Name: visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy
Uploaded: 2014-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy at JoVE.com

Diese Forschung wurde zum Teil durch NIH Auszeichnungen 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 unterstützt.

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institut für Tierwissenschaften an der Albert-Einstein-College of Medicine durchgeführt. 1. Wachstumsbedingungen von C. neoformans H99 (Serotyp A) <ol><li> Wachsen einzelne C. neoformans (Cn) Kolonien auf Sabouraud-Agar-Platten. </li><li> Ein Tag vor dem Experiment, wählen Sie eine Kolonie und zu impfen 10 ml Sabouraud-Bouillon. </li><li> Ermöglichen Kultur über Nacht bei 37 ° C wachsen bei einer Geschwindigkeit von 250 UpM schüttelnd. </li></ol> 2. Isolierung und Herstellung von primären Knochen Makrophagen aus C57 / Bl6 Mäuse <ol><li> Euthanize Mäuse indem Tier in einer CO 2-Kammer bis sie nicht mehr atmen. Als zweite Maßnahme, zervikal den Hals verrenken vor Beginn der Dissektion. Sterilisieren ganzen Körper mit 70% igem Alkohol. </li><li> Entfernen Sie die beiden Oberschenkelknochen und Schienbein und Knochen statt in sterilen DMEM. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Gewebe und Muskulatur mit desilicat wischt, bis Knochen sind absolut sauber. </li><li> Legen Sie nur intakte Knochen in eine Petrischale mit 70% igem Alkohol und Inkubation für 3 min zu assoziierten Mikroorganismen abzutöten. Entfernen Sie Knochen und in Petrischale mit sterilem DMEM. </li><li> Schneiden Sie vorsichtig die Enden der Knochen. Halten Knochen über eine leere 50 ml konischen Röhrchen auf Eis gestellt und vorsichtig bündig 10 ml kaltem DMEM mit einer 25 G-Nadel durch die einzelnen Knochen. HINWEIS: Jede Maus wird 4 Knochen (2 Oberschenkelknochen, Schienbeinknochen 2) zu erhalten. Daher sollte man der Maus etwa 40 ml der Zellsuspension zu erhalten. </li><li> Zentrifuge Zellsuspension bei Raumtemperatur für 10 min bei 650 x g beträgt. </li><li> Während dieser Zentrifugation vorbereiten und Filter sterilisieren Knochenmark-Makrophagen Zuführen Medien DMEM mit 20% L929, 10% fötales Kälberserum, 10% NCTC-109, 1% Pen-Strep, 1% HEPES, 1% L-Glutamin besteht , 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1% 2-Mercaptoethanol. </li><li> Resuspendieren resultierende Pellet mit 10 ml Zuführen Medien. Geben Zelle suspensIonen durch eine 70 um Zell Sieb, um Zellklumpen zu stören und zu entfernen große Trümmer. </li><li> Platte 1 ml der Zellsuspension in 10 ml Medium Zuführen in Petrischalen, die für die Gewebekultur Verwendung (für insgesamt 10 Platten) angegeben sind. </li><li> Sodass die Zellen bei 37 ° C mit 10% CO 2 anhaften. 5 ml frisch Fütterung Medien am 3. Tag Am Tag 7, komplett ersetzen die Futter Medien und Makrophagen sind bereit, verwendet werden. </li><li> Der Tag vor dem Experiment, nehmen Makrophagen aus Platte, indem Sie beim Einzug von Medien und fügen 5ml eines sanften Zelle Stripping Reagenz bis zum Teller. </li><li> Inkubation für 5-10 min bei 37 ° C und Makrophagen entfernen mit sanften Pipettieren. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 650 × g für 10 min. </li><li> Pellet in 1 ml Zuführen Medien. Mit Hilfe eines 1:20 Verdünnung wird die Konzentration von Makrophagen durch Pipettieren von 10 ul Zellsuspension auf einer Hämocytometers. </li><li> Mit 14 mm Glasboden Petrischalen, Teller einKonzentration von 1 x 10 5 Makrophagen direkt auf das innere Wohl die ein Maximum von 200 ul hält, so ist Vorsicht geboten, dieses Volumen nicht überschreiten, wie in Abbildung 4 dargestellt. </li><li> Damit sich die Zellen an die Petrischale aus Glas, indem man das Geschirr in einem 37 ° C Inkubator für 1 Stunde zu halten. </li><li> 1-2 ml der Fütterung Medien mit LPS supplementiert mit 1 mg / ml IFNg und bei 500 U / ml und ermöglichen Zellen über Nacht inkubiert. </li></ol> 3. Co-Inkubation von primären murinen Makrophagen und C. neoformans <ol><li> Am Tag des Experiments zu entfernen 1 ml einer Übernachtkultur angeimpft und Pellet Hefezellen durch Zentrifugation für 5 min bei 420 x g beträgt. </li><li> Waschen Sie die Zellen 3 mal mit sterilem PBS auf Medien und extrazellulären Cryptococcus Produkte wie das Polysaccharid glucuronoxylomannan (GXM) an der oben genannten Geschwindigkeit und Zeit zu entfernen. </li><li> Resuspendieren Zellpellet in 1 ml sterilem PBS und eine 1: 100-Verdünnung. Je 10 ul ter Verdünnung auf einem Hämocytometers und zählen Zellen. Hinzufügen Hefezellen bei einer MOI von 1: 5. Zum Beispiel, wenn es 1 x 10 5 Makrophagen / gut, machen Sie eine Zellsuspension von 5 x 10 6 / ml Cn und 100 l dieser Lösung für einen Gesamtbetrag von 5 x 10 5 Cn. </li><li> Hinzufügen des berechneten Volumens Cryptococcus Zellsuspension zu 1 ml Medium mit der Zuführung mAb 18B7-Antikörper in einer Konzentration von 10 ug / ml. Inkubieren Zellsuspension bei Raumtemperatur für 5 min. </li><li> Fütterung entfernen Medien aus Glasboden Petrischale und waschen 1x mit sterilem PBS. 100 l opsonisiertes Cn direkt gut. </li><li> Sodass die Zellen für 2 h bei 37 ° C mit 10% CO 2 inkubiert. </li><li> Nach Co-Inkubation, überprüfen Sie mit dem Mikroskop, dass Makrophagen haben Cn verinnerlicht. Berücksichtigt internalisiert werden sollte Cryptococcus-Zellen deutlich innerhalb der Grenzen des Makrophagen ersichtlich. </li><li> Waschpetrischale 3x mit sterilem PBS auf jegliche extracellula entfernenR Cn. </li><li> 1-2 ml der Fütterung Medien ohne Zugabe von mAb 18B7 und Einrichten Mikroskop. </li></ol> 4. Visualisierung nichtlytischen Exocytosis in Echtzeit mittels digitaler Lichtmikroskopie HINWEIS: Um diese Experimente durchführen, ein Mikroskop, das mit einem angehängten Brutraum, die CO 2 Lieferung und ein Heizungseinheit erforderlich beinhaltet kommt. <ol><li> Vor dem Experiment, vorwärmen die Inkubationskammer für mindestens 30 min auf 37 ° C. Sicherzustellen, dass die CO 2-Einheit liest 5% zu Beginn des Experiments. </li><li> Ort Glasboden Petrischale auf Mikroskop-Plattform, Deckel mit CO 2 Deckel, und schließen Sie alle Türen, keine Wärme entweicht gewährleisten. </li><li> Verwendung der 10X-Objektiv mit dem Mikroskop im Phasenkontrast, sich auf eine klare Bereich der infizierten Makrophagen. Bezogen auf das Experiment, das Ziel zu bestimmen, wie viele Makrophagen untersucht werden müssen, verwendet. </li><li> Einrichten Mikroskop-Software zu take eine Bild alle 4 Minuten für eine 24-Stunden-Zeitraum. </li><li> Nach 24 Stunden wird das Experiment Abschluss erreicht haben und insgesamt 361 Bilder werden gesammelt worden sein. Exportieren Sie diese Bilder als .jpegs bei einer 5%-Kompression. Mit Image J Software, Bilder als visuelle Stapel bei 5 Bildern pro Sekunde. Wenn der Film braucht, um für die Veröffentlichung oder eine Präsentation zu sehen, speichern Sie sie entweder als AVI-oder MOV-Datei je nach dem Format am besten für den Betrachter. </li></ol>

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	<li>Voelz, K., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcal+Interactions+With+the+Host+Immune+System.">Cryptococcal Interactions With the Host Immune System.</a> Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptococcus+interactions+with+macrophages:+evasion+and+manipulation+of+the+phagosome+by+a+fungal+pathogen.">Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen.</a> Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).</li><li>Sabiiti, W., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+infection+by+the+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans.">Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans.</a> Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).</li><li>Bliska, J. B., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+pathogenic+bacteria+and+fungi+&#8212;+a+case+of+convergent+evolution.">Intracellular pathogenic bacteria and fungi &#8212; a case of convergent evolution.</a> Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+spread+and+massive+vacuole+formation+after+Cryptococcus+neoformans+infection+of+murine+macrophages.">Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages.</a> BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cell-to-cell+spread+of+a+pathogenic+yeast.">Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast.</a> BMC immunology. 8, 15 (2007).</li><li>Alvarez, M., Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagosome+extrusion+and+host-cell+survival+after+Cryptococcus+neoformans+phagocytosis+by+macrophages.">Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).</li><li>Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expulsion+of+live+pathogenic+yeast+by+macrophages.">Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages.</a> Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).</li><li>Johnston, S. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+fungal+pathogen+Cryptococcus+neoformans+escapes+macrophages+by+a+phagosome+emptying+mechanism+that+is+inhibited+by+Arp2/3+complex-mediated+actin+polymerisation.">The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation.</a> PLoS pathogens. 6 (8), (2010).</li><li>Carnell, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+polymerization+driven+by+WASH+causes+V-ATPase+retrieval+and+vesicle+neutralization+before+exocytosis.">Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis.</a> The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).</li><li>Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine+signaling+regulates+the+outcome+of+intracellular+macrophage+parasitism+by+Cryptococcus+neoformans.">Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans.</a> Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).</li><li>Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-lytic+expulsion/exocytosis+of+Candida+albicans+from+macrophages.">Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages.</a> Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass wir keine konkurrierenden finanziellen Interessen oder andere Interessenkonflikte.

Hier haben wir eine Methode, mit der Pilz-Makrophagen-Interaktionen können aufgezeichnet und in Echtzeit über einen 24-Stunden-Zeitraum analysiert werden beschrieben. Unser Labor hat dieses Protokoll verwendet, um viele der zeitlichen Aspekte des nicht-lytischen Exozytose zu studieren und wird auch weiterhin in Echtzeit-Mikroskopie zu verwenden, um die morphologischen Komponenten, die diesen Prozess umgeben ermitteln. Für diese Technik, um optimale Ergebnisse zu erhalten, sollte besonderes Augenmerk auf bestimmte Schritte im Protokoll gegeben werden. Die Zelldichte, die in der Nacht zuvor plattiert ist, ist wichtig, weil zu viele Zellen einen Film, der nicht nutzbar ist, wie die Betrachtung der Bewegung und Wechselwirkungen von einzelnen Zellen behindert zu schaffen, während zu wenig Zellen können Daten, die nicht signifikant nachgeben. Das Ziel ist es, ein gleichmäßig beabstandeten Bereich der Makrophagen, so daß einzelne Makrophagen kann für die Dauer der Infektion Periode folgen erzielen. Im gleichen Vene, Waschen entfernt die extrazelluläre Cn ist ein entscheidender Schritt für die Ex-zellulären Cn wird mit der Zeit, die das Feld zu verdunkeln und zu einem Verlust der Sichtbarkeit der Makrophagen konnte teilen. Abhängig von der Länge des Films kann der Rahmen außerhalb des Fokus die Bilder unbrauchbar zu studieren und daher zu verschiedenen Zeitpunkten während der Infektion überprüft werden muss, die Aufzeichnung verschieben. Wie beschrieben, gibt es verschiedene Möglichkeiten, diese Technik kann modifiziert werden, um innerhalb der Parameter der anderen Experimente zu passen. Viele verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe und Marker können verwendet werden, um Membran und phagosomalen Dynamik hervorheben, aber man sollte vorsichtig sein und Foto Bleich die Auswirkungen dieser auf die Fitness der Zellen haben können. Eine Reihe von Zelltypen kann als J774.1 Makrophagen-ähnlichen Zellen, Monozyten oder Amöben in Zusammenhang mit anderen Pilzstämme verwendet, so werden die Differenzen, die auftreten, zu untersuchen. Wir empfehlen die Verwendung eines Ziels von 10X, weil unsere Experimente erfordern die Datenerfassung von einer großen Menge von Zellen, jedoch eine höhere verwendenZiel um nur ein paar Zellen zu studieren. Das Timing, das jedes Bild aufgenommen wird ebenfalls eingestellt werden. Aufnehmen eines Bildes alle 4 min für 24 Stunden ergibt einen Film, der in etwa 1 Minute läuft in der Länge, wenn alle Frames komprimiert wurden. Erhöhen der Aspekte (die Dauer der Infektion oder die Zeit zwischen Frames) erhöht sich die Menge von Dateien, die gespeichert werden müssen, die ein Problem für einige Laboratorien sein können. Nichtlytischen Exocytose ist ein unglaublich dynamischer Prozess, der während der Infektion rasch und in verschiedenen Zeitintervallen erfolgt. Daher versucht Makrophagen unterziehen diese Interaktion mit anderen Methoden, wie Übertragung und Rasterelektronenmikroskopie erfassen kann extrem selten sein. Aufgrund der Art, wie Proben werden fixiert und verarbeitet, kann man nicht sicher, daß das, was gesehen wird definitiv nicht-lytischen Exozytose gegenüber anderen zellulären Prozessen wie Lyse oder Apoptose. Auch ein Markenzeichen der nichtlytischen Exozytose ist, dass Wirt und Pathogen über bleiben<html> BLE danach die etwas, das nicht von festen Bildern abgeleitet werden, da diese Verfahren nur Momentaufnahmen eines Prozesses erzeugen zu einem bestimmten Zeitpunkt ist. Während dieses Protokoll kann unzählige Bilder von zellulären Prozessen zu schaffen, gibt es einige Einschränkungen bei der Verwendung dieser Technik, um Host-Pathogen-Interaktionen zu studieren. Die niedrige Ziel wir verwenden, um eine große Menge an Makrophagen zu einer Zeit Studie nicht für eine hohe Bildauflösung erlaubt genug, um die Wechselwirkung zwischen der Phagosomen und der Zellmembran, die nicht sehr gut verstanden ist Aspekt nichtlytischen Exozytose zu visualisieren. Sobald alle Bilder aufgezeichnet wurden, kann die post-Analyse der nach vielen Makrophagen sehr mühsam und zeitaufwendig sein. Makrophagen, auch diejenigen, verklebt auf Glas, sehr beweglich sein und wird in und aus dem Rahmen sehr schnell zu bewegen. Dies kann es schwierig einzelnen Makrophagen von Anfang bis Ende, insbesondere diejenigen, die nahe der Peripherie des Rahmens zu folgen. jove_content &quot;&gt; Trotz dieser Einschränkungen ist das Protokoll kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, die viele verschiedene Aspekte der Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen verwendet werden.

Die Phasen der Pilzinfektion zwischen Cryptococcus-Zellen und Makrophagen sind gut dokumentiert 1-3. Nach Hefezellen werden durch Makrophagen aufgenommen werden, kann eine Vielzahl von Wechselwirkungen auftreten: der Makrophagen kann lysieren Freigabe seiner Pilzbelastung in den extrazellulären Raum, oder es könnte die Infektion, indem die Hefe-Zellen innerhalb der Grenzen seiner zellulären Membran 4 zu steuern. Nichtlytischen Exozytose, ein Verfahren, bei dem ein Makrophage getilgt einige oder alle der Cryptococcus-Zellen in die Umgebung oder eine benachbarte Zelle, und beide Wirt und Pathogen lebensfähig bleiben 5: jedoch seit einigen Jahren ein neues Ergebnis wurde unabhängig durch zwei Gruppen beschrieben -8. Mehrere Studien haben versucht, die molekularen Mechanismen hinter dieser Interaktion zu verstehen, aber wir haben noch nicht über einen vollen Griff auf, was treibt dieses Phänomen. Die Fähigkeit, Bilder in Echtzeit zu erfassen und anschließend analysieren mehrere infizierened Makrophagen ermöglicht es, viele Fragen zu den physikalischen Eigenschaften umliegenden nicht-lytischen Exozytose in Bezug auf Timing, Raumkapazität, Veränderung der Morphologie und auch Stress von Makrophagen während einer Pilzinfektion zu beantworten. Indem die Zellen in einer Umgebung, die vergleichbar mit der von einem Inkubator untergebracht ist, so können wir die dynamische Natur der Makrophagen-Pilzzelle Wechselwirkungen erblicken. Forscher haben diese Technik verwendet, um verschiedene Komponenten dieses Prozesses zu studieren. Die Rolle der Phagosom in diesem Prozess wurde deutlich gemacht mit Fluoreszenzfärbung und Aktin Blockern 9, während eine andere Gruppe verwendet diese Methode, um zu zeigen, dass nicht-lytischen Exozytose wurde in Zellen, die hatten die Waschkeimbildungsproteindomänen gelöscht 10 blockiert. Die Wirkung der Cytokine Signaling hat auch festgestellt worden mit Echtzeit-Mikroskopie 11. Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf C. neoformans, wie es auch mit Candida albicans beobachtet, another Pilzkrankheitserreger, der die Fähigkeit, Makrophagen 12 infizieren. Diese Ergebnisse sind Beispiele dafür, wie dieses Verfahren eine Fülle von Informationen zu einem Bereich, den wir wissen so wenig über ist.

<table><tbody><tr><td>Sabouraud Dextrose Agar</td><td>BD</td><td>DF0109-17-1</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose Broth</td><td>BD</td><td>DF0382-17-9</td><td></td></tr><tr><td>Dubelcco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Calf Serum (FCS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450</td><td></td></tr><tr><td>NCTC 109</td><td>Invitrogen</td><td>21340-039</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-025-Cl</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>21985-023</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>3003 Tissue Culture Petri Dishes&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper</td><td>Corning Cellgro</td><td>25-056-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes</td><td>MatTek</td><td>P35GC-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>Sigma</td><td>L3137</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IFN-g</td><td>Roche</td><td>NC 9222016</td><td></td></tr><tr><td>mAb 18B7</td><td>Non-commerical antibody produced in our lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing non-lytic exocytosis of cryptococcus neoformans from macrophages using digital light microscopy

Viele Aspekte der Infektion von Makrophagen durch Cryptococcus neoformans wurden ausgiebig untersucht und gut definiert. Jedoch eine bestimmte Interaktion, die nicht klar verstanden wird, ist nicht-lytischen Exozytose. In diesem Verfahren werden Hefezellen in den extrazellulären Raum durch eine schlecht verstandenen Mechanismus, der sowohl die Makrophagen und Cn lebensfähigen Blätter freigegeben. Hier beschreiben wir, wie man eine große Anzahl von infizierten Makrophagen individuell für eine 24-Stunden-Infektionsperiode von Zeitraffer-Mikroskopie zu folgen. Infizierten Makrophagen werden in einer Wärmekammer mit einem CO 2 Atmosphäre in einem Mikroskop, die die gleichen Bedingungen wie einem Zellkulturbrutschrank bietet angebracht gebracht. Live digitalen Mikroskopie kann Informationen über die dynamischen Wechselwirkungen zwischen einem Wirt und Pathogen, die nicht von statischen Bildern ist. In der Lage, jede infizierte Zelle visualisieren können Hinweise darauf, wie Makrophagen behandeln Pilzinfektionen stellen, und umgekehrt. Diese Technik isa leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der Dynamik, die hinter einem komplexen Phänomen sind.

Die Bilder, die diese Technik kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, Informationen rund um das, was passiert, nachdem Zellen phagozytiert C. sammeln analysierende neoformans. Wie in Figur 1 zu sehen ist, gibt es etwa 100 Makrophagen, die entweder infiziert oder nicht infiziert sind. Jede dieser Makrophagen gibt dem Zuschauer die Möglichkeit, Wirt-Pathogen-Interaktionen auf einer mikroskopischen Ebene sehr zu studieren. Wie die Figuren 2 und 3 zeigen, gibt es unterschiedliche Ergebnisse, die zwischen einem Makrophagen und Hefezelle auftreten können, und sogar zwischen Makrophagen Makrophagen. Makrophagen können als zogen nichtlytischen Exozytose, Zell-Zell-Übertragung oder andere zelluläre Prozess die auftreten können, erzielt werden. Der Zeitpunkt dieser Ereignisse während der Infektion kann auch basierend auf den Parametern, die eingestellt werden, wenn der Film aufgenommen wird festgestellt werden. <img alt="Figur 1" fo:content-width= &quot;5in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52084 / 52084fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Abbildung 1:. Feld Infizierte Makrophagen Diese Abbildung zeigt einen ganzen Bereich der individuell infizierten Makrophagen zu Beginn einer 24-Stunden-Infektionsperiode. Es ist zu beachten, dass das Feld ist frei von extrazellulären Cn werden und noch wichtiger, wie klar es ist, die Makrophagen infiziert sind (wie von einer großen Pfeilspitze angedeutet) und welche enthalten keine Pilzzellen (wie durch einen kleinen Pfeil gekennzeichnet). Maßstab entspricht 50 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Updated_Field_of_Macrophages.mov" target="_blank">Film 1</a> : Visualisierung der Makrophagen-C neoformans 24 h Infektionsdauer. Die anfängliche Bild des Films zeigt viele Makrophagen im gesamten Feld mit einige, die nicht infizierten sind und einige, die unterschiedliche Mengen von Cryptococcus-Zellen phagozytiert haben. Als der Film fortschreitet, werden die Zellen are alle beweglichen und gesehen werden kann über das Feld bewegen. Wir sind in der Lage, jede dieser Makrophagen folgen, um zu sehen, welche Art von zellulären Prozess, den sie durchlaufen. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2:. Primären murinen Makrophagen durchmacht nichtlytischen Exocytosis Eine infizierte Makrophagen (Panel A, von einem weißen Pfeilspitze angedeutet) ist zu sehen, unterziehen die Anfangsphase der nicht-lytischen Exozytose. Das Phagosom beginnt zu vergrößern (Panel BC) und die Pilzbelastung beginnt sich zu verschieben. Mehrere Cn Zellen werden dann in den extrazellulären Raum freigesetzt, wie sie in der DE-Panels gesehen werden. Eine zweite infizierten Makrophagen Panel F, von einem weißen Pfeilspitze angegeben ist, erfährt auch eine nicht-lytische Exozytose-Ereignis (Steuerung GH). Am Ende des Prozesses werden die beiden Makrophagen leer gelassen (Panel I) wie durch die weißen Pfeilspitzen gezeigt. Maßstab repräsentiert 25 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Non-Lytic_Exocytosis.avi" target="_blank">Movie 2</a> :. Visualisierung primären murinen Makrophagen durchmacht nichtlytischen Exocytosis In diesem Film ist es klar, dass die Cryptococcus-Zellen sind innerhalb der Grenzen einer infizierten Makrophagen. Der Makrophage wird aufgeregt und eine Hefezelle ist zu sehen, in der angehende Phagosom. Cryptococcus-Zellen werden dann schnell in die Umgebung ausgelöscht. Eine zweite infizierte Makrophagen erfährt nichtlytischen Exozytose und mehr Hefezellen werden in den extrazellulären Raum freigesetzt. Die Wirtszellen lebensfähig nach Cryptococcus Exozytose bleiben, wie durch ihre Fähigkeit, sich weiter zu bewegen angegeben. <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3:. Primären murinen Makrophagen durchmacht Zell-Zell-Überweisung weiterer process, die mit diesem Protokoll erfasst werden kann, ist Zell-Zell-Transfer, die bei Cryptococcus-Zellen werden von einem Makrophagen zu einer benachbarten Makrophagen übertragen auftritt. Zwei infizierte Makrophagen sind in unmittelbarer Nähe zu einander durch weißen Pfeilspitzen (Teil A) angegeben und bewegen sich noch näher an Zell-Zell-Transfer (Feld B) zu initiieren. Ein durch die roten Pfeile angegebenen Zell-Zell-Brücke zwischen den beiden, so daß die Makrophagen Cryptococcus Zellen nicht an die Umgebung während der Übertragung (Tafel C, E) freiliegen. Nachdem die Übertragung abgeschlossen ist, werden die Zellen brechen (Teil D, F). Maßstab repräsentiert 25 um. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52084/Cell-Cell_Transfer.mov" target="_blank">Film 3</a> :. Visualisierung Zell-Zell-Übertragung zwischen infizierten Makrophagen Gelegentlich wird Makrophagen in einer Weise, die Übertragung von Cryptococcus-Zellen zwischen Wirtszellen erleichtert interagieren. Die Hefezellen werden nicht exponiertan die extrazelluläre Umgebung und den Wirtszellen lebensfähig bleiben. In diesem Film zwei infizierten Makrophagen zu erstellen Zell-Zell-Brücken bei zwei verschiedenen Gelegenheiten Shuttle Cryptococcus Zellen von einem Makrophagen zu einem anderen. <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52084/52084fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4: schematische Darstellung, Vorbereitung von Zellen.

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Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

11.7K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine.  Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist. 

Serie: Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of phagocytes to the site where pathogens are located; (ii) recognition of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) through pattern recognition receptors (PRRs); (iii) engulfment of microorganisms bound to the phagocyte cell membrane, and (iv) processing of engulfed cells within maturing phagosomes and digestion of the ingested particle. Studies that assess phagocytosis in its entirety are informative1, 2, 3, 4, 5 but are limited in that they do not normally break the process down into migration, engulfment and phagosome maturation, which may be affected differentially. Furthermore, such studies assess uptake as a single event, rather than as a continuous dynamic process. We have recently developed advanced live-cell imaging technologies, and have combined these with genetic functional analysis of both pathogen and host cells to create a cross-disciplinary platform for the analysis of innate immune cell function and fungal pathogenesis. These studies have revealed novel aspects of phagocytosis that could only be observed using systematic temporal analysis of the molecular and cellular interactions between human phagocytes and fungal pathogens and infectious microorganisms more generally. For example, we have begun to define the following: (a) the components of the cell surface required for each stage of the process of recognition, engulfment and killing of fungal cells1, 6, 7, 8; (b) how surface geometry influences the efficiency of macrophage uptake and killing of yeast and hyphal cells7; and (c) how engulfment leads to alteration of the cell cycle and behavior of macrophages 9, 10.
In contrast to single time point snapshots, live-cell video microscopy enables a wide variety of host cells and pathogens to be studied as continuous sequences over lengthy time periods, providing spatial and temporal information on a broad range of dynamic processes, including cell migration, replication and vesicular trafficking. Here we describe in detail how to prepare host and fungal cells, and to conduct the video microscopy experiments. These methods can provide a user-guide for future studies with other phagocytes and microorganisms.

We describe methods for live-cell video microscopy of Candida albicans phagocytosis by macrophages. These methods enable stage-specific analysis of macrophage migration, recognition, engulfment and phagosome maturation and reveal novel aspects of phagocytosis.

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Komplementärer Einsatz von mikroskopischen Techniken und Fluoreszenzlesen beim Studium von Cryptococcus-Amoeba-Interaktionen

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune system during early development. The Zebrafish Mycobacterium marinum (M. marinum) infection model has been well-established in studying host immune response against mycobacterial infection. It has been suggested that different macrophage cell death types will lead to the diverse outcomes of mycobacterial infection. Here we describe a protocol using intravital microscopy to observe macrophage cell death in zebrafish embryos following M. marinum infection. Zebrafish transgenic lines that specifically label macrophages and neutrophils are infected via intramuscular microinjection of fluorescently labeled M. marinum in either the midbrain or the trunk. Infected zebrafish embryos are subsequently mounted on low melting agarose and observed by confocal microscopy in X-Y-Z-T dimensions. Because long-term live imaging requires using low laser power to avoid photobleaching and phototoxicity, a strongly expressing transgenic is highly recommended. This protocol facilitates the visualization of the dynamic processes in vivo, including immune cell migration, host pathogen interaction, and cell death.

This protocol describes a technique for visualizing macrophage behavior and death in embryonic zebrafish during Mycobacterium marinum infection. Steps for the preparation of bacteria, infection of the embryos, and intravital microscopy are included. This technique may be applied to the observation of cellular behavior and death in similar scenarios involving infection or sterile inflammation.

Visualisierung des Makrophagen-Lytic Zelltodes während der mykobakteriellen Infektion bei Zebrafischembryonen mittels Intravital-Mikroskopie

Zebrafish is an excellent model organism for studying innate immune cell behavior due to its transparent nature and reliance solely on its innate immune ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

Visualisierung von entzündlichen Kaspasen induzierter Nähe in humanen Monozyten-abgeleiteten Makrophagen

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

Visualizing the Early Stages of Phagocytosis

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune system &#8212; such as neutrophils, dendritic cells, and macrophages &#8212; retain the innate ability to detect and clear such invading pathogens through phagocytosis1. Phagocytosis involves choreographed events of membrane reorganization and actin remodeling at the cell surface2,3. Phagocytes successfully internalize and eradicate foreign molecules only when all stages of phagocytosis are fulfilled. These steps include recognition and binding of the pathogen by pattern recognition receptors (PRRs) residing at the cell surface, formation of phagocytic cup through actin-enriched membranous protrusions (pseudopods) to surround the particulate, and scission of the phagosome followed by phagolysosome maturation that results in the killing of the pathogen3,4.
Imaging and quantification of various stages of phagocytosis is instrumental for elucidating the molecular mechanisms of this cellular process. The present manuscript reports methods to study the different phases of phagocytosis. We describe a microscope-based approach to visualize and quantify the binding, phagocytic cup formation, and the internalization of particulate by phagocytes. As phagocytosis occurs when innate receptors on phagocytic cells encounter ligands on a target particle bigger than 0.5 &#181;m, the assays we present here comprise the use of pathogenic fungi Candida albicans and other particulates such as zymosan and IgG-coated beads.

Here we describe a microscope-based technique to visualize and quantify the early cascades of events during phagocytosis of pathogens such as the fungi Candida albicans and particulates that are larger than 0.5 &#181;m including zymosan and IgG-coated beads.

Visualisierung der frühen Phasen der Phagozytose

The mammalian body is equipped with various layers of mechanisms that help to defend itself from pathogen invasions. Professional phagocytes of the immune ...

Biologie

Live Fluorescence, Inverse Imaging of Cell Ruffling, and Macropinocytosis

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase nutrients and other material in cells. The dramatic extension of cell surface ruffles, their closure to form macropinosomes, and the maturation of internalized macropinosomes are key events in this pathway that can be difficult to capture using conventional confocal imaging based on tracking a bolus of fluorescent cargo. Fluorescent dextrans are commonly used experimentally as fluid phase markers for macropinosomes and for other endocytic pathways. A method the lab has adopted to optimize the imaging of dextran uptake involves using live imaging of cells bathed in high concentrations of fluorescent dextran in the medium, with the unlabeled cells appearing in relief (as black). The cell ruffles are highlighted to visualize ruffle closure, and internalized macropinosomes appear as fluorescent vacuoles in the cell interior. This method is optimal for visualizing macropinosome features and allows for easy segmentation and quantification. This paper describes dual-labeling of pathways with different sized dextrans and the co-expression of lipid probes and fluorescent membrane proteins to demark macropinosomes and other endosomes. The detection of internalized dextran at an ultrastructural level using correlative light and electron microscopy (CLEM) is also demonstrated. These cell processes can be imaged using multiple live imaging modalities, including in 3D. Taken together, these approaches optimize macropinosome imaging for many different settings and experimental systems.

This protocol demonstrates dextran imaging in live cells using continuous uptake and inverse images to optimize visualization of ruffling, macropinosome maturation, and analysis of dextran and other cell labelings.

Macropinocytosis is a highly conserved but still incompletely understood process that is essential for the uptake and ingestion of fluid, fluid-phase ...

Visualisierung nichtlytischen Exozytose

Zusammenfassung

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