Name: a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium
Uploaded: 2014-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

Bu çalışma n 602.699 (DIREKT) ° hibe sözleşmesi kapsamında İsveç Araştırma Konseyi (90.293.501, A0290401, A0290402), Avrupa Topluluğu Yedinci Çerçeve Programı hibe tarafından desteklenen, Novo Nordisk Vakfı, Gurli ve Edward Brunnberg Vakfı, Tedavi, Vleugel Kök Vakıf ve Åke Wiberg Vakfı.

NOT: Kan Uppsala Etik Değerlendirme Kurulu (Izin sayılı 2008/264) ile onayı açık sistem Venipunktür sağlıklı bireylerden çizildi. 1. Tohum Hücreler <ol><li> T75 şişeleri içinde% 5 37 ° C&#39;de CO2 ile kültür primer insan göbek damar endotelial hücreleri (HUVEC), PBS pH 7.4 içinde% 1 jelatin ile kaplanan. </li><li> T75 HUVEC ihtiva eden bir şişeye (ya da primer insan endotelyal hücreleri bir türden) kültür ortamı çıkarın ve PBS pH 7.4 içinde 2.1 mM EDTA ile hücrelerin yıkayın. 37 ° C, 3 dakika - 1 mi,% 0.25 tripsin-EDTA ekleyerek ve 2 inkübe edilerek hücreleri ayırın. </li><li> PBS pH 7.4 içinde 9 ml% 10 FBS ile balon durulanarak hücrelerini toplamak ve 15 ml&#39;lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın. 5 dakika boyunca 735 xg&#39;de hücreleri aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı ve endotel hücre büyüme ortamı mikrovasküler (AT GMMV) dikkatli bir hücre pelletini tekrar süspansiyon ve bir Bürker bölmesi içinde hücreleri sayın. 21,000 c Seedarşın / 1-kuyulu hücre kültürü slaytlar cm2 ve 37 ° C&#39;de inkübe edin. Kültür - 2 gün HUVEC sonra 1 birleştirilebilmeli olacaktır. Bir ışık mikroskobu altında hücre morfolojisi ve kaynaşma gazetesine izleyin. </li></ol> Tüm Kan 2. Hazırlık <ol><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak hareketsizleştirilen heparin (CHS) içindeki bir çift tabaka ile kan ile temas halinde olan tüm yapay yüzeylerin hazırlayın. Tozdan, CHS Kaplanmış malzemeler fonksiyon kaybı olmaksızın 6 aya kadar oda sıcaklığında saklanabilir. </li><li> Kan endotel odası deneye başlamadan önce kısa bir süre sağlıklı bir donörden (&lt;30 dakika) kan çekmek için açık sistem Damara kullanın. Dikkatli bir CHS kaplı 50 ml tüp kan toplama önce: (2 mm iç çap) çift bir derialtı iğne CHS kaplamalı silikon tüp için (18 G 50 mm x). Fraksiyonlanmamış heparin ile Ek kan 0.75 IU / ml&#39;lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere. Inve yavaşça kan karıştırın- 3 kez tüpü 2 rting. </li></ol> 3. Kan Endotel Odası Modeli <ol><li> PMMA slayt (25 x 75 mm) &#39;ye yapıştırılmıştır iki silindir (yükseklik 8 mm çapı 9 mm)&#39; den oluşan akrilik polimetil metakrilat (PMMA) &#39;de, kan bölmeyi (üstten bakış Şekil 1A) imal. Kültürlü endotel hücreleri (Şekil 1B) ile cam slaytlar karşı kan odası mühür kauçuk O-halkaları ile yukarı bakacak silindir kenarlarına uyacak. Daha sonra dikey bir pozisyonda (Şekil 1C), endotel hücreleri ile kültür sürgüye bağlı olan, kan odaları döndürün. </li><li> Kan etkinleştirmek için değil kamara alarak dikkat kaplı her CHS içine 1.5 ml kan aktarmak için bir CHS kaplı pipet kullanın. </li><li> MK ul 0,34 3 EDTA 30 ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüplerine transfer 1 ml kan kullanılarak yapılan ilk plazma protein konsantrasyonlarının belirlenmesi için, 10 mM K 3 EDTA bir son konsantrasyon elde etmek üzerebir enzim immün testi (ELISA). Dikkatle kan karıştırın ve buz üzerinde tüpler tutmak. </li><li> PBS pH 7.4 içinde Hücreleri yıkamak dikkatli bir şekilde, üretici talimatlarına uygun olarak hücre kültürü cam slaytların plastik duvarlar çıkarın ve. Sonradan slaytlar mümkün olduğunca çok sıvı çıkarmak için emin olun. Hücreler kurumasına izin vermeyin. </li><li> Kan bakan hücreleri ile kan bölmelerin üzerine slayt yerleştirin. Kan endotel hücre odasının etrafında bir kelepçe koyarak slayt sabitleyin. Kelepçenin yerleştirirken hücre kültürü cam slayt kırılmasını önlemek için ek destek için plastik bir slayt kullanın. </li><li> Bir 37 ° C su banyosu içinde dönen bir tekerlek üzerinde, kan endotel hücre bölme saptamak (40 cm çapında), bir yer. 30 dakika boyunca 0.5 xg&#39;de tekerleğin her odasına döndürün. </li><li> İnkübasyondan sonra, kan endotel hücre bölme ortadan kaldırmak. F PBS pH 7.4 &#39;da hücre kültürü slaytlar yıkayıp (PFA), buz gibi soğuk% 1 paraformaldehid içinde hücrelerin tespit edilmeleriya da 10 dakika. | Il 0.34 MK 3 EDTA 30 ihtiva mikrosantrifüj tüplerine her bölmeden transfer 1 ml kan, 10 mM K 3 EDTA bir nihai konsantrasyona ulaşmak ve Tüpleri yavaşça karıştırın. Buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4560 x g&#39;de tüpler santrifüjleyin. Daha fazla analiz edilinceye kadar -70 ° C&#39;de yeni bir mikrosantrifüj tüpleri ve saklamak için kan plazması aktarın. </li></ol> Kan Endotel Etkileşimleri 4. Analizi <ol><li> İkinci keçi anti-fare Alexa 488 ve falloidin-TexasRed ardından fare anti-insan CD16 ile immünofloresan boyama yapın. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her boyama adımı gerçekleştirmek ve her adım arasında PBS pH 7.4 slaytlar yıkayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca DAPI ile çekirdek Counterstain. Görüntü analizi gibi CellProfiler gibi uygun resim analiz yazılımı kullanılarak kombinasyon halinde floresan mikroskobu altında endotel hücrelerine bağlı kan bileşiklerinin analiz edin. </li><li> QuantiFY plazma numunelerinin üreticinin talimatlarına göre trombin antitrombin (TAT) ELISA ile, kan bölmesine reaksiyonları. </li><li> Uygun istatistiksel araçlar, örneğin kullanın., Eşleşmemiş bir t testi, verileri analiz etmek. </li></ol>

<ol>
	<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+Mice+and+Not+Men:+Differences+between+Mouse+and+Human+Immunology.">Of Mice and Not Men: Differences between Mouse and Human Immunology.</a> J Immunol. 172 (2), 2731-2738 (2004).</li><li>Seok, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+responses+in+mouse+models+poorly+mimic+human+inflammatory+diseases.">Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3507-3512 (2013).</li><li>Hong, J., Ekdahl, K. N., Reynolds, H., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vitro+model+to+study+interaction+between+whole+blood+and+biomaterials.+Studies+of+platelet+and+coagulation+activation+acid+the+effect+of+aspirin.">A new in vitro model to study interaction between whole blood and biomaterials. Studies of platelet and coagulation activation acid the effect of aspirin.</a> Biomaterials. 20 (7), 603-611 (1999).</li><li>Doctor, A., Spinella, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Processing+and+Storage+on+Red+Blood+Cell+Function+In.">Effect of Processing and Storage on Red Blood Cell Function In.</a> Vivo. Semin Perinatol. 36 (4), 248-259 (2012).</li><li>Andersson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+heparin+surface+concentration+and+antithrombin+binding+capacity+as+evaluated+with+human+non-anticoagulated+blood+in+vitro.">Optimal heparin surface concentration and antithrombin binding capacity as evaluated with human non-anticoagulated blood in vitro.</a> J Biomed Mater Res A. 67 (2), 458-466 (2003).</li><li>Ekdahl, K. N., Hong, J., Hamad, O. A., Larsson, R., Nilsson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+blood+compatibility+of+materials,+cells,+and+tissues:+basic+concepts,+test+models,+and+practical+guidelines.">Evaluation of the blood compatibility of materials, cells, and tissues: basic concepts, test models, and practical guidelines.</a> Adv Exp Med Biol. 735, 257-270 (2013).</li><li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+dynamics+of+the+endothelium.">Spatial and temporal dynamics of the endothelium.</a> J Thromb Haemost. 3 (7), 1392-1406 (2005).</li><li>Cines, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+in+physiology+and+in+the+pathophysiology+of+vascular+disorders.">Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders.</a> Blood. 91 (10), 3527-3561 (1998).</li><li>Kirchhofer, D., Tschopp, T. B., Hadvary, P., Baumgartner, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+stimulated+with+tumor+necrosis+factor-alpha+express+varying+amounts+of+tissue+factor+resulting+in+inhomogenous+fibrin+deposition+in+a+native+blood+flow+system.+Effects+of+thrombin+inhibitors.">Endothelial cells stimulated with tumor necrosis factor-alpha express varying amounts of tissue factor resulting in inhomogenous fibrin deposition in a native blood flow system. Effects of thrombin inhibitors.</a> J Clin Invest. (5), 2073-2083 (1994).</li><li>Esmon, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+circuits+in+thrombosis+and+inflammation.">Molecular circuits in thrombosis and inflammation.</a> Thromb Haemost. 109 (3), 416-420 (2013).</li><li>Rosenberg, R. D., Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular-Bed&#8211;Specific+Hemostasis+and+Hypercoagulable+States.">Vascular-Bed&#8211;Specific Hemostasis and Hypercoagulable States.</a> N Engl J Med. 340 (20), 1555-1564 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> Kan ve damar duvarı arasında çok sayıda etkileşim nedeniyle normalde endotelyumun yapıştırıcı olmayan ve anti-trombotik yapılı bir hareketsiz bir halde muhafaza edilmektedir. 7 iltihabı kapsayan patolojik durumlar esnasında, endotel yapışma reseptör ifadesi 8&#39;de ortaya çıkan bir artış ile aktive edilir ve Bir yeteneği azalır inhibe hemostaz. sırayla kan kaskad sistemlerin 9 aktivasyonu daha tromboz ve lökosit neden endotel trombojenisiteyi güçlendirir. 10 endotelyal hücreler ve tam kandan arasındaki bu hassas etkileşimleri daha iyi bir anlayış kazanmak için, biz var kültürlenmiş endotel hücreleri, tam kan ile temas içinde yerleştirilir bir in vitro yöntem roman geliştirdi. Bildiğimiz kadarıyla, bizim kurulum daha uzun süreler için hiçbir ile tam insan kanı ya da çok az antikoagülan ile kuluçkaya endotel hücreleri göstermek için ilk. nt &quot;&gt; Bu sistemin duyarlılığı kan ile temas halinde yerleştirilen tüm yüzeyler üzerinde immobilize heparin koruyucu bir tabaka ile kombinasyon halinde açık sistem delme ile etkinleştirilir., kan tedarik esnasında açık bir sistem kullanılması damar delinerek sırasında kademeli sistemlerinin aktivasyonu azaltır pıhtılaşma önleyici bir kendi kendine belirlenmiş bir miktarının kullanımına olanak iken. Ticari olarak temin edilebilen boşaltılmış kan tüplerinden Bununla birlikte, araştırmanın amaçlanan nihai noktalara bağlı olarak kullanılabilmektedir. piyasada bulunan kapalı bir sistem tüplere ilave antikoagülan nihai konsantrasyon duyarlı önleyebilir ve aksi sabit kurulumunda, etkileşimini incelemek. 6 koruyucu heparin yüzeyi, bundan başka, endotel hücreleri dışında herhangi bir yüzey ile yüzey teması kanın aktivasyonunu ortadan kaldırır. 5 Gerçekten de, fraksiyonlanmamış heparin, az miktarda ilave edilmiş tüm kanın inkübasyona CHS koruma olmadan oda pıhtı oluşmasına neden oldu. <pSınıf = &quot;jove_content&quot;&gt; hazne içerisindeki hava kabarcığı endotel hücreleri ile inkübasyon sırasında kan karıştırılmasını sağlar. Hava baloncuk büyüklüğünün etkisini değerlendirmek için, iki farklı kan hacmine kullanılır. Bu modelde, HUVEC ile inkübe odalarına bağımsız olarak hava kabarcığı boyutu içindeki TAT seviyeleri ölçüldü. TAT, ancak tam CHS daha küçük bir hava kabarcığı boyutu ile artan odaları muamele edilmiş oldu. Bu, daha önce tarif endotel hücre özellikleri 11 uygun olarak, atıl CHS bölmesi içinde eksik olan endotel hücreleri tarafından sağlanan pıhtılaşmasının artması aktivasyonu üzerine düzenleyici bir etkisi gösterir. Sistemde hava kabarcığı bölmenin dönüş hareketi üzerine bir hava akımı yaratır. Balonun büyüklüğü bu dönen sistem içinde güçleri etkileyecektir. Bu küçük bir kabarcık, kan yani üzerine bir azalma kuvveti temsil eden yüksek TAT değerleri oluşturur Şekil 2B bizim sonuçlarla vardı gösterilir, kan hareketihaznesinin alt ve kaskadlı sistemin böylelikle aktivasyonu daha yüksek bir düzeye kadar ayrılması cereyan içinde. Bu sistemde, bizler, duvarlar ve merkezi düşük boyunca en yüksek hız ile bölmesi üzerinde hız farklı olacak bir döner akış oluşturma olduğu belirtilmelidir. Bu tabii ki endotel hücreleri için akış açısından ve makaslama kuvvetleri ile optimal bir ortam değil, ama yine de biz istikrarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar üreten bir sistem var. Diğer uygun koşullar türbülans olmadığında laminer akış sirkülasyon içerir. Bu, burada gösterilen modelde, ancak, mümkün değildir, bizim bilgimize göre, böyle bir sistem Şu an için mevcut değildir. , Sisteme eklenen antikoagülan için hiç veya düşük seviyeleri ile tam kan ile birleştirmek mümkün olmayan çok sayıda mikro-akışkan sistemleri piyasada mevcut olmasına rağmen bu şekilde, kan ve endotelyal hücrelerde bulunan tüm bileşenler arasındaki etkileşimlerin uygun hassas değerlendirilmesine olanak başarısız. Ayrıca, TNFa, bağımsız bir kan hacminin TAT&#39;ın bir kat oluşumu ile birlikte, HUVEC aktive yönelik kan hücrelerinin işe bir 2-kat daha yüksek olmuştur. Bu model sisteminin stabilitesini doğrular ve ayrıca, bütün kandan ile kombinasyon halinde bir aktive endoteli kullanma olasılığını göstermektedir. Kan endotel hücre bölmesi çeşitli koşullar ve aktivasyon safhaları altında hücreleri üzerinde ifade edilen markerler arasında çeşitli aktive edilmiş endotel hücrelerine karşı daha fazla kan hücre alımını incelemek için kullanılabilir Gelecekteki. Model ayrıca iltihaplı durumların üzerindeki etkileri değerlendirmek için yapılan farmakolojik maddeler ile kombinasyon halinde kullanılabilmektedir. Özetle, biz vasküler hastalık ilgili araştırmalar yapmaya vitro sistemde tam bir beşer yaratacağım insan kanı ve damar hücreleri ile bir odası modeli birleştirerek büyük fayda göstermektedir.

Kardiyovasküler hastalık kan-damar etkileşimlerini analiz yöntemleri genel hayvan araştırma deneyleri içeren. Deneysel araştırmalar hayvan modellerinde oluşturulur Bununla birlikte, sonuçlar. Insan hastalıkları için çok az veya hiç bir etkisi vardır, 1,2 olabilir, kan bölmesi ve vasküler endotel hücrelerinde arasındaki hücresel etkileşimlerini incelemek üzere in vitro modellerde iyi ve güvenli bir ihtiyaç vardır Bir insan gibi sistem. Bu nedenle bir kan endotel hücre odası modelini kurduk. Bu biyomalzeme ve insan bütün kan arasındaki etkileşimi araştırmak için kullanılan daha önce tarif edilen modeline dayanır., Genellikle saflaştırılmış bileşenler, sınırlı sayıda diğer in vitro kurulumları 3 aksine örneğin, trombositler, lökositler ya da endotel hücrelerinde mevcuttur, bu model, tüm kapsar Bileşenler, bir kan damarı içinde mevcut. Kan endotel c kurulumuell odası modeli çok az veya hiç katma antikoagülan ile taze çekilmiş insan kanının kullanımını sağlamak için tasarlanmıştır. Uzun süreler boyunca depolanan kan yüzden eritrositlerin parçalanması kan ve endotel hücreleri arasındaki hassas etkileşim engel olabilir depolama lezyonlar olarak adlandırılan edinirler. 4 Ex vivo olarak bütün kanın kullanımı sırasında, pıhtı oluşumunu önlemek için antikoagülan veya kan ile temas halinde olan tüm madde olmayan aktive olması yüksek dozlar istenmektedir. Olmayan yüzey aktivasyonu laboratuar ortamında nadir olduğu için, malzeme seçenek olarak hareketsiz heparin bir koruyucu tabaka ile donatılmış olabilir. Hareketsizleştirilmiş heparin Koruyucu bir kat, kan iletişim Pıhtılaşma şelalesinin aktivasyonu neden olmaksızın ortaya çıkan bir yüzey oluşturarak çok malzeme tatbik edilebilir (buradan sonra Corline heparin yüzey (CHS) olarak anılacaktır). 5 Bu durumda, olan kabinleri mobilya tarafından CHS, kan endotel ceII haznesi modeli kan antikoagulan çok düşük konsantrasyonlarda kullanılmasını sağlar. Kan endotel odası modelinde antikoagülan yüksek konsantrasyonlarda ilave kaçınmak aksi maskelenebilir olabilecek bir kan damarının içindeki hassas etkileşimler üzerinde çalışmak mümkün kılar. 6 Plastik mikroskop lamı:;: (9 mm yarıçapı 8 mm yüksekliği) kan endotel hücre odası modeli plastik silindirler bağlanmasıyla oluşturulan iki odadan oluşmaktadır. Silindirlerin üzerinde yukarı bakacak şekilde kenarları hücre kültürü lâm odacıkları kapatılması için kullanılan lastik O-halkası ile donatılmıştır oluklar ile donatılmıştır. Bölmeler, yalnızca kısmen bölmeler daha sonra dik bir konumda (Şekil 1) döndürüldüğü zaman bölme içinde kalan bir hava hareketinin içine kan tutar olarak kan ile doldurulur. Modelin işlevselliğini değerlendirebilmek için, biz ya da tamamen CHS, kaplanmış olan deneyler yaptıkodası veya İnsan Umbilikal Ven Endotel Hücreleri (HUVEC). İki ayrı kan hacmi deneye tabi tutuldu ve trombin antitrombin (TAT) komplekslerinin (pıhtılaşmasının dolaylı bir göstergesi) oluşumu enzim bağlantılı immunosorbent tahlil (ELISA) ile ölçüldü. Daha sonra kan miktarı ve tümör nekroz faktörü (TNFa), resim analizi ile lökosit göçünün endotel hücrelerini stimüle etkisini değerlendirmiştir. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig1highres.jpg" /> Kan endotel hücre odası modeli 1. Setup Şekil. (A), en iyi PMMA yapılan kan odasının şematik bir çizimi görüntülemek. (B): Primer insan endotel hücreleri, 1-çukurlu oda slaytlar üzerinde kültürlenmiştir. Taze, insan bütün kan, bir mikroskop lamı üzerine iki bölme eklenir. Kan işlemek için kullanılan odaları ve tüm malzeme koruyucu HS kaplama ile tedavi edilir. Ce duvarlarını çıkardıktan sonrall kültür slayt, hücreler kana karşı karşıya yerleştirilir ve sistemin kapalı kenetlenir. (C) Kan endotel hücre bölmeler daha sonra 37 ° C olarak dönme altında inkübe edilir. Daha sonra, kan bölmesine reaksiyonlar ELISA ile analiz edilebilir ve endotel hücreleri mikroskopi ile analiz edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Human Umbilican Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>PromoCell</td><td>C-12200</td><td>Any other type of primary human endothelial cell may be used.</td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium MV (ECGM MV)</td><td>PromoCell</td><td>C-22120</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2500</td><td>Prepare 1% gelatin in PBS, incubate 5 ml in a T75 for 15 min and remove before culturing cells.</td></tr><tr><td>TAT ELISA</td><td>Enzyme Research Lab.</td><td>TAT-EIA-C</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-human CD16</td><td>DAKO</td><td>F7011</td><td>Dilution 1:100</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11001</td><td>Dilution 1:500</td></tr><tr><td>Phalloidin-Texas Red</td><td>Molecular Probes</td><td>A22287</td><td>Dilution 1:200</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Molecular Probes</td><td>D1306</td><td>Dilution 10 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-6758</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco Life Tecnologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco Life Technologies</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>1 well cell culture slides</td><td>BD Falcon</td><td>354101</td><td></td></tr><tr><td>Blood Chambers</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Blood Chamber may be manufactured in PMMA or any other plastic able to bind CHS</td></tr><tr><td>Clamps</td><td>Office Depot</td><td>2052204</td><td></td></tr><tr><td>Corline Heparin Surface (CHS)</td><td>Corline Systems AB</td><td>945-00</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle</td><td>Terumo</td><td>NN-1850R</td><td>Size: 18 G x 5 mm</td></tr><tr><td>Unfractionated Heparin (UFH)</td><td>Leo Pharma</td><td>585679</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>1709958</td><td>Prepare a 0.34 M stock solution in milliQ H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6148</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>Nikon</td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>Light microscope</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Image analysis software</td><td>Broad Institute</td><td>CellProfiler</td><td>Available for free at www.cellprofiler.org</td></tr></tbody></table>

a novel in vitro model for studying the interactions between human whole blood and endothelium

Tüm bilinen hastalıkların çoğunluğu kalp-damar sistemi bozukluklarının eşlik eder. Kalp-damar hastalıklarının sırasında aktif etkileşim yollarının karmaşıklığı çalışmalar, sağlam ve fizyolojik olarak ilgili yöntemler eksikliği ile sınırlıdır. Patolojik vasküler olayları modellemek için biz endotel ve bütün kan arasındaki etkileşimi incelemek için in vitro bir analiz geliştirdik. Tahlil, insan tüm kan ile temas halinde yerleştirilir primer insan endotel hücreleri oluşur. Yöntem, bir kan damarı içinde mevcut moleküler ve hücresel bileşenleri arasındaki hassas etkileşimlerin çalışma sağlayan, hiç veya çok az pıhtılaşma önleyici ile natif kan kullanmaktadır. Biz ile ya da insan göbek bağı damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) olmadan inkübe farklı kan hacmine göre pıhtılaşma aktivasyonu karşılaştırarak tahlilin özelliğe incelenmiştir. Daha büyük bir kan hacmi katkıda Oysatrombin antitrombin oluşumunda bir artış (TAT) kompleksleri, HUVEC varlığı koagülasyon indirgenmiş aktivasyonunu göstermiştir. HUVEC tümör nekroz faktörü (TNFa) ile uyarıldı ve kan temas sonrası, uyarılmamış hücrelere kıyasla, TNFa uyarılmış hücrelerde anlamlı olarak yüksek olduğu CD16 + hücrelerinin varlığı kurmak için Bundan başka, lökosit eklenme görüntü analizi uygulandı. Sonuç olarak, bu analiz, endotel ve kan bölmesi arasında etkileşimler altüst vasküler patolojiler, çalışma için tatbik edilebilir.

CHS Kaplama Gerekliliği Endotel hücreleri tarafından ortaya kişilerce belirli tam kanda tepkisini ölçmek için, kan endotel hücre bölmesi için kullanılan bütün malzeme kullanım öncesi CHS, bir kaplama ile temin edilmelidir. Şekil 2A, (sol) ve 30 dakika sonra, kaplanmamış odasını göstermektedir açıkça görülebilen bir pıhtı varken kan teması. Öte yandan, CHS ile bölmesi (Şekil 2A, sağ) tedavi edilmesi sonuçları, endotel hücre kan etkileşimler nedeniyle sağlanması, kontrolsüz aktivasyonu kan korur. Odasına Kan Hacminin Etkisi Aktive edilmiş koagülasyon faktörleri arasındaki etkileşim olasılığı artar gibi pıhtılaşma aktivasyonu durgun kan daha büyük ihtimal olması. Kan endotel hücre bölmesi modelinde kan bağlı bölmesi içinde hava kabarcığı dolaşımına hareket tutulur. O daSarf nedenle de hava kabarcığı boyutunu kan hacmindeki değişikliklerin etkisini belirlemek, ve, bir CHS kaplı odası, 1.5 ml veya 30 dakika boyunca 1.75 ml tam kan ile test edildi bir CHS kaplı cam slayt bağlandı. Kan 1.75 ml kan 1.5 mi (Şekil 2B) kullanılması durumuna kıyasla bölmeye eklendiğinde bir hava kabarcığı herhangi bir hareketi olmaksızın kan hacmi 2.5 kat daha büyüktür. Ölçülen TAT değerleri artmış kan hacmi (Şekil 2D) ile TAT-oluşumunu arttırmıştır önerdi. HUVEC (Şekil 2C), bütün haldeki kan, 1.5 veya 1.75 ya ml ile inkübe edildiğinde, herhangi bir fark endotel hücreleri, pıhtılaşmanın aktivasyon (Şekil 2D) etkili olabileceğini düşündürmektedir, iki grup arasında not edilmiştir. Kan Hücresi Elemanların TNFa&#39;nin Etkisi ve pıhtılaşma aktivasyonu Lökosit istihdamına TNFa etkisini incelemek amacıyla, HUVEC tedavi edildi20 ng ed / ml TNFa 4 saat kan teması önce. Kan temas - ya 1.5 ml ya da 1.75 ml kan -, kültür slaytlar, CD16 (Şekil 2F) için boyandı ve bundan sonra, 30 dakika boyunca sürdürüldü görüntülenmiş ve CD16 + hücrelerinin sayısı hesaplandı edildi. CD16 + hücrelerin işe 1.5 ml kan ile 100 256 CD16 + hücre / mm 2 (p &lt;0.0001) ve TNFa tedavisi (Şekil 2E) ile önemli ölçüde artmıştır ve 172 1.75 ml kan ile 378 (P &lt;0.0001). TAT komplekslerin oluşumu ya da TNFa, işlenmiş ve işlenmemiş hücreleri (Şekil 2G) ile inkübe kan ilgili plazma örneklerinde ölçülmüştür. Muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında, TNFa uyarılmış hücrelerin TAT komplekslerinin yaklaşık iki katına çıkmasına neden oldu. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52112/52112fig2.jpg" width="600" /> Incirobilyaları 2: Kan endotel hücre odası modeli İşlevsellik. CHS olan veya olmayan (A), Chambers, tam kan ile inkübe edildi. CHS olmadan, bir pıhtı 30 dakika sonra kuruldu. CHS yokken kuluçkaya kanda trombin antitrombin (TAT) kompleksleri, pıhtılaşma dolaylı işaretleyici, ölçülmesi&gt; 6000 ug / ml idi. (B), kan hacmi, farklı kan miktarı değişecektir, dönen hava kabarcığı hareket muhafaza. Bu 1.75 ml ilavesi ile 0.74 ml artacak ise kan 1.5 ml ilave edilmesiyle, bu hacim, 0.3 ml olacaktır. Konfluent tek tabaka faz kontrast mikroskopisi, tipik olarak endotel hücre morfolojisi önce (C), HUVEC görüntülü farklı kan hacimleri eklendiğinde kan teması. (D) tamamen CHS kaplı odaları için TAT değerleri hafif bir farklılık göstermektedir. 1.5 ml kan ilave 85 sonuçlandı 1.75 ml e ± 11 ug / ml (n = 7) göre 35 ile sonuçlanmıştır77; 70 ug / ml, TAT (s = 8). HUVEC aynı kan hacmi ile kuluçkaya yatırılır, bu fark, artık mevcut değildir; 1.5 ml 66 ± 55 ug / ml (n = 5) ve 66 ± 29 1.75 ml (n = 7), uyarılmamıştır ve TNFa ya da üzerinde CD16 + hücrelerinin sayısı. (D) miktarının belirlenmesi, mevcut sonra HUVECler uyarımlı için ug / ml kan teması. Ya da 1.75 ml (bazal:;: TNFa ya da 1.5 ml (256 ± 121 hücre / aa TNFa 100 ± 40 hücre / mm bazal) ile inkübe edilen hücreleri stimüle olan CD16 + hücre sayısı önemli ölçüde artmıştır 172 ± 67 hücre / mm; TNFa: tam kan, 378 ± 185 hücre / mm) (F), HUVEC falloidin (kırmızı için boyandı stimüle stimüle edilmemiş ve TNFa temsili görüntüleri), CD16 (yeşil) ve DAPI (mavi).. Ölçü bar = 250 um kan (1.5 mi ile inkübe edilen, tedavi edilmeyen hücrelere kıyasla TAT komplekslerin formasyonu yaklaşık TNFa ile iki katına (G) hücreler uyarılmış. 2.1 ± 0.1 kat daha fazla TAT, n = 3; 1.75 mi: 1.7 ± 1.0 kat daha fazla TAT, n = 4). Tüm değerler ortalama ± standart sapma olarak sunulmuştur; p değerleri eşleşmemiş t testi ile hesaplanmıştır. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52112/52112fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium at JoVE.com

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

A Novel<em&gt; In vitro</em&gt; İnsan Tüm Kan ve Endotelyumunun Arasındaki Etkileşimler incelenmesi için Model

The majority of all known diseases are accompanied by disorders of the cardiovascular system. Studies into the complexity of the interacting pathways ...

a-novel-vitro-model-for-studying-interactions-between-human-whole

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

9.4K Görüntüleme.  Uppsala University. The accessibility of reliable models to investigate vascular blood interactions in humans is lacking. We present an in vitro model of cultured primary human endothelial cells combined with human whole blood to investigate cellular interactions both in the blood (ELISA) and the vascular compartment (microscopy).

Video: A Novel In vitro Model for Studying the Interactions Between Human Whole Blood and Endothelium

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Biyomühendislik

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

hiPSC kaynaklı endotel hücrelerinin farklılaşması ve mekanik stimülasyonu

In Vitro Model of Fetal Human Vessel On-chip to Study Developmental Mechanobiology

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides transporting oxygen and nutrients to ensure fetal growth, fetal circulation controls many crucial developmental events taking place within the endothelial layer through mechanical cues. Biomechanical signals induce blood vessel structural changes, establish arteriovenous specification, and control the development of hematopoietic stem cells. The inaccessibility of the developing tissues limits the understanding of the role of circulation in early human development; therefore, in vitro models are pivotal tools for the study of vessel mechanobiology. This paper describes a protocol to differentiate endothelial cells from human induced pluripotent stem cells and their subsequent seeding into a fluidic device to study their response to mechanical cues. This approach allows for long-term culture of endothelial cells under mechanical stimulation followed by&#160;retrieval of the endothelial cells for phenotypical and functional characterization. The in vitro model established here will be instrumental to elucidate&#160;the intracellular molecular mechanisms that transduce the signaling mediated by mechanical cues, which ultimately orchestrate vessel development during human fetal life.

Yazar Spot Işığı: Akışkan Aracılı Mekanik Stimülasyon Altında Kültürlenen hiPSC'den Türetilmiş Endotel Hücrelerinin İncelenmesi 

Described here is a simple workflow to differentiate endothelial cells from human pluripotent stem cells followed by a detailed protocol for their mechanical stimulation. This allows for the study of the developmental mechanobiology of endothelial cells. This approach is compatible with downstream assays of live cells collected from the culture chip after mechanical stimulation.

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

The heart is the first organ to be functionally established during development, thus initiating blood circulation very early in gestation. Besides ...

Gelişim Biyolojisi

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of various important processes in the cardiovascular system. Recently, although several biological studies have been performed using such 3D models of human arteries, they have not been applied to study vascular targeting. This paper presents a new method to fabricate real-sized, reconstructed human arterial models using a 3D printing technique, line them with human endothelial cells (ECs), and study particle targeting under physiological flow. These models have the advantage of replicating the physiological size and conditions of blood vessels in the human body using low-cost components. This technique may serve as a new platform for studying and understanding drug targeting in the cardiovascular system and may improve the design of new injectable nanomedicines. Moreover, the presented approach may provide significant tools for the study of targeted delivery of different agents for cardiovascular diseases under patient-specific flow and physiological conditions.

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Here, we present a new protocol to study and map the targeted deposition of drug carriers to endothelial cells in fabricated, real-sized, three-dimensional human artery models under physiological flow. The presented method may serve as a new platform for targeting drug carriers within the vascular system.

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...

Assessment of the Anticoagulant and Anti-inflammatory Properties of Endothelial Cells Using 3D Cell Culture and Non-anticoagulated Whole Blood

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood coagulation. This phenomenon is observed in many clinical situations, like organ transplantation in the presence of pre-formed anti-donor antibodies, including xenotransplantation, as well as in ischemia/reperfusion injury. In order to reduce animal experimentation according to the 3R standards (reduction, replacement and refinement), in vitro models to study the effect of endothelial cell activation on blood coagulation would be highly desirable. However, common flatbed systems of endothelial cell culture provide a surface-to-volume ratio of 1 - 5 cm2 of endothelium per mL of blood, which is not sufficient for natural, endothelial-mediated anticoagulation. Culturing endothelial cells on microcarrier beads may increase the surface-to-volume ratio to 40 - 160 cm2/mL. This increased ratio is sufficient to ensure the &#34;natural&#34; anticoagulation of whole blood, so that the use of anticoagulants can be avoided. Here an in vitro microcarrier-based system is described to study the effects of genetic modification of porcine endothelial cells on coagulation of whole, non-anticoagulated human blood. In the described assay, primary porcine aortic endothelial cells, either wild type (WT) or transgenic for human CD46 and thrombomodulin, were grown on microcarrier beads and then exposed to freshly drawn non-anticoagulated human blood. This model allows for the measurement and quantification of cytokine release as well as activation markers of complement and coagulation in the blood plasma. In addition, imaging of activated endothelial cell and deposition of immunoglobulins, complement- and coagulation proteins on the endothelialized beads were performed by confocal microscopy. This assay can also be used to test drugs which are supposed to prevent endothelial cell activation and, thus, coagulation. On top of its potential to reduce the number of animals used for such investigations, the described assay is easy to perform and consistently reproducible.

We present an in vitro model which allows the study and analysis of coagulation in whole, non-anticoagulated blood. Anticoagulation in the system depends on the natural anticoagulation effect of healthy endothelial cells and endothelial cell activation will result in clotting.

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In vivo, endothelial cells are crucial for the natural anticoagulation of circulating blood. Consequently, endothelial cell activation leads to blood ...

Tıp

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

A Novel

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Vasküler Hücre Remodeling Soruşturma Fizyolojik in vitro Modeli ve Uygulaması ile Patolojik Kan Akış

In Vitro ve İn Vivo Modeli Gemi Duvar Altında Akış Koşulları Bakteriyel Yapışma Eğitim için

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

In Vitro Gelişimsel Mekanobiyolojiyi İncelemek için Çip Üzerinde Fetal İnsan Gemisi Modeli

Akış Altında Damar İlacı Hedeflemesi Üzerinde Çalışmak için In Vitro 3D Hücre Kültürlü Arteriyel Modeller

Endotel hücreleri kullanarak 3D hücre kültürü ve sigara anticoagulated tam kan antikoagülan ve anti-enflamatuar özellikleri değerlendirilmesi

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma