine sahiptir ve bu nedenle, in vitro doku morfojenezini talimat için daha sağlam bir sistem sağlar. Muazzam pot rağmenential ve R-μCP platformu yarar, bazı dezavantajları var. PEG-aşılı tabakaları oluşturmak için çok sayıda SI ATRP adımların kullanımı büyük ölçüde mürekkep püskürtmeli baskı ya da ECM proteinlerinin Mikrodamlacık çökeltme gibi yöntemleri ile karşılaştırıldığında üretim süresini uzatır. Mürekkep püskürtmeli baskı tekniklerinin hassas mevcut R μCP sistemi rakipleri birlikte, ECM proteinlerinin adsorpsiyon dolayısıyla hücre-protein etkileşimlerinin daha az kontrol temin tersine çevrilebilir. Ayrıca, mürekkep püskürtmeli baskı teknikleri ile üretilen yüzeyler dolayısıyla uzamsal yerinde substrat değişiklikler 22 kısıtlı örneğin izin farklı substrat modifikasyonu kimyalarına, kullanımını engelleyen, imalat sırasında kaldırılamaz. R-μCP sistemi çok bette oysa Bu sınırlamalar nedeniyle mürekkep püskürtmeli teknikleri kültür kısa süreli öncelikle ilgili yüzeylerde, biyomoleküllerin statik düzenlemeleri ve hücre tipleri 23 hızlı nesil için daha uygundurr uzun vadeli, farklı biyolojik ligandlar ile 2D hem mekansal ve zamansal hücresel etkileşimleri üzerinde dinamik kontrolünü sergilemek üzere tasarlanmış çok yönlü tabakaları üreten doğru uygundur. Microcontact baskı &#39;mürekkep&#39; olarak geniş yüzey alanları vardır, ancak her zaman çökelmiş &#39;mürekkebin maddelerin konsantrasyonu önemli farklılıklar bulunmaktadır olmuştur nano-için-mikroölçeklerde hızlı birikmesini sağlar. Şekil 4 &#39;de görüleceği üzere, bu, aynı zamanda R-μCP platformun bir akım kısıtlamasıdır. Biz PEG floresan modifikasyonunda heterojenlik fırçalar varsayımında nedeniyle bütün PDMS damga üzerinden düzgün olmayan bir normal kuvvetin robotun uygulama için hangi aynı zamanda büyük olasılıkla mükemmel düz değil. Bu sayede, alkantiyol başlatıcı düzensiz çökelmesini ve aşılı PEG fırçanın daha sonra kalınlaşmasına sebep mührü ve alt-tabakanın tüm bölgeleri arasında homojen olmayan bir temas basıncı ile sonuçlanır. Içindealkanetiollerin da birikimi ve dolayısıyla yüzey işlevselliği olan PEG-aşılı tabakaları imal etmek amacıyla, presleme aracı dizayn bütün PDMS damga boyunca dağıtılmış ve homojen bir normal kuvvet uygulamak için optimize edilmesi gerekir. Bu damga kusurların tüm arabirim bağımsız genelinde altın kaplı slaytlar ile devamlı temas kolaylaştıracaktır. Aynı zamanda, Şekil 4B&#39;de, bir azid sona PEG fırça üzerinde asetilen gruplarının hafif çapraz bulaşma gözlemleyebiliriz. Daha önce 6 gösterildiği gibi çapraz kontaminasyon nedeniyle hareketsizleştirilmiş ligand yüzey yoğunluğu amaçlanan PEG fırça üzerinde edilene az karşılaştırılır olsa da, bu etanolamin pasivasyon reaksiyon süresini uzatmak suretiyle arttırmak sıfıra yakın indirgenebilir (Bölüm 6&#39;ya bakınız). Burada açıklandığı gibi R-μCP sisteminin ana uygulama uzaysal ve zamansal kontrolünün o uygulamak için kullanılabilir karmaşık doku kültür sübstratları imalinde kullanılması olupf hücre kaderi. Ancak, R-μCP platformun yüksek hassasiyet ve kesinlik bunun yanı sıra başka uygulamalar için çekici bir yöntem sağlar. Daha önce atıl olan, cytophobic bölgelerin yerinde modifikasyonunda ardından diferansiyel bağ kimyasalları ile model cytophilic alanları yeteneği bunların uzaysal üzerinde sıkı bir kontrolü ile birden fazla hücre hatlarının ko-kültür için izin verir. Micropatterning doğasında yüksek verimli bir doğası ile bu tek hücreler ve çok hücreli kombinasyonları 24 her ikisi de, yüksek miktarda madde taraması için mevcut yöntemlere bir alternatif sunmaktadır. R-μCP sistem biyolojisi alanında büyük bir potansiyele sahip olmakla birlikte, aynı zamanda mikro-elektromekanik sistemler (MEMS) alanında tatbik edilebilir. MEMS üretiminde, seri üretim için yüksek hassasiyet ve doğruluk ile MEMS bileşenleri aktarmak için arzu edilir. Yeni bir kinetik damgalama teknikleri ile, burada tarif edilen R-μCP sistemi etkin compone yazdırmak için uyarlanabilirMEMS 25 oluşturulmasında kullanılmak üzere silikon gofret üzerinde silikon veya galyum nitrür NTS. Bu durumda, R-μCP platformu potansiyel geniş bir uygulama yelpazesi için kullanılabilir. Sonuç olarak, R-μCP sisteminin kullanılması, dikey olarak arka arkaya, nükleofilik ikame etme reaksiyonları kullanılarak işlevselleştirilmiş kültür sübstratları, PEG-aşılı oluşturmak için sunulur, potansiyel olarak, in vitro doku morfolojisi ve büyümesini kontrol etmek için ideal bir platform, ancak birden fazla rollerini araştırmak için mükemmel bir sistem, sadece hücre kaderi üzerinde biyoaktif ligandlar. Farklı ve çok iyi düzenlenmiş bir desen kalıbı birden fazla biyokimyasal ipuçlarına yeteneği mikron ölçeğinde düzenlenen birden fazla hücre tipleri ile doku yapılarının oluşumunu talimat edebilen kültür substrat oluşturmak için temel oluşturur. Bu, yerinde micropatterned substratlar değiştirme yeteneği ile birleştiğinde, doku morfojenezinin ve cel eşsiz kontrolü için izin verebilirkültür l kader. Burada anlatılan desenlendirme teknikleri bir gün vitro organotipik doku yapılarının rasyonel ve tekrarlanabilir üretim kolaylaştırabilir kültür tabakaları imalatı için çok yönlü bir sistem sağlar.

Aynı anda doğal olmayan kirlenme özellikleri korurken kovalent bağlı biyokimyasal ligandlar görüntülemek için PEG-aşılı yüzeylerin yeteneği, onları kültürü yüzeylerin 1,2,3 mühendislik özel mikro ortamlar için ideal bir seçimdir. Ligand konjüge PEG fırça tarafından aracılık biyospesifik etkileşimlerin tek hücre fenotipleri in vivo doku mikroçevrelerde kompleksi içinde bulunan biyokimyasal işaretlerin etkilerinin indirgeyici analizi sağlar. Ayrıca, biyo-dik bir &quot;klik&quot; kimyaları da yerel konformasyonun 4-6&#39;da sunulmuştur, böylece ligand yönsel hareketsiz kılınmasını temin etmek için kullanılabilir. Böylece, PEG mikro mekansal desenlendirme fırçalar hareketsiz biyokimyasal ipuçları 6,7 ile uyarılan hücre sinyallerini araştırmak için in vitro nişler tasarımcısı oluşturmak için çok yönlü bir araçtır. Biyokimyasal cu mekansal kalıplarını üretmek için ortak bir yöntemes PEG konjuge alkanetiollerin desenleri ile microcontact baskı (μCP) altın kaplı yüzeylerde gerektirir. Daha sonra, PEG-açillenmiş alkanetiollerin micropatterned kendinden düzenlenen tek tabakaları (SAMs), sadece alt-tabaka 8,9 olmayan desenli bölgelere, biyokimyasal moleküllerin, örneğin, protein fiziksel adsorpsiyon kısıtlar. Bununla birlikte, bu teknikle üretilen SAMs uzun vadeli hücre kültür ortamında oksidasyona duyarlı olan. Böylece, SAMs alkantiyol μCP&#39;d genellikle daha fazla bölgenin olmayan kirlenme istikrarı 10 arttırmak için yüzey başlatılan atom transfer radikal polimerizasyonu (SI-ATRP) kullanılarak PEG polimer fırçalar ile aşılanmış. Özellikle, μCP alkantiyol polimerizasyon başlatıcı, poli SI-ATRP (etilen glikol) metil eter metakrilat (PEGMEMA) monomerlerin ve ardından altın kaplı yüzeylerde ω-meraptoundecyl bromoizobutirat micropatterned uzun süreli, istikrarlı, ve non yüzeyleri oluşturur kirlenme PEG fırçalar. Ayrıca, bu<html> bundan başka çeşitli kimyasal kısımların 11 sağlamak için modifiye edilmiş olma yeteneğine sahiptir. Bu özellik, Sha et yararlanarak. ark. dik &quot;tık&quot; kimyaları sunulması çok bileşenli PEGMEMA fırçalar ile kültür substratları mühendisi için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntemde, bunlar sıralı sodyum azid, etanolamin serpiştirilmiş μCP / SI ATRP bir dizi aşama kullanmak, ve birden fazla hareketsizleştirilmiş ligand 6 mikro desen gösteren kültür tabakaları oluşturmak için nükleofilik sübstitüsyonu propargilamin. Yeni kültür sübstratları mühendislikten geçirilmesi için indirin μCP ile bağlantılı olarak, kimyasallar kullanıldığında potansiyel büyük olsa da, çok sayıda μCP aşamalar, tek bir alt-tabaka üzerinde düzenlenebilir hangi kesinlik ve doğruluğu sınırlıdır. Hassasiyet ve doğruluk yüksek düzeyde tekrarlanabilir bu çok yönlü teknikler kullanılarak in vitro nişler kompleksi üretimi için gerekli olacaktır. e_content &quot;&gt; Bu sınırlama çözmek için, bazı otomatik ve yarı-otomatik μCP sistemleri al.. Çakra ve diğ. üretilen özel pulları bir ray sistemi üzerindeki izlenerek ve altın-kaplı slaytlar konformal temas ettirildiği bir μCP sistemi geliştirilmiştir Bir bilgisayar kontrollü pnömatik aktüatör. Bununla birlikte, bu yöntem, özel damga tasarımlar hassas imalat gerektirir ve çok μCP 12 adım yaparken elde doğruluğunda bir rapor ile birlikte 10 mikron hassas bildirir. Daha yeni olarak, entegre bir kinematik bağlantı sistemini kullanan bir metodu rapor, tek bir desen kullanarak 1 um altında hassas, ama nedeniyle 13 kalıp kalıp damga özelliklerin hassas kontrol eksikliği doğru birden çok desen hizaya koyamadık. Ayrıca, önceki yöntemlerin her ikisi de desenlendirme adımları arasında sabit kalmasını tabakayı gerektirir , böylece önemli ölçüde olabilir yüzey modifikasyonu kimyaları çeşitliliğini sınırlayıcıkullandı. Damga tasarım ve üretim maksimal esneklik verirken Burada, birden çok μCP adımların doğru ve kesin bir uyum otomatik R-μCP sistem yetenekli açıklar. Ayrıca, desenli yüzeyler defalarca böylece sıralı nükleofilik değiştirmelerin dahil olmak üzere çeşitli substrat modifikasyonu kimyaları, kullanımına izin veren, stampings arasındaki sistemden kaldırılabilir. Bu tür kimyasallar kullanıldığında mühendislik Yüzeyleri hem de bize 6,14 ve diğerleri 7 tarafından önceden hücre kültürü için kullanılmıştır. Böylece, karmaşık ve micropatterned biyokimyasal ipuçları ile kültürü yüzeylerin ölçeklenebilir üretimi için bir yöntem geliştirmek için Ar-μCP ve sıralı nükleofilik sübstitüsyon reaksiyonları birleşti.

<table><tbody><tr><td>SCARA&amp;nbsp;</td><td>Epson</td><td>LS3-401ST</td><td>Higher end models with increased precision are available if desired.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>(Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilane</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td>CAUTION, Should only be handled in a chemical fume hood. When silanizing wafers no one should enter the hood until all silane has been evaporated.</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td><td>Ellsworth Adhesive Co</td><td>NC9020938</td><td>Thouroughly degass solutions via vacuum exposure before use. Alternative kits such as Kit 182 are acceptable.</td></tr><tr><td>24 mm x 50 mm #1 Cover Glass Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>48393106</td><td>These can be purchased from a number of suppliers with varying dimensions to suit need.</td></tr><tr><td>CHA-600 Telemark Electron Beam Evaporator</td><td>Telemark</td><td>SEC-600-RAP</td><td>Requries specialized training.</td></tr><tr><td>EPSON LS3 SCARA</td><td>EPSON</td><td>LS3-401ST</td><td></td></tr><tr><td>&amp;omega;-mertcaptoundecyl bromoisobutyrate</td><td>Prochimia</td><td>FT 015-m11-0.2</td><td>Store at -20 &amp;deg;C. Other ATRP initiators may be used as this R-&amp;mu;CP platform is applicable to all micropatterning modalities.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Schlenk Tube Flask 50 ml</td><td>Synthware</td><td>60003-078</td><td>Requires rubber stoppers with diaphram.</td></tr><tr><td>Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>447943</td><td>Shipped containing MEHQ and BHT free readical inhibitors.</td></tr><tr><td>Methanol (Certified ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Copper(II) Bromide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>437867</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>2,2&#039;-Bipyridine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Sodium L-Ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Borosilicate Glass Scintillation Vials</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-340-4E</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;-dimethyformamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Ethanolamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>398136</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Propargylamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P50900</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>University of Wisconsin Material Distribution Services</td><td>2292</td><td>CAUTION, only handle in chemical fume hood.</td></tr><tr><td>Azide-PEG3-Biotin</td><td>ClickChemistryTools</td><td>AZ104-100</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Copper(II) Sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td>CAUTION, limit exposure with surgical mask.</td></tr><tr><td>Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>678937</td><td></td></tr><tr><td>L-Ascorbic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffer Saline</td><td>Invitrogen</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9663</td><td>Donkey serum contaminated items are considered bio-hazardous material and should be disposed of accordingly. Various other compounds (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; BSA) are available and serve this purpose.</td></tr><tr><td>12-Well Polystyrene Plate</td><td>Thermo Scientifit - NUNC</td><td>07-200-81</td><td>Plates can be purchased form a number of suppliers with varying dimensions.</td></tr><tr><td>DBCO-PEG4-Biotin</td><td>Clickchemistytools</td><td>A105P4-10</td><td>Solubilized in DMF</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11223</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Streptavidin, Alexa Fluor 546 conjugate</td><td>Life Technologies</td><td>S-11225</td><td>Solubilized in PBS</td></tr><tr><td>Nikon A1-R Confocal Microscope</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse Ti, A1R</td><td>An epifluorescent microscope is sufficient to image functionalized micropatterned substrates.</td></tr></tbody></table>

fabricating complex culture substrates using robotic microcontact printing (r-&#181;cp) and sequential nucleophilic substitution

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates presenting grafted poly(ethylene glycol) (PEG) brushes can be used to achieve this task by creating microscale, non-fouling and cell adhesion resistant regions as well as regions where cells participate in biospecific interactions with covalently tethered ligands. To engineer complex tissues using such substrates, it will be necessary to sequentially pattern multiple PEG brushes functionalized to confer differential bioactivities and aligned in microscale orientations that mimic in vivo niches. Microcontact printing (&#956;CP) is a versatile technique to pattern such grafted PEG brushes, but manual &#956;CP cannot be performed with microscale precision. Thus, we combined advanced robotics with soft-lithography techniques and emerging surface chemistry reactions to develop a robotic microcontact printing (R-&#956;CP)-assisted method for fabricating culture substrates with complex, microscale, and highly ordered patterns of PEG brushes presenting orthogonal &#8216;click&#8217; chemistries. Here, we describe in detail the workflow to manufacture such substrates.

Manuel hizalama μCP tekniklerinin kullanılması dik işlevselleştirüerek PEG-aşılı fırçaları Dizilerle kültür substratları mühendisi kimyaları önceki çalışmalarında 6 kanıtlanmıştır &quot;tıklayın&quot;. Bununla birlikte, bu desen yönlendirme minimum kontrol sağlar ve genellikle fonksiyonalize alanlarında örtüşme ile sonuçlanır. Burada, yeni bir Ar-μCP sistemi bu sınırlamanın üstesinden gelmek için kullanılır ve onun yetenek için doğru model 300 mikron ID ve 600 mikron OD 600 mikron ile PEG fırça annuli ayrı bir dizi içinde terminal alkin grupları sunulması ile PEG fırça annuli bir dizi Terminal azid gruba sunulması kimliği ve 900 mikron OD 14 gösterilmiştir. PEG sunma Alkinin reaksiyonunu takiben 3 -Biyotin Azit-PEG ile fırçalar ve PEG sunma azitin reaksiyon DBCO-PEG 4 -Biyotin ile fırçalar, alt tabaka F (floresan probları ile boyanmış ve bir konfokal mikroskop kullanılarak görüntülendiigure 4). Hesaplanan özel bir MATLAB programı kullanılarak bu görüntülerin analizi iki PEG fırça dizileri X ~ 6.4 mikron, Y ~ 1.7 mikron, alt-10 mikron doğruluk, yani hizalanmış ve θ ~ 0.02 °, üreticinin de hangi sınırı atıf olduğunu Bizim SCARA modeli (yani, ~ 10 mikron) ve R-μCP sistemin geçmiş performansı 14 göstergesi olan. Böylece, bu sistemde yüksek uç SCARAs kullanımı daha da düşük, alt-mikron çözünürlük sağlayacağını inanıyoruz. Bu sonuçlar R μCP sistemi ve sıralı nükleofilik ikame reaksiyonlarının birlikte kullanımı ile mümkün olan çok yönlü bir alt-tabaka mühendislik yeteneklerini gösterir. Ortogonal yüzey kimyaları floresan etiketleme ile kanıtlandığı az çapraz reaktiflik doku mühendisliği uygulamaları için karmaşık bir kültür alt-tabakaların üretilmesi için biyokimyasal işaretlerin tam hareketsiz hale getirmek için bu sistemin potansiyel göstermeye hizmet eder. &lt;/ P&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig2highres.jpg" /> Şekil 2. R μCP Süreci şematik. Yukarı bakan kamera ile PDMS damga referans işaretleri görselleştirme - (A) Aşağıya doğru kamerayı hareketsiz altın kaplamalı slayt görüntülenmesi, damga yuvalama fikstür PDMS damgası kaldırarak altın kaplı coverslide (B) aşındırma referans işaretleri, (C), (E D) karşı karşıya , alkantiyol başlatıcı banyosu PDMS damga yerleştirme (F), (G) kurutma azot akarsu üzerinde solvent başlatıci alkanetiyol ve altın kaplı coverslide on (H) damgalama alkantiyol kaplı PDMS damgası. <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52186/52186fig4highres.jpg" /> Micropatterned Slide Şekil 4. İmmüno Görüntüler. </strong&gt; R-μCP micropatterned coverslide dik terminal (A), azid ve (B) &#39;alkin grupları sunmak için fonksiyonalize bakır içermeyen ve bakır aracılı tıklama kimyası kullanılarak biyotinile edilmiş, sırasıyla streptavidin-488 ve -546 ile tespit edilir. Hem fluoresan hem kanal (C) Kaplama. Tüm ölçek 500 mikron barlar.

Watch this Scientific Journal Video about Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R-Ã‚ÂµCP and Sequential Nucleophilic Substitution at JoVE.com

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- &#181;CP and Sequential Nucleophilic Substitution

Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands.

Robotik Microcontact Baskı (R-μCP) kullanarak Karmaşık Kültürü Substratlar ve Sıralı nükleofilik Giren Fabricating

In tissue engineering, it is desirable to exhibit spatial control of tissue morphology and cell fate in culture on the micron scale. Culture substrates ...

fabricating-complex-culture-substrates-using-robotic-microcontact

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing (R-&#181;CP) and Sequential Nucleophilic Substitution

10.4K Görüntüleme.  University of Wisconsin, Madison. Cell culture substrates functionalized with microscale patterns of biological ligands have immense utility in the field of tissue engineering. Here, we demonstrate the versatile and automated manufacture of tissue culture substrates with multiple, micropatterned poly(ethylene glycol) brushes presenting orthogonal chemistries that enable spatially precise and site-specific immobilization of biological ligands. 

Video: Fabricating Complex Culture Substrates Using Robotic Microcontact Printing R- µCP and Sequential Nucleophilic Substitution

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

Protein ve hücre Etrafının İki Boyutlu Desenli Yüzeyler Oluşturma

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Biyomühendislik

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a stable interface that permits efficient electron transport and protects underlying substrates from oxidative degradation. Group IV semiconductors can be effectively protected with highly-ordered self-assembled monolayers (SAMs) composed of simple alkyl chains that act as impervious barriers to both organic and aqueous solutions. Simple alkyl SAMs, however, are inert and not amenable to traditional patterning techniques. The motivation for immobilizing organic molecular systems on semiconductors is to impart new functionality to the surface that can provide optical, electronic, and mechanical function, as well as chemical and biological activity. 
Microcontact printing (&mu;CP) is a soft-lithographic technique for patterning SAMs on myriad surfaces.1-9 Despite its simplicity and versatility, the approach has been largely limited to noble metal surfaces and has not been well developed for pattern transfer to technologically important substrates such as oxide-free silicon and germanium. Furthermore, because this technique relies on the ink diffusion to transfer pattern from the elastomer to substrate, the resolution of such traditional printing is essentially limited to near 1 &mu;m.10-16
In contrast to traditional printing, inkless &mu;CP patterning relies on a specific reaction between a surface-immobilized substrate and a stamp-bound catalyst. Because the technique does not rely on diffusive SAM formation, it significantly expands the diversity of patternable surfaces. In addition, the inkless technique obviates the feature size limitations imposed by molecular diffusion, facilitating replication of very small (&lt;200 nm) features.17-23 However, up till now, inkless &mu;CP has been mainly used for patterning relatively disordered molecular systems, which do not protect underlying surfaces from degradation.
Here, we report a simple, reliable high-throughput method for patterning passivated silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate selective functionalization of the patterned substrates with both small molecules and proteins. The technique utilizes a preformed NHS-reactive bilayered system on oxide-free silicon and germanium. The NHS moiety is hydrolyzed in a pattern-specific manner with a sulfonic acid-modified acrylate stamp to produce chemically distinct patterns of NHS-activated and free carboxylic acids. A significant limitation to the resolution of many &mu;CP techniques is the use of PDMS material which lacks the mechanical rigidity necessary for high fidelity transfer. To alleviate this limitation we utilized a polyurethane acrylate polymer, a relatively rigid material that can be easily functionalized with different organic moieties. Our patterning approach completely protects both silicon and germanium from chemical oxidation, provides precise control over the shape and size of the patterned features, and gives ready access to chemically discriminated patterns that can be further functionalized with both organic and biological molecules. The approach is general and applicable to other technologically-relevant surfaces.

Here we describe a simple method for patterning oxide-free silicon and germanium with reactive organic monolayers and demonstrate functionalization of the patterned substrates with small molecules and proteins. The approach completely protects surfaces from chemical oxidation, provides precise control over feature morphology, and provides ready access to chemically discriminated patterns.

Yumuşak Litografik işlevsellik ve Desenlendirme Oksit Silisyum ve germanyum

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design efficacious vaccines carriers. Nanoparticle-based platforms can prolong the persistence of vaccine antigens, which could improve vaccine immunogenicity1. Several biodegradable polymers have been studied as vaccine delivery vehicles1; in particular, polyanhydride particles have demonstrated the ability to provide sustained release of stable protein antigens and to activate antigen presenting cells and modulate immune responses2-12.
The molecular design of these vaccine carriers needs to integrate the rational selection of polymer properties as well as the incorporation of appropriate targeting agents. High throughput automated fabrication of targeting ligands and functionalized particles is a powerful tool that will enhance the ability to study a wide range of properties and will lead to the design of reproducible vaccine delivery devices.
The addition of targeting ligands capable of being recognized by specific receptors on immune cells has been shown to modulate and tailor immune responses10,11,13 C-type lectin receptors (CLRs) are pattern recognition receptors (PRRs) that recognize carbohydrates present on the surface of pathogens. The stimulation of immune cells via CLRs allows for enhanced internalization of antigen and subsequent presentation for further T cell activation14,15. Therefore, carbohydrate molecules play an important role in the study of immune responses; however, the use of these biomolecules often suffers from the lack of availability of structurally well-defined and pure carbohydrates. An automation platform based on iterative solution-phase reactions can enable rapid and controlled synthesis of these synthetically challenging molecules using significantly lower building block quantities than traditional solid-phase methods16,17.
Herein we report a protocol for the automated solution-phase synthesis of oligosaccharides such as mannose-based targeting ligands with fluorous solid-phase extraction for intermediate purification. After development of automated methods to make the carbohydrate-based targeting agent, we describe methods for their attachment on the surface of polyanhydride nanoparticles employing an automated robotic set up operated by LabVIEW as previously described10. Surface functionalization with carbohydrates has shown efficacy in targeting CLRs10,11 and increasing the throughput of the fabrication method to unearth the complexities associated with a multi-parametric system will be of great value (Figure 1a).

In this article, a high throughput method is presented for the synthesis of oligosaccharides and their attachment to the surface of polyanhydride nanoparticles for further use in targeting specific receptors on antigen presenting cells.

Polianhidrid Nanopartiküller Yüksek throughput Karbonhidrat sentezi ve işlevsel

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. Development of microcontact printing by the Whitesides group (<a href="http://gmwgroup.harvard.edu/">http://gmwgroup.harvard.edu/</a>) in the mid-1990s revolutionalized this field by making microelectronics/microfabrication techniques accessible to laboratories focused on the life sciences. Initial implementations of this method used polydimethylsiloxane (PDMS) stamps to create patterns of functionalized chemicals on material surfaces1. Since then, a range of innovative approaches have been developed to pattern other molecules, including proteins2. This video demonstrates the basic process of creating PDMS stamps and uses them to pattern proteins, as these steps are difficult to accurately express in words. We focus on patterning the extracellular matrix protein fibronectin onto glass coverslips as a specific example of patterning.
An important component of the microcontact printing process is a topological master, from which the stamps are cast; the raised and lowered regions of the master are mirrored into the stamp and define the final pattern. Typically, a master consists of a silicon wafer coated with photoresist and then patterned by photolithography, as is done here. Creation of masters containing a specific pattern requires specialized equipment, and is best approached in consultation with a fabrication center or facility. However, almost any substrate with topology can be used as a master, such as plastic diffraction gratings (see Reagents for one example), and such serendipitous masters provide readily available, simple patterns. This protocol begins at the point of having a master in hand.

Microcontact printing is used extensively to pattern proteins and other molecules on material surfaces. We demonstrate the basic steps of this process, stamping patterns of fibronectin onto glass.

Proteinlerin Hücre Biyolojisi Microcontact Baskı

The ability to pattern proteins and other biomolecules onto substrates is important for capturing the spatial complexity of the extracellular environment. ...

Biyoloji

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Robot sıvı işleme derleme modüler DNA cihazların otomatik

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Functional Surface-immobilization of Genes Using Multistep Strand Displacement Lithography

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic bioreactor system. In contrast to other approaches towards artificial cellular systems, such a setup allows for a continuous supply with gene expression reagents and simultaneous draining of waste products. This facilitates the implementation of cell-free gene expression processes over extended periods of time, which is important for the realization of dynamic gene regulatory feedback systems. Here we provide a detailed protocol for the fabrication of genetic biochips using a simple-to-use lithographic technique based on DNA strand displacement reactions, which exclusively uses commercially available components. We also provide a protocol on the integration of compartmentalized genes with a polydimethylsiloxane (PDMS)-based microfluidic system. Furthermore, we show that the system is compatible with total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, which can be used for the direct observation of molecular interactions between DNA and molecules contained in the expression mix.

We describe a simple lithographic procedure for the immobilization of gene-length DNA molecules on a surface, which can be used to perform cell-free gene expression experiments on biochips.

Genlerin Multistep Strand deplasman litografi kullanarak işlevsel yüzey immobilizasyon

Immobilization of genes on lithographically structured surfaces allows the study of compartmentalized gene expression processes in an open microfluidic ...

Biomimetic Replication of Root Surface Microstructure using Alteration of Soft Lithography

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, biomimetic surfaces mimicking the microstructure of leaf surface, were used to study the effects of leaf microstructure on leaf-environment interactions. However, no such tool exists for roots. We developed a tool allowing the synthetic mimicry of the root surface microstructure into an artificial surface. We relied on the soft lithography method, known for leaf surface microstructure replication, using a two-step process. The first step is the more challenging one as it involves the biological tissue. Here, we used a different polymer and curing strategy, relying on the strong, rigid, polyurethane, cured by UV for the root molding. This allowed us to achieve a reliable negative image of the root surface microstructure including the delicate, challenging features such as root hairs. We then used this negative image as a template to achieve the root surface microstructure replication using both the well-established polydimethyl siloxane (PDMS) as well as a cellulose derivative, ethyl cellulose, which represents a closer mimic of the root and which can also be degraded by cellulase enzymes secreted by microorganisms. This newly formed platform can be used to study the microstructural effects of the surface in root-microorganism interactions in a similar manner to what has previously been shown in leaves. Additionally, the system enables us to track the microorganism&#8217;s locations, relative to surface features, and in the future its activity, in the form of cellulase secretion.

Biomimetics has been previously used as a tool to study leaf-microorganism interactions. However, no such tool exists for roots. Here, we develop a protocol to form synthetic surfaces mimicking root surface microstructure for the study of root-environment interactions.

Yumuşak Litografi Değişimi Ile Kök Yüzey Mikroyapısının Biyomimetik Replikasyonu

Biomimetics is the use of chemistry and material sciences to mimic biological systems, specifically biological structures, to better humankind. Recently, ...

Generation of Multicue Cellular Microenvironments by UV-Photopatterning of Three-Dimensional Cell Culture Substrates

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand distribution and tissue geometry, have been increasingly shown to play critical roles in governing cell phenotype and behavior. However, these environmental cues and their effects on cells are often studied separately using in vitro platforms that isolate individual cues, a strategy that heavily oversimplifies the complex in vivo situation of multiple cues. Engineering approaches can be particularly useful to bridge this gap, by developing experimental setups that capture the complexity of the in vivo microenvironment, yet retain the degree of precision and manipulability of in vitro systems.
This study highlights an approach combining ultraviolet (UV)-based protein patterning and lithography-based substrate microfabrication, which together enable high-throughput investigation into cell behaviors in multicue environments. By means of maskless UV-photopatterning, it is possible to create complex, adhesive protein distributions on three-dimensional (3D) cell culture substrates on chips that contain a variety of well-defined geometrical cues. The proposed technique can be employed for culture substrates made from different polymeric materials and combined with adhesive patterned areas of a broad range of proteins. With this approach, single cells, as well as monolayers, can be subjected to combinations of geometrical cues and contact guidance cues presented by the patterned substrates. Systematic research using combinations of chip materials, protein patterns, and cell types can thus provide fundamental insights into cellular responses to multicue environments.

Traditionally, cell culture is performed on planar substrates that poorly mimic the natural environment of cells in vivo. Here we describe a method to produce cell culture substrates with physiologically relevant curved geometries and micropatterned extracellular proteins, allowing systematic investigations into cellular sensing of these extracellular cues.

Üç Boyutlu Hücre Kültürü Substratlarının UV-Fotodesenlenmesi ile Multicue Hücresel Mikro Ortamların Oluşturulması

The extracellular matrix is an important regulator of cell function. Environmental cues existing in the cellular microenvironment, such as ligand ...

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazları için 3D Baskı Uygulamaları

Two-Photon Polymerization 3D-Printing of Micro-scale Neuronal Cell Culture Devices

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, and realistic synaptic connectivity are missing. The latter limits the study of structure and function in the context of compartmentalization and diminishes the significance of cultures in neuroscience. Approximating ex vivo the structured anatomical arrangement of synaptic connectivity is not trivial, despite being key for the emergence of rhythms, synaptic plasticity, and ultimately, brain pathophysiology. Here, two-photon polymerization (2PP) is employed as a 3D printing technique, enabling the rapid fabrication of polymeric cell culture devices using polydimethyl-siloxane (PDMS) at the micrometer scale. Compared to conventional replica molding techniques based on microphotolitography, 2PP micro-scale printing enables rapid and affordable turnaround of prototypes. This protocol illustrates the design and fabrication of PDMS-based microfluidic devices aimed at culturing modular neuronal networks. As a proof-of-principle, a two-chamber device is presented to physically constrain connectivity. Specifically, an asymmetric axonal outgrowth during ex vivo development is favored and allowed to be directed from one chamber to the other. In order to probe the functional consequences of unidirectional synaptic interactions, commercial microelectrode arrays are chosen to monitor the bioelectrical activity of interconnected neuronal modules. Here, methods to 1) fabricate molds with micrometer precision and 2) perform in vitro multisite extracellular recordings in rat cortical neuronal cultures are illustrated. By decreasing costs and future widespread accessibility of 2PP 3D-printing, this method will become more and more relevant across research labs worldwide. Especially in neurotechnology and high-throughput neural data recording, the ease and rapidity of prototyping simplified in vitro models will improve experimental control and theoretical understanding of in vivo large-scale neural systems.

Yazar Spotlight: Beyin Fonksiyonlarını Analiz Etmek için Modüler Nöronal Ağlar

3D printing at the micrometer scale enables rapid prototyping of polymeric devices for neuronal cell cultures. As a proof-of-principle, structural connections between neurons were constrained by creating barriers and channels influencing neurite outgrowth, while the functional consequences of such manipulation were observed by extracellular electrophysiology.

Mikro Ölçekli Nöronal Hücre Kültürü Cihazlarının İki Foton Polimerizasyonu 3D Baskısı

Neuronal cultures have been a reference experimental model for several decades. However, 3D cell arrangement, spatial constraints on neurite outgrowth, ...