Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AM), ABD Savunma Bakanlığı (BC074986), Boston Çocuk Hastanesi Fakültesi Kariyer Geliştirme Bursu (TM, AM) fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, teknik yardım için Amanda Jiang ve Elisabeth Jiang teşekkür ederiz.

NOT: in vivo hayvan çalışması Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol gözden ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol Numaraları: 13-10-2526R, 14-02-2568R) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm ilaçlar, farmasötik dereceli olan ve bu ilaçlar, steril koşullar altında hazırlanır. 1. fibrin jel çözeltisi, <ol><li> VEGF ve bFGF içeren fibrin jel hazırlayın. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar -80 ° C (25 ° C) saklanır fibrinojen ve trombin çözülme stok çözeltileri. </li><li> Fıbrinojene: (0-100 ng / ml nihai konsantrasyon), CaCl2 (nihai konsantrasyon: 45 mM), VEGF (nihai konsantrasyon 0-100 ng / ml) ve bFGF: trombin (2.5 U / ml nihai konsantrasyon) ilave çözeltisi (nihai konsantrasyon:% 0.9 sodiu içinde 12.5 mg / mlm 1,5 ml tüp klorür solüsyonu 43-45). </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın. </li><li> Yavaşça P200 pipet kullanarak damla damla steril bir plastik tabak üzerine karışımın 200 ul pipetle. </li><li> Katılaşma kadar, 30-60 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de damla inkübe edin. Not: katılaşmış jel implantasyon (Şekil 1a) önce bir kaç saat için oda sıcaklığında (25 ° C) &#39;de kapalı bir plastik tabak içinde tutulabilir. </li></ol></li><li> Implantasyon öncesi küçük cerrahi makas kullanarak yaklaşık 3 x 3 x 3 mm küpler halinde fibrin jel Trim. </li></ol> 2. Fare Hazırlama <ol><li> Intraperitoneal ketamin ile (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) (IP) enjeksiyon yetişkin fare (8-12 hafta) uyutmak ve fare yeterince fare burnunu sıkıştırarak anestezi onaylayın. <ol><li> Deney sırasında kuruluğunu önlemek için fare gözleri veteriner merhem kullanın. </li></ol></li><li> Tıraş fufare göğüs kafesinin sol tarafında üzerinde r. </li><li> Fare endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. </li><li> Entübasyon fare 70 ° açılı standı ve standın üst kısmında bulunan küçük bir lastik bant üzerinde üst kesicilerin çengel yerinde fareyi tutun yerleştirin. </li><li> Yavaşça künt forseps kullanarak bir tarafa dilini geri çekin. </li><li> Bir fiber-optik mikroskop boynu ışığı yardımı ile gırtlak gözünüzde canlandırın. </li><li> Trakea içine endotrakeal elastik kateter (21 G) yerleştirin. </li><li> Fare kendiliğinden (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) sorunsuz bir biçimde nefes olduğunu doğrulayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> Mekanik bir kemirgen vantilatör kullanarak fare havalandırın (150 solunum / dk ve 7 ml / kg tidal hacmi). </li><li> 4. ve 5. kaburga arasındaki interkostal boşluk bulmak için kaburga sayın. </li><li> Alan b üzerinde steril bir alan oluşturuny iyice alkol ve Povidon-İyot ile silerek. Steril cerrahi örtü ile yeterince cerrahi alan örtün. </li></ol> 3. Fare Cerrahisi <ol><li> Deri içinde% 0.25 bupivakain (200 ul), lokal enjeksiyonundan sonra, kesme makasları kullanılarak interkostal aralığa boyunca enine cilt insizyonu (yaklaşık 1 cm uzunluğu) sunuyor. </li><li> Interkostal kas içine% 0.25 bupivakain (200 ul) enjeksiyonundan sonra, ince, küçük makas kullanarak 4. ve 5. kaburga arasında bir kas kesi yapmak. </li><li> Tam sol akciğer görselleştirmek için kaburga arasında bir diseksiyon retraktör yerleştirin. <ol><li> Ince forseps kullanılarak sol akciğer merkezinin viseral plevra küçük bir alanda (1 x 1 mm kare) Pençe. </li><li> Kanama ve hava kaçakları tamamen kontrol kadar steril bir pamuklu çubukla kullanarak alanda hafif basınç uygulayın. </li><li> Fibrinojen / trombin (fibrin yapıştırıcı) taze karışımı (adım 1.1.2. 20 &amp; # az miktarda koyun181; P200 pipet kullanarak alana l). </li></ol></li><li> Yavaşça alanı (Şekil 1b) üzerinde küçük forseps kullanarak bir fibrin jel (adım 1.2) yerleştirin. <ol><li> Jel de akciğer solunum hareketleri sırasında bölgede sabit olduğunu doğrulayın. </li></ol></li><li> Ne masif hava sızıntı veya akciğer kanaması olduğundan emin olun. </li><li> Bulunmamaktadır absorbe edilebilir sütür ile yakın insizyon (kas ve deri tabakaları) bertaraf edilmesi. </li><li> Pnömotoraks önlemek için 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak göğüs boşluğu aspire. </li><li> Mekanik ventilasyon sonlandırın. </li></ol> 4. Fare Kurtarma <ol><li> Fare kendiliğinden düzgün bir şekilde (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) nefes emin olun. </li><li> IP 1 ml enjekte dehidratasyonu önlemek için NaCl% 0.9 önceden ısıtılmış. </li><li> Fare dolaşan sıcak su yastığı üzerinde kurtarmak için izin verin. </li><li> Endotrache kaldırFare istikrarlı nefes olduğunu onayladıktan sonra al tüpü. </li><li> Ameliyat sonrası ağrı kesici olarak 3 gün boyunca, meloksikam (5 mg / kg, deri altına enjeksiyon (SC) enjekte edilir. </li><li> O (kendi mide üzerine rulo mümkün ve dik kalması) sternum ve bilinçli kadar dikkatlice 15 dakika aralıklarla en az fare hareketlerini izlemek. </li><li> İyileştikten sonra, ameliyat olmadan farelerden izole bir yeni kafes fare dönün. </li><li> Günlük aşağıdaki enfeksiyon belirtileri (kızarıklık, şişme, akıntı), hayvanın temel biyolojik fonksiyonları (gıda ve su alımı, idrar, dışkılama, vücut ağırlığı artışı) yanı sıra klinik belirtileri sıkıntı cerrahi sitesini (piloerection, azaltılmış hareket) Monitör cerrahi prosedür. </li></ol> 5. Hasat Akciğer <ol><li> 7-30 gün implantasyondan sonra, sıkıştırılmış gazın kaynağı ile CO2 kullanılarak fare euthanize. </li><li> Xiphoid sürecin ucu ve Sternum arasında bir kesi yapmakçentik (medyan sternotomi) ve trakea kesme ve kalp, akciğerler, trakea tüm bağlantıları keserek histolojik ve biyokimyasal analiz için implante jel ile hasat tüm akciğer. </li><li> Gecede Ekim bileşik embed 4 ºC,% 4 paraformaldehit çözeltisi ile akciğer ile implante jel Fix ve 30 mikron kalınlığında seri adımı bölümlerini almak. </li><li> Histolojik (hematoksilen ve eozin boyama) ve immünohistokimyasal analizler gerçekleştirin (endotel işaretleyici: CD31, epitel işaretleyici: aquaporin (AQP) 5 ve surfaktan protein (SP) -B) konfokal mikroskop 22,37,40 kullanarak. </li><li> 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak 37 akciğer endotel üç boyutlu görüntüler ve epitel hücreleri oluşturmak için optik bölümler (kalın 30 mikron) yığınlarını derleyin. </li><li> Görüntü analiz yazılımı 46 kullanılarak yeni oluşan kan damarlarının öngörülen alanları gösteren alanlardır. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu makalede, erişkin fare yaşayan akciğer yüzeyinde biyomalzemeleri implant için yeni bir yöntem tanıttı. Bu sistem ile, ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men başarılı bir malzeme içinde değinmeyecek. Bu sistem, araştırmacılar, endotel hücreleri arasındaki karışma keşfetmek sağlar, diğer hücrelerin (örneğin, epitelyal hücreler, mezenkimal hücreler, bağışıklık hücreleri) yerel anjiyojenez 50-53 ve alveolar rejenerasyon 24,54 için gerekli olan ve ECM bileşenleri. Geleneksel in vivo olarak deri altından hidrojel implantasyon anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Hidrojel akciğer yüzeyinde doğrudan implante olduğu bu sistem, erişkin fare akciğer anjiyogenez ve alveol rejenerasyon akciğer özel mikroçevresinin rollerini araştırmak için araştırmacılar sağlayacaktır. Bu jeller, çeşitli ECM zengin biomate imal edilebilirÇeşitli kimyasal faktörler (örneğin, anjiyojenik faktörler, büyüme faktörleri), 55,56, progenitör hücrelerin ve / veya iPS hücreleri ile desteklenebilir cisimler (örneğin kollajen, fibrins). Kimyasal faktörlerin yanı sıra, mekanik kuvvetlerin anjiyogenezi 23,37 kontrol eder. bir fibrinojen konsantrasyona bağımlı bir şekilde 57 ve kimyasal sinyallere ile değil aynı zamanda fiziksel ipuçları 58,59 üzerinden sadece anjiyojenezi etkileyebilir fibrinojen manipüle fibrin jel değişikliklerin sertliği. Bu nedenle, fibrin jel fiziko-kimyasal özellikleri ileride fizyolojik organa özgü angiogenesisi özetlemek için dikkatli bir şekilde optimize edilmesi gerekebilir. Viseral plevra kazıma sonrası yara iyileşmesi, aynı zamanda, konakçı hücrelerin farklı türlerini kapsar ve iyileşme sürecini ve doku rejenerasyonunu teşvik ettiğini endojen bir fibrin pıhtısı üretir. Bu doğal pıhtı anjiyo kontrol dolayısıyla Eksojen implante fibrin jel ile etkileşim ve olabilirimplante jel oluşumu. Floresan etiketli fibrinojen doğal fibrin pıhtı ve implante fibrin jel ayırt ve bu mekanizmaları keşfetmek için araştırmacıların sağlayabilir. Bu yenidoğan farelerde büyük ihtimalle mevcut teknik zorluklar akciğer gelişimi ve hastalıkların çalışmaya erişkin fare akciğerlerinde anjiogenezisi, uygulamayı karakterize için güçlü bir yöntem olmakla birlikte. Bu çalışmanın nihai amacı hastalıklı akciğerler üzerinde implante fibrin jel içine fonksiyonel kan damarları işe ve fonksiyonel akciğer yapıları restore etmek bir tıbbi cihaz olarak matris kullanmaktır. Olası jeller içindeki konak hücreleri ve vasküler ve alveol yapılar arasındaki iletişimin yanı sıra bu yapıların işlevsellik gelecek deneylerde araştırılmalıdır. Akciğerlerde VEGF düzeyleri BPD 60 ve amfizem 61 olan hastalarda azalmış olduğundan, matris VEGF ekleyerek matris Impl içine kan damarlarının işe artırabilirBu hastalıklı akciğerler üzerinde anted. Mekanik özellikleri de sağlıklı ve hastalıklı akciğerler 23,62 arasında farklılık gösterir. Örneğin, bozulma ve kolajenlerin çapraz bağlanmasını kontrol matris metalloproteinaz ve lisil oksidaz, ekspresyonu sırasıyla, KOAH, pulmoner fibroz 63-67 dahil çeşitli akciğer hastalıklarının değiştiği saptanmıştır. Hastalıklı akciğerler akciğer endotel ve epitel hücreleri için atalarıdır belirli soylar 68 tükenmiş. Bu nedenle, progenitör hücreleri ile desteklenmiş fibrin jeller, bu faktörler (anjiyojenik faktörler, ECM ECM sertliği) işleme ya da implante 69 olasılıkla matris ve çeşitli patolojik durumların akciğer fonksiyonun geri içinde fonksiyonel damarların oluşumuna yol açar. Kimyasal faktörler yerel angiogenesisi modüle etmek için fibrin jel içinde ilave edilebilir, bu sistem, aynı zamanda, kronik akciğer hastalıkları hastalıklı akciğerleri etkilemektedir belirli çevresel işaretler keşfetmek kullanılabilir. </p&gt; Özetle, bu makale in vivo akciğer özel anjiyogenez karakterize etmek için araştırmacılar sağlayan yaşayan fare, akciğer yüzeyinde fibrin hidrojel implant için bir yöntem sunar. Çeşitli faktörlerin modifikasyonu (örneğin, zaman süreci, konsantrasyonlar ve anjiyojenik faktörlerin kombinasyonları, hidrojeller çeşitli hidrojeller fiziko-kimyasal özellikleri), bu sistemde, akciğerde damar ve yenilenme mekanizmaları açıklayacak. Böylece, bu sistem önemli ölçüde temel vasküler biyoloji, doku mühendisliği bilimsel bilgi, yanı sıra akciğer tıp ilerler.

Bu protokolün genel amacı araştırmacılar, akciğer vasküler ve alveol gelişme moleküler mekanizmaları karakterize sağlar erişkin fare, akciğer yüzeyinde fibrin jel implant için bir yöntem tanıtmak ve yetenekli biyomimetik malzemelerin geliştirilmesi için bu bilgiyi kaldıraç için çeşitli akciğer hastalıkları tedavi etmek için fizyolojik akciğer vasküler ve alveol oluşumunu yansıtan bir. 35 milyondan fazla Amerikalı kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve pulmoner fibrozis gibi kronik akciğer hastalıkları muzdarip. Bu hastalar önemli ölçüde günlük yaşam 1-3 bozan tür nefes darlığı, göğüste sıkışma hissi, öksürük nagging ve yorgunluk gibi uzun ömürlü kronik solunum semptomları var. Bu akciğer hastalıkları için etkili tedaviler geliştirmek için çaba büyük bir miktarda rağmen, şu anda tedavisi yoktur; Bu nedenle, bu hastalarda yaşam kalitesi zayıf ve ekonomik ve insani maliyeti merhaba vardırgh 4-7. Şu anda, akciğer transplantasyonu son dönem kronik akciğer hastalığı olan hastaları kurtarmak için tek yoldur. Ancak, nakli donör, yüksek maliyet, ciddi komplikasyonlar ve düşük sağkalım oranı 8-11 sıkıntısı, transplantasyon optimal yaklaşım değildir. Doku mühendisliği teknikleri son hızla ilerleme progenitör hücreleri veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden 12,13 çeşitli tipleri ile decellularized bütün akciğeri repopulating tarafından implante akciğer biyomühendis araştırmacıların sağladı. Bununla birlikte, bu bulasıcı akciğerler sadece implantasyon 12,14,15 sonra birkaç saat süre ile bir ev sahibi, hayvanlarda işlevsel. Akciğerlerin karmaşık yapıları ve işlevleri yenilenmesine biomateryaller kullanmak da oldukça başarısız olmuştur. Erişkin akciğer rejenerasyon yöneten kilit biyolojik süreçler iyi araştırılmış değil çünkü bu olabilir. Akciğerde vasküler sistemin oluşumu erken ve en önemli olaylarından biri olan During geliştirme ve yenilenme 16-21. Yeni, sadece oksijen, besin ve organ oluşumu için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri teslim değil, aynı zamanda çevredeki hücrelere 22-25 öğretici düzenleyici sinyallerini sağlamaz akciğerde vaskülatürlerden kurdu. Böylece, anjiyogenez yetişkin akciğerlerde 24,26,27 rejeneratif alveolarization kilit roller oynar. Buna ek olarak, düzensiz anjiyogenez, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), 28, bronkopulmoner displazi (SKB), 21-23, ve pulmoner fibroz 29 gibi kronik akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Böylece, akciğerleri mühendislik veya kronik akciğer hastalıklarının tedavisi için daha etkili stratejiler geliştirmek, akciğer özel anjiyogenez temel mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Her organ fizyolojik ve patolojik durumlarda 30-33 arasında farklılık benzersiz mekanik ve kimyasal özelliklere gösterir. Bu organa özgü microenvironrından endotel hücre davranışlarını düzenleyen ve bir organ-spesifik şekilde 24,34-36 vasküler ağı oluşumu sonucu alacak. Böylece, akciğer rejenerasyonu için daha etkin stratejilerin geliştirilmesi için, akciğer özgü angiogenesisi altında yatan mekanizmanın anlaşılması gerekir. Subkutan hidrojel implantasyonu gibi in vivo geleneksel anjiyojenez tahlilleri anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Son zamanlarda, fare akciğer elastik kalıp içinde Matrigel implant için yeni bir yöntem geliştirilmiştir ve başarılı bir jel 22, kan damarları ve akciğer epitelyal hücreleri iyileştirme gösterilmiştir. Bu eşsiz bir yaklaşım araştırmacılar fizyolojik ve patolojik durumlarda, kan damarları ve vasküler olmayan akciğer hücreleri arasında akciğer özgü anjiyojenezin mekanizması olarak etkileşimleri keşfetmek için izin verir. 1) Matrigel klinik uygulama için uygun olmadığı; 2) EBir klinik olarak daha uygun bir yaklaşım olarak, hidrojeller ve ev sahibi akciğer dokusunda ve 3) akciğer elastik kalıp potansiyel solunum sırasında akciğer fonksiyonu ve ağrı gibi yakınmalara yol açar arasındaki etkileşimi etkileyebilir jel döküm için kullanılan Lastic kalıp, bir 3D fibrin matriks anjiogenik faktörleri içeren (vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)) elastik kalıp döküm olmaksızın fare akciğer implante edilmiş ve başarılı bir şekilde ana akciğer türetilmiş angiogenesisi değinmeyecek olmuştur. Fibrin jel, trombinle ayrılmış fibrinojenden oluşan polimer fibriller yakalamak için in vivo 40,41 anjiyojenezi hızlandırmak için örneğin bFGF ve VEGF gibi anjiyojenik faktörlerin bir çeşitliliği bilinmektedir. Çünkü onun rejeneratif yeteneği ve biyobozunur doğa 42, fibrin jel yaygın doku mühendisliği alanında kullanılır. Bu makalede yaşayan Adul akciğer yüzeyinde fibrin jel implant bir roman ve benzersiz bir yaklaşım tanıttıt, fare ve ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men in vivo jellerin içinde özetlenen olduğunu göstermektedir. Akciğer özel anjiyogenez çalışma araştırmacılar sağlayan bu yöntem, büyük olasılıkla akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımlarının gelişmesine yol ve anlamlı başarıyla yetişkin akciğeri yeniden çabalarını ilerleyecektir.

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Kök hücre araştırma ve biyomühendislik tekniklerinden son önemli gelişmeler yeniden ve ortopedik ve periodontal alanlarda basit dokularda hasarı onarmak için biomateryaller kullanan büyük ilerleme kaydettik. Organ yenilenmesi biyolojik süreçleri iyi araştırılmış değil çünkü Ancak, yapılar ve akciğer gibi daha karmaşık üç boyutlu (3D) organların işlevlerini yeniden çalışır çok başarılı olmamıştır. Angiogenesisin, yeni kan damarlarının oluşumu, organ yenilenmesi kilit rol oynadığı açık hale gelmektedir. Yeni vaskülatürlerden oksijen, besinler ve organ yenilenmesi için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri sunmak değil, aynı zamanda rejenere dokularda lokal bir öğretici sinyallerini sağlamaz olarak, oluşturulmuş. Bu nedenle, başarılı bir yetişkinde akciğerlere yeniden oluşturmak, lokal, akciğer dokularının sürücüler rejenerasyonu angiogenesis olan akciğer özgü mikroçevrelerde özetlemek için gereklidir. Co rağmennventional, in vivo bu hidrojeller (örneğin, fibrin ve kollajen jelleri veya Matrigel - Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan ECM proteini karışımı) bakımından zengin hücre dışı matrisin (ECM), deri altından implante anjiyojenez tahlilleri, yoğun keşfetmek için kullanılır akciğer biyomateryaller ortotopik implantasyonu için yöntemler iyi tespit edilmemiştir çünkü anjiyojenez genel mekanizma, akciğer spesifik anjiyojenez iyi karakterize edilmemiştir. Bu protokolün amacı jel içinde ev sahibi akciğer kaynaklı anjiyogenez başarılı recapitulation sağlayan, yaşam yetişkin fare akciğer yüzeyinde fibrin jel implant benzersiz bir yöntem tanıtmaktır. Bu yaklaşım, akciğer özgü mikroçevresinin, normal ve patolojik durumlarda hem anjiyogenez ve alveol yenilenmesini kontrol eden mekanizmalar keşfetmek için araştırmacılar sağlar. Implante biyomalzemeler sunulduğundan beri komşu l fiziksel ve kimyasal sinyalleri tedarik veung dokular, hastalıklı akciğer bu biyomalzeme implantasyonu potansiyel akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için araştırmacılar sağlayan, komşu hastalıklı dokuları normale olabilir.

Ana akciğer türevi damar oluşumu, akciğer implante biyomalzeme içinde özetlenen olup olmadığını incelemek için, fibrin jel büyük anjiyojenik faktörler VEGF ve bFGF ile desteklenmiş (0, 10 ve 100 ng / ml her biri) gibi canlı fare akciğer yüzeyine yerleştirildi Matrigel 22 kullanılarak bildirdi. Şekil 1a gösterildiği gibi bu anjiyojenik büyüme faktörleri içerir fibrin jeller 47 imal edildi. Torakotomi sonra, sol akciğer yüzeyinde küçük bir alanda forseps kullanılarak kazınmış ve fabrikasyon fibrin jel FDA onaylı ve yaygın durdurmak için etkili bir dolgu olarak kullanılan fibrin yapıştırıcı küçük bir miktar kullanılarak yetişkin fare akciğer, implante edilmiş hava kaçağı ve akciğer cerrahisi 48,49 (Şekil 1b) kanama azaltmak. Çoğu fareler ciddi solunum semptomları (örn, pnömotoraks, solunum sıkıntısı olmadan) iyileşti. Yedi gün implantasyondan sonra, fareler öldürüldü ve akciğerler Harve edildisted. Takılan fibrin jel 7 gün implantasyon (Şekil 1c) sonra ev sahibi akciğer içine dahil oldu. Konfokal floresan görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon VEGF / bFGF doza bağımlı bir şekilde 7 gün implantasyon sonrası jeller içinde damar ağları oluştuğunu konak kaynaklı CD31-pozitif endotel hücreleri göstermiştir (Şekil 2a, c). Tip I (AQP5 pozitif) ve tip II (SP-B, pozitif), akciğer epiteli hücreleri, VEGF ve bFGF (her biri 100 ng / ml) (Şekil 2a) daha yüksek konsantrasyonları ile takviye edilmiştir jellerin içinde yeni oluşan kan damarları boyunca alındı . Histolojik kesitlerin H &amp; E boyama konakçı hücrelerin, diğer türleri de implantasyon (Şekil 2b) sonra jel, 7 gün doğru göç ettiklerini ortaya çıkarmıştır. Bu bulgular konak akciğer kaynaklı rejeneratif damar ağları başarıyla anjiyogenik faktörler ile desteklenmiş ve yetişkin kalıplar yüzeyinde implante edilir fibrin jel içinde inşa edilmiştir düşündürmektedirse akciğer. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1:. Sol akciğerde (ok başları) kazınmalıdır visseral plevra üzerinde implante implantasyon öncesi hazırlanan (a) Fibrin jel (b) Fibrin jel (c) İmplant fibrin jel (ok başları) 7 gün implantasyon sonrası ev sahibi akciğer dahil.. Ölçek çubukları 1 mm arasındadır. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52012/52012fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2 (a), vasküler ağların oluşumu gösteren floresan mikrograflan (CD31 pozitif, yeşil) ve işe tip I (AQP5 pozitif; kırmızı) ve tip II (SP-B pozitif; kırmızı) fibrin jel içinde akciğer epitel hücreleri ile desteklenmiş VEGF ve bFGF çeşitli konsantrasyonlarda (7 gün implantasyon sonrası / ml her biri) ng, 0, 10 ve 100. Kesikli çizgiler implante fibrin jel ve ana akciğer arasındaki arayüzü göstermektedir. Ölçek çizgisi:. 20 um (b) 7 gün implantasyondan sonra fibrin jel konak hücrelerin infiltrasyonunu gösteren H &amp; E ile boyama ışık mikrografı. Oklar jel ve ev sahibi akciğer arasındaki arayüzü gösterir. Ölçek çizgisi: 20 um VEGF ve bFGF çeşitli konsantrasyonları ile takviye edilmiş olan fibrin jel yeni oluşmuş kan damarlarının öngörülen alanlarını gösteren (c) Grafik 7 gün implantasyondan sonra (0, 10, 100 her ng ​​/ ml)..

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Fare Akciğer Fibrin Gel implantasyonu Akciğer özel Anjiogenez Eğitim için

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

Tıp

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

Biyobozunur polimerik nano partiküllerin kullanılması Tedavi Angiogenezis Programlama Kök Hücreler

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

Biyomühendislik

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

İskemik Sıçan Akciğer Angiogenezis

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

Kanser Araştırmaları

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

Fare Modeli Inferior Vena Cava İnterpozisyon Greft İmplantasyonu

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

Yaklaşım Imaging Multimodal Bleomycin kaynaklı akciğer fibrozis farelerde boyuna değerlendirmesi için mikro-CT ve floresan moleküler tomografi dayalı

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Bleomisin endotrakeal enjeksiyon tarafından fare akciğer hasarı indüksiyon

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

Fare akciğer Içinde seçici Ajan biriktirme geliştirmek için doğrudan Intrabronchial yönetim

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

Hücreden Arındırılmış Fare Akciğerleri ve Primer İnsan Endotel Hücreleri Kullanılarak Biyomühendislik Ürünü Akciğerin Transplantasyonu

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...