Name: single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope
Uploaded: 2014-08-15T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope at JoVE.com

Bu proje Kara, Baden-Württemberg tarafından yanı sıra Avrupa Birliği, Europäischer Fonds tarafından finanse für Regionale ENTWICKLUNG die edildi. Yazarlar usta teknik yardım için U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 hücre hattı ve Claudia HINTZE sağlamak için Rainer Wittig (ILM Ulm) teşekkür ederim.

1. Hücre Sferoid Büyüyen ve Kuluçka <ol><li> Deney 1: Hücre sferoidler bir kemoterapötik ajan ile inkübe <ol><li> (6 plakaları için yeterlidir) 30 ml kültür ortamı Agaroz 0.45 g eklenmesi ile kültür ortamı içinde% 1.5 agaroz hazırlayın. </li><li> Zaman zaman bu karıştırılırken aşama 1.1.1 en az 80 ° C için karışımın ısıtılması. </li><li> 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna aşama 1.1.2 ısıtılan karışımın 50 ul doldurun ve 1-2 saat içinde katılaşır sağlar. Kullanılana kadar 5 ° C&#39;de buzdolabında kapatılmış ve kaplı plakalar saklayın. </li><li> Hazırlanan 96 oyuklu% 10 fetal dana serumu (FCS) ile takviye edilmiş Ham F-12 kültür ortamı ihtiva eden Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamında (DMEM) içinde plaka ve% 1 penisilin / streptomisin her çukuruna 150 MCF-7 göğüs kanseri hücreleri ile ilgili Tohum . </li><li> % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde yaklaşık 200-300 um bir çapa kadar 5-7 gün boyunca büyütün sferoidler76 C. </li><li> % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de bir kuluçka makinesi içinde 2 uM ve (kültür ortamında) 8 uM arasında değişen bir konsantrasyonda, 6 saat süre antrasiklin antibiyotik doksorubisin hidroklorid ile hücre küremsilerin inkübe edin. </li><li> Kültür ortamının veya Earle Dengeli Tuz Çözeltisi (EBSS) önce mikroskop ile hücre küremsilerin yıkayın. </li></ol></li><li> Deney 2: Bir redoks sensör ifade küresellerde Oksitleme işlemi <ol><li> DMEM içinde 96 çukurlu bir levhanın sürekli agaroz jel ile kaplı çukurlara glutation duyarlı yeşil floresan redoks sensörü GRX1-roGFP2 (yöntem adımlarında tarif 1.1.1-1.1.3) ile transfekte edilmiş 400 U251-MG-L106, glioblastoma hücreleri ile ilgili Tohum Kültür ortamı,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve higromisin B (ug / ml 150 ug) ile takviye edilmiştir. </li><li> % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde yaklaşık 200-300 um bir çapa kadar 5-7 gün boyunca büyütün sferoidler. </li><li> 10 &amp; # ekle181, 100 mM&#39;lik bir stok çözeltisi oluşturmak için 990 ul iki kez damıtılmış su, hidrojen peroksit çözeltisi (purum pa, ≥% 30) l 12 saat içinde kullanılmalıdır. </li><li> Hemen deneyden önce adımdan EBSS&#39;ye 1.2.3 50 mcM stok solüsyonu sulandırmak. </li><li> Redoks sensör oksitlenmesi için EBSS&#39;ye hidrojen peroksit 50 uM ile, ölçüm sırasında mikroakışkan sistemi vasıtasıyla hücre küremsilerin inkübe edin. </li></ol></li><li> Deney 3: Başlatma ve parçacıklarının içindeki hücresel nekroz etiketleme <ol><li> Ile desteklenmiş DMEM kültür ortamı içinde bir 96-yuvalı plakanın agaroz jel ile kaplı çukurlara Tohum 400 hücreler (örneğin, U251-MG-L106-GRX1-roGFP2 glioblastoma hücreleri) (yöntem adımlarda açıklandığı 1.1.1-1.1.3) % 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve higromisin B (150 mg / ml). </li><li> % 5 CO2 ve 37 ° C&#39;de bir inkübatör içinde yaklaşık 200-300 um bir çapa kadar 5-7 gün boyunca büyütün sferoidler. </li><li> Hücre inkübeKültür ortamı içinde, 1 mM&#39;lik bir konsantrasyonda 3 saat mitokondriyal elektron taşıma inhibitörü rotenone ile sferoidler hücresel nekroz oluşturma. Buna ek olarak, nekrotik hücreleri etiketlemek için 1 ml kültür ortamı içinde 1 ul bir konsantrasyonda 3 saat için bir yeşil boya sitotoksisite ile birlikte inkübe edilir. </li><li> Kültür ortamının veya mikroskop önce EBSS ile hücre küremsilerin yıkayın. </li></ol></li></ol> 2. Işık Sayfası Ayarı NOT: En iyi sonuçları elde etmek için, ışık ışını tabakanın bel objektifin odak düzleminde olduğu sağlanmalıdır. Kiriş bel konumu sadece (- 2.8 adım 2.5) kılcal göre dikey konumda ışık tabakası gözlemleyerek hizalanabilir. <ol><li> Devrik bir mikroskop kullanarak ve Ref tarif edildiği gibi, SPIM uyarım monte modülü. 16, konumlandırma tablonun tablaya (Şekil 1A bakınız). </li><li> 1 ile mikroskop donatın0X / 0,3 veya 20X / 0.5 mikroskop objektif lens ve mikroskop algılama yolunda bir uygun uzun-pass filtre (örneğin, λ ≥ 515 nm). </li><li> Mikroskop algılama noktasına bir entegre kamera monte edin. </li><li> Tercihen 470 nm bir eksitasyon dalga boyuna sahip bir lazer ya da bir lazer diyot paralel bir birleştirilmiş ışın kullanarak ve SPIM modüle uygulayın. </li><li> Işık ışını tabakanın bel bölgesinin bir eksenel olarak yer değiştirmesi için dikey bir konuma transfer ışık tabakası 90 derece ile silindirik lens döndürün. </li><li> , Numune tutucu içindeki bir floresan boya ile bir sıvı içeren bir kılcal yerleştirin. </li><li> Mikroskop konumlandırma tablosuna kılcal numune tutucu takın ve merkezli ve ışık tabakanın ışın bel odakta ve bu şekilde, kılcal hizalayabilmesi. </li><li> Silindirik bir mercek kendisinin eksenel pozisyonunun değiştirilmesi ile bel kiriş ayarlayın. Reklam sonra lens geri dönünayarlayabilme özelliği. </li></ol> 3. Hücre Sferoid Uygulama ve Mikroskop Yem Senkronizasyon <ol><li> 600 um x 600 um iç enine kesitine ve 120 um arasında bir duvar kalınlığına sahip ayrı olarak ya da dikdörtgen bir borosilikat cam kılcal 16 içinde gruplarda hücre küremsilerin yerleştirin. Hücre sferoit olması ile uygulanması için iki teknik başarılı olduğu kanıtlanmıştır. <ol><li> Başparmak ve orta parmak ile dik boş kılcal alın ve işaret parmağı ile üst açıklık mühür. Alt çevresi sıvı hücre sfero yakın açıklık (EBSS veya kültür ortamını) getirin. Üst açıklığından işaret parmağı bırakın. O hücre sfero ile sıvı kılcal güçleri tarafından derhal batırılmış olacak. Kılcal ilgili dik konumda yerçekimi tarafından doldurulmuş kılcal içindeki sfero konumunu ayarlayın. </li><li> Seçenek olarak ise, pipetleme yoluyla kılcal hücre sfero uygulanır. Bakım tha alınküremsi boyutu için yeterince büyük bir yandan bir pipet ucunun açılması, ve t, diğer taraftan, daha az ya da kılcal iç çapı boyutuna eşit boyutlara sahiptirler. </li></ol></li><li> Mikroskopi için özel bir numune tutucu içindeki içindeki sfero ile kılcal yerleştirin. </li><li> Mikroskop konumlandırma tablosuna kılcal numune tutucu ekleme ve merkezli ve odaklanacağı gibi hücre sfero hizalayabilmesi. </li><li> Işık tabaka ve yansıtma aynası konumunu ve silindirik lens ayarlanmasıyla tespit yolu mikroskop objektif merceğin odak düzlemi arasındaki eşleştirmeyi ayarlayın (Şekil 1B ayar vidası bakınız). </li><li> Mikrometre vidasını ayarlayın kırılma endeksleri ve fishtank etkisini telafi etmek için objektif lens sayısal açıklığına göre (Şekil 1B bakınız). NOT: Farklı kırılma numunenin endeksleri ve t çevreleyen ortamo objektif lens kayması ve odak düzlemi kayma arasındaki fark objektif lens kurşun. Işık tabaka amacı, taret hareket ettirildiği için, ışık tabakanın (objektif lens kaymasına karşılık gelir) ve odak düzlemi kayması geçiş arasında bir uyumsuzluk bir manivela kolu ile dengelenir (Şekil 1B&#39;ye bakınız). Mikrometre vida objektif merceğinin sayısal açıklığı ve kırılma indeksleri göre ışık tabakanın geçişi ayarlamak için, üst ve alt mil arasındaki mesafenin adapte etmek için kullanılır. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig1highres.jpg" width="500" /> Tek düzlem aydınlatma Şekil 1. (A) ters bir mikroskop konumlandırma tablo taban plakasına monte tek düzlem aydınlatma modülü resmi, (B) kurulummodülü ve mikroskop yem senkronizasyon odak düzlemi ve aydınlatma düzlemi arasındaki kaldırma-uyumsuzluğunu (fishtank etkisi) telafi etmek. Δz o odak düzlemi kayması ve ışık tabakanın ön objektif ile Δz kaymasını gösterir. Kakma sfero içeren kılcal damarların kesitlerini göstermektedir. Sol: Dikdörtgen kılcal 600 mikron (duvar 120 mikron) iç çapı ile. Sağ: dönüş için kullanılır Kur. Bir iç yuvarlak kılcal (iç çapı 400 mm, dış çapı 550 mm) dış dikdörtgen kapiler içinde döndürülür. İki kılcal boşluklar arasındaki boşluk bir daldırma sıvısı ile doldurulur. Dinamik Sıvı Ortamında 4. Ölçme NOT: Bir önceki protokol hücre küremsi önce basit yer çekimi ile kılcal yerinde bekletilir ve daha sonra tutulan bir ölçme işleminin statik bir inkübasyon için kullanılır. Daha fazla fixati gerek yokturüzerinde. Ancak, dinamik bir inkübasyon ve bu nedenle, dinamik bir ortam alım kinetiği ölçmek için tercih edilir madde akım ölçümleri için, bir bu alt-protokol başarabilir. 4.5-4.9 örnek ulaşan hava kabarcıklarını önlemek için kritik adımlar. <ol><li> 30 dakika iç cam yüzeyine bir hücre sferoit olması daha sonra hücre yapışmasını desteklemek için FCS ile kılcal doldurun. </li><li> Tükenmiş kılcal kalan FCS kaplama en az 12 saat boyunca kurumasına izin verin. </li><li> Adım 3.2 &#39;de tarif edildiği gibi FCS kaplanmış kılcal hücre sfero tanıtılması. </li><li> Sfero hücresel yapışma neden olmak için% 5 CO2 ve ek 2-4 saat boyunca 37 ° C&#39;de kuluçka makinesi içindeki kılcal bırakın. </li><li> Mikroakışkan sisteminin kan toplanması parçası kadar (bakınız Şekil 2). (: 0.89 mm iç çap) flüoresan boya, ilaç ya da maddesini ihtiva eden kültür ortamı ile boru arasında kan toplanması dolduracak bir peristaltik pompa kullanılır. </li><li> ConneBir kabarcık tuzak mikroakışkan sisteminin kan toplanması parçası BT (bakınız Şekil 2). </li><li> Üretim hücumu boru kabarcık içermeyen kapiler sıkıştırma ve daha sonra boşaltma borusuna kılcal diğer tarafını kelepçe. </li><li> Ayarlama değere (örneğin, 37 ° C) su banyosu sıvı sıcaklığı. </li><li> Arzu edilen bir pompa hızı ile peristaltik pompa ayarlayın (örneğin, akış hızı: 9 ml / dakika, pompa hızı kılcal: 25 mm / dak). </li><li> , Bir alıcı (açık-döngü kurulum) olarak pompalanan sıvı ya toplayın kaynağından (kapalı-döngü kurulum) geri beslemek veya peristaltik pompa (sıkı kapalı döngü kurulum) hortumun içine doğrudan doyurmaya. </li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51993/51993fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. Mikroakışkan kurulum (açık-döngü ve sıkı kapalı-döngü); kakma: Bir sph Aydınlatma, bir inverted mikroskop birleştirilmiş ışık levha bazında floresan mikroskopi kullanılarak bir mikro kapiler içinde eroid. 5. Veri Toplama ve Analizi <ol><li> Lazer gücünü ve görüntü alımı için entegrasyon süresini ayarlayın. </li><li> Adım 5.1 &#39;de tanımlanan parametreler ışık dozu değerlerinin natif hücreleri için yaklaşık 50-100 J / cm2 veya bir fluoresan proteini kodlayan plazmid ile bir floresan boya ile inkübe veya transfekte edilen hücreler için 10-20 l / cm2 aşmayan özen (detaylar Ref. 12 bakınız) fototoksiteyi kaçının. </li><li> Δz etmek için z yığını için artış = ışık tabaka kalınlığı yaklaşık 10 mm olan 3-boyutlu veri analizi için tercih edilen 5-10 um ayarlayın. </li><li> Hücre sfero içindeki odak düzlemi değişimi ile tek görüntü veya Z yığınlarının ölçümleri yapın. </li></ol>

<ol>
	<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of biological confocal microscopy. , (1990).</li><li>Webb, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+optical+microscopy.">Confocal optical microscopy.</a> Rep. Prog. Phys. 59, 427-471 (1996).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>K&#246;nig, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+microscopy+in+life+sciences.">Multiphoton microscopy in life sciences.</a> J. Microsc. 200 (2), 83-104 (2000).</li><li>Neil, M. A., Juskaitis, R., Wilson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+of+obtaining+optical+sectioning+by+using+structured+light+in+a+conventional+microscope.">Method of obtaining optical sectioning by using structured light in a conventional microscope.</a> Opt. Lett. 22 (24), 1905-1907 (1997).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94 (12), 4957-4970 (2008).</li><li>Huisken, J., Swoger, J., del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+SPIM.">Optical sectioning deep inside live embryos by SPIM.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+development+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in development biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li><li>Santi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+fluorescence+microscopy:+a+review.">Light sheet fluorescence microscopy: a review.</a> J. Histochem. Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high+throughput+screening:+the+multi-cellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high throughput screening: the multi-cellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+fluorescence+microscopy+of+living+cells.">Multi-dimensional fluorescence microscopy of living cells.</a> J. Biophotonics. 4 (3), 143-149 (2011).</li><li>Schneckenburger, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+exposure+and+cell+viability+in+fluorescence+microscopy.">Light exposure and cell viability in fluorescence microscopy.</a> J. Microsc. 245 (3), 311-318 (2012).</li><li>Ritter, J. G., Veith, R., Veenendaal, A., Siebrasse, J. P., Kubitschek, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+for+single+molecule+tracking+in+living+tissue.">Light sheet microscopy for single molecule tracking in living tissue.</a> PLoS One. 5 (7), e11639:1-e11639:7 (2010).</li><li>Mertz, J., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+light-sheet+microscopy+in+the+whole+mouse+brain+with+HiLo+background+rejection.">Scanning light-sheet microscopy in the whole mouse brain with HiLo background rejection.</a> J. Biomed. Opt. 15 (1), 016027 (2010).</li><li>Fahrbach, F. O., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+line-scanned+light-sheet+microscope+with+phase+shaped+self-reconstructing+beams.">A line-scanned light-sheet microscope with phase shaped self-reconstructing beams.</a> Opt. Express. 18 (23), 24229-24244 (2010).</li><li>Bruns, T., Schickinger, S., Wittig, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+strategy+and+illumination+of+3D+cell+cultures+in+light-sheet+based+fluorescence+microscopy.">Preparation strategy and illumination of 3D cell cultures in light-sheet based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 17 (10), 101518 (2012).</li><li>Ma, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids+as+an+in+vivo-like+tumor+model+for+three-dimensional+imaging+of+chemotherapeutic+and+nano+material+cellular+penetration.">Multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model for three-dimensional imaging of chemotherapeutic and nano material cellular penetration.</a> Mol. Imaging. 11 (6), 487-498 (2012).</li><li>Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+dependent+uptake+and+interaction+of+doxorubicin+in+MCF-7+breast+cancer+cells.">Cholesterol dependent uptake and interaction of doxorubicin in MCF-7 breast cancer cells.</a> Int. J. Mol. Sci. 14 (4), 8358-8366 (2013).</li><li>Hovorka, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+analysis+of+doxorubicin+accumulation+and+the+indirect+quantification+of+its+DNA+intercalation.">Spectral analysis of doxorubicin accumulation and the indirect quantification of its DNA intercalation.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 76 (3), 514-524 (2010).</li><li>Schickinger, S., Bruns, T., Wittig, R., Weber, P., Wagner, M., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosecond+ratio+imaging+of+redox+states+in+tumor+cell+spheroids+using+light+sheet-based+fluorescence+microscopy.">Nanosecond ratio imaging of redox states in tumor cell spheroids using light sheet-based fluorescence microscopy.</a> J. Biomed. Opt. 18 (12), 126007 (2013).</li><li>Lippert, H., Wald, M., Radt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+arrangement+for+the+production+of+a+light+sheet.">Optical arrangement for the production of a light sheet.</a> U.S. Patent. , (2010).</li><li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy.">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6 (22), 1-8 (2011).</li><li>Bruns, T., Schneckenburger, H., Schickinger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+holder+for+rotation+of+three-dimensional+specimens+in+microscopy.">Sample holder for rotation of three-dimensional specimens in microscopy.</a> European Patent Application. , (2013).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu el yazması bir ışık tabakası veya 3-boyutlu hücre sistemleri için optimize edilmiştir tek düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) aygıtı, örneğin çok hücreli tümör sferoitleri (MCTS) açıklar. Üç örnek uygulamaları (1), bir sitostatik ilacın alınması ve (kemoterapötik etkinliğe katkısı hala değerlendirilmesi gereken kalır), bir bozunma ürününe onun kısmi dönüşüm, genetik olarak kodlanmış glutation sensörünün kullanımı üzerine ile redoks durumunun (2) ölçümlerdir...

Iyi kurulmuş yöntemleri (konfokal veya çoklu foton lazer tarama mikroskopisi 1-4, yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi 5,6) hafif levha veya tek düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) ek olarak 3D görüntüleme 7,8 değerli bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır, 9. Özel ilgi ilaç keşfi araştırmaları 10,11 giderek kullanılan 3 boyutlu hücre kültürleri, örneğin, çok hücreli tümör sferoidlerle (MCTS), onun uygulamadır. Ayrıca, SPIM hatta uzun süreli maruz kalma ya da yineleyici ölçümleri üzerine düşük ışık dozunun yalnızca bu düzlem ışığına maruz numunenin her düzlemde ölçümü için yana, numunenin canlılığını korumak için gerekli olan tercih edilen bir yöntemdir. Bu, her bir odaklama düzleminin tespiti için tüm numune aydınlatılır diğer mikroskopi teknikleri, aksine, ışık dozu özetliyor sayıda düzlemin üzerine kaydedilmesi ve böylece örnek 12 zarar verebilir. </p&gt; Işık mikroskobu ya da tabaka SPIM silindirik lens kullanımı ile ya da (bir yorumda bakınız Ref. 8) verici lazer ışını tarayarak ya da gözlem yoluna dik yönde numunenin aydınlatma dayanmaktadır. Bu genellikle özel örnek odaları 13,14 veya matrisinim gerektirir örneğin, agaroz 7,15, özel yüksek maliyetli mikroskoplar uygulanmaktadır. Bu sistemlere bir alternatif olarak SPIM için nispeten basit bir aydınlatma aygıtı geliştirilmiştir ve bu geleneksel bir ters mikroskop 16 (Şekil 1 &#39;e bakınız) özel olarak uyarlanmıştır. Yaklaşık 100 um arasında bir alan derinliği üzerinde 6-10 um kalınlıkta ince bir tabakaya bir silindirik bir mercek (0.08: 50 mm, sayısal açıklık odak uzunluğu) 8 mm&#39;lik bir çapa genişletilmiş ve odaklanmış bir lazer ışını içerir . Örnekler mikroskop objektif len önüne yerleştirilen 600-900 mikron iç çapa sahip olan bir dikdörtgen kılcal bulunurfloresan tespiti için lar. Bu ana özellikleri şu anda tamamlanan ve tutmak için ve floresans saptama (aynı optik yol boyunca ikinci (eksenel yönde) örnekleri, aydınlatan ışık tabakanın senkron uyum ve objektif lens döndürülmesi için gelişmiş mikro-kapiller yaklaşımların kullanımı optimize edilmiştir deplasman uzunlukları böylece gerekli miktarlarda ve giderleri en aza indirmek, mekanik itmesinin bir düzeltilmesi) ve floresan boyalar, farmasötik maddeler ya da ilaç uygulaması için bir mikroakışkan sisteminin uyum gerektirir.

<table><tbody><tr><td>Microtiter plate</td><td>Orange Scientific</td><td>4430100</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Carl Roth GmbH</td><td>3810.1</td><td>For cell spheroid growing</td></tr><tr><td>MCF-7 cell line</td><td>CLS Cell Lines Service GmbH</td><td>300273</td><td>Cell line</td></tr><tr><td>U251-MG-L106 cell line</td><td></td><td></td><td>Cell line</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG0435</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>DMEM/Ham&#039;s F-12</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>FG4815</td><td>Culture medium</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>S0615</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin</td><td>Biochrom AG (Merck Millipore)</td><td>A 2213</td><td>Antibiotics</td></tr><tr><td>Hygromycin B</td><td>PAA Laboratories&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>P02-015</td><td>Antibiotic</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>E3024</td><td>Cell culture supplement</td></tr><tr><td>Doxorubicin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>D1515</td><td>Fluorescent dye (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Green cytotoxicity dye</td><td>Promega GmbH</td><td>G8742</td><td>CellTox - fluorescent cytotoxicity dye</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>R8875</td><td>Cellular inhibitor (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>95302</td><td>Reagent for oxidation (CAUTION: acute toxicity)</td></tr><tr><td>Capillary</td><td>VitroCom&amp;nbsp;</td><td>8260-050</td><td>Sample preparation</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Carl Zeiss Jena</td><td>Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRc CCD-camera</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>426508-9901-000</td><td>CCD-camera</td></tr><tr><td>AxioVision data aquisition software</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>version 4.8.2.</td><td></td></tr><tr><td>Laser diode</td><td>Pico Quant GmbH</td><td>LDH-P-C-470</td><td>Used with driver PDL800-B</td></tr><tr><td>Peristaltic pump</td><td>Ismatec Labortechnik</td><td>MS-1 Reglo</td><td>Re-calibrated to reduce the minimum pump speed by 1/10&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone tubes</td><td>IDEX Health &amp;amp; Science GmbH</td><td>TYGON R3607</td><td></td></tr></tbody></table>

single plane illumination module and micro-capillary approach for a wide-field microscope

Kolayca ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edilmiş anlatılan ışık tabaka ya da tek bir düzlem aydınlatma mikroskobu (SPIM) için bir modül, örneğin, çok hücreli tümör sferoidler (MCTS). SPIM uyarma modülü şekiller ve örnek dik mikroskop algılama yoluna açık tabaka ile aydınlatılacak şekilde ışığın yönünü değiştirir. Sistem aydınlatan ışık tabakanın her iki ayar durumunda ve hem de floresan tespiti için kullanılan objektif mercek tarafından, örneklerin (aynı zamanda döndürülmesi için bir mikro-kapiller yaklaşımı ve gelişmiş bir versiyonu) tutmak için dikdörtgen kılcal kullanılması ile karakterize edilir Floresan boyalar, küçük miktarlarda farmasötik maddeler ya da ilaç uygulaması için bir mikro-akışkan sistemi adaptasyonu. Bu sistem ile çalışmak için bir protokol verilir ve bazı teknik detaylar bildirilmektedir. Temsilcisi sonuçları up (1) ölçümlerini içermektedirbir oksitleyici madde ilave edilmesi üzerine bir sitostatik ilaç (doksorubisin) ve bir bozunma ürünü olan kısmi dönüşüm genetik olarak kodlanmış glutation sensörünün kullanılmasıyla, (2) bir redoks ölçüm yapmak, ve (3) başlangıç ​​ve inhibisyon sonucunda nekroz etiketleme mitokondriyal solunum zinciri. Mevcut sistemler ile karşılaştırıldığında, bu SPIM modülünün farklılıklar ve avantajları tartışılacaktır.

Deney 1: Hücre sferoidler bir kemoterapötik ajan ile inkübe Önceden inkübe MCF-7 hücre sferoit (8 uM, doksorubisin, 6 saat) bir z-yığın tarama, Şekil 3&#39;te gösterilmektedir. Bu hücresel alımı ve doksorubisin 17 arasında dağılım ve bozunma ürünü 18,19 hakkında ayrıntılı bilgi vermektedir. İç küremsi alanlarda bozunma ürünü tarafından yayılan yeşil flüoresans hücre zarının 19 baskın hal...

Watch this Scientific Journal Video about Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope at JoVE.com

Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

Tek düzlem aydınlatma mikroskopi için bir modül (SPIM) kolay bir şekilde ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edildiği açıklanmaktadır. Numune bir dikdörtgen kılcal içinde yer almaktadır ve mikro-akışkan sistem floresan boyalar ile, farmasötik maddeler ya da ilaç küçük miktarlarda uygulanabilir.

Tek Düzlem Aydınlatma Modülü ve geniş alan Mikroskop Mikro-kılcal Yaklaşım

A module for light sheet or single plane illumination microscopy (SPIM) is described which is easily adapted to an inverted wide-field microscope and ...

single-plane-illumination-module-micro-capillary-approach-for-wide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Engineering

9.7K Görüntüleme.  Aalen University.  Tek düzlem aydınlatma mikroskopi için bir modül (SPIM) kolay bir şekilde ters geniş alan mikroskobu üzere uyarlanmıştır ve 3-boyutlu hücre kültürleri için optimize edildiği açıklanmaktadır. Numune bir dikdörtgen kılcal içinde yer almaktadır ve mikro-akışkan sistem floresan boyalar ile, farmasötik maddeler ya da ilaç küçük miktarlarda uygulanabilir. 

Video: Single Plane Illumination Module and Micro-capillary Approach for a Wide-field Microscope

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Biyomühendislik

Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

Bir Chip Lensless Floresan Mikroskopi

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

Lensfree On-chip Tomographic Microscopy Employing Multi-angle Illumination and Pixel Super-resolution

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different size scales. In micrometer and millimeter scales, optical microscopy modalities find increasing use owing to the non-ionizing nature of visible light, and the availability of a rich set of illumination sources (such as lasers and light-emitting-diodes) and detection elements (such as large format CCD and CMOS detector-arrays). Among the recently developed optical tomographic microscopy modalities, one can include optical coherence tomography, optical diffraction tomography, optical projection tomography and light-sheet microscopy. 1-6 These platforms provide sectional imaging of cells, microorganisms and model animals such as C. elegans, zebrafish and mouse embryos.
Existing 3D optical imagers generally have relatively bulky and complex architectures, limiting the availability of these equipments to advanced laboratories, and impeding their integration with lab-on-a-chip platforms and microfluidic chips. To provide an alternative tomographic microscope, we recently developed lensfree optical tomography (LOT) as a high-throughput, compact and cost-effective optical tomography modality. 7 LOT discards the use of lenses and bulky optical components, and instead relies on multi-angle illumination and digital computation to achieve depth-resolved imaging of micro-objects over a large imaging volume. LOT can image biological specimen at a spatial resolution of &lt;1 &mu;m x &lt;1 &mu;m x &lt;3 &mu;m in the x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging volume of 15-100 mm3, and can be particularly useful for lab-on-a-chip platforms.

Lensfree optical tomography is a three-dimensional microscopy technique that offers a spatial resolution of &lt;1 &mu;m &times; &lt;1 &mu;m &times; &lt;3 &mu;m in x, y and z dimensions, respectively, over a large imaging-volume of 15-100 mm3, which can be particularly useful for integration with lab-on-a-chip platforms.

Çok açılı Aydınlatma ve Pixel Super çözünürlüklü istihdam Lensfree On-chip Tomografik Mikroskopi

Tomographic imaging has been a widely used tool in medicine as it can provide three-dimensional (3D) structural information regarding objects of different ...

High-Throughput Total Internal Reflection Fluorescence and Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy Using a Photonic Chip

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced contrast due to optical sectioning. The conventional approach is to use high numerical aperture microscope TIRF objectives for both excitation and collection, severely limiting the field of view and throughput. We present a novel approach to generating TIRF excitation for imaging with optical waveguides, called chip-based nanoscopy. The aim of this protocol is to demonstrate how chip-based imaging is performed in an already built setup. The main advantage of chip-based nanoscopy is that the excitation and collection pathways are decoupled. Imaging can then be done with a low magnification lens, resulting in large field of view TIRF images, at the price of a small reduction in resolution. Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) were imaged using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM), showing a resolution comparable to traditional super-resolution microscopes. In addition, we demonstrate the high-throughput capabilities by imaging a 500 &#181;m x 500 &#181;m region with a low magnification lens, providing a resolution of 76 nm. Through its compact character, chip-based imaging can be retrofitted into most common microscopes and can be combined with other on-chip optical techniques, such as on-chip sensing, spectroscopy, optical trapping, etc. The technique is thus ideally suited for high throughput 2D super-resolution imaging, but also offers great opportunities for multi-modal analysis.

Chip-based super-resolution optical microscopy is a novel approach to fluorescence microscopy and offers advantages in cost effectiveness and throughput. Here, the protocols for chip preparation and imaging are shown for TIRF microscopy and localization-based super-resolution microscopy.

Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu

Total internal reflection fluorescence (TIRF) is commonly used in single molecule localization based super-resolution microscopy as it gives enhanced ...

Biyokimya

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Label-Free Imaging of Single Proteins Secreted from Living Cells via iSCAT Microscopy

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living cells in real time. In this protocol, we cover the fundamental steps to realize an iSCAT microscope and complement it with additional imaging channels to monitor the viability of a cell under study. Following this, we use the method for real-time detection of single proteins as they are secreted from a living cell which we demonstrate with an immortalized B-cell line (Laz388). Necessary steps concerning the preparation of microscope and sample as well as the analysis of the recorded data are discussed. The video protocol demonstrates that iSCAT microscopy offers a straightforward method to study secretion at the single-molecule level.

We present a protocol for the real-time optical detection of single unlabeled proteins as they are secreted from living cells. This is based on interferometric scattering (iSCAT) microscopy, which can be applied to a variety of different biological systems and configurations.

Etiket içermeyen Imaging, tek proteinler salgılanan iSCAT mikroskobu ile yaşayan hücrelerden

We demonstrate interferometric scattering (iSCAT) microscopy, a method capable of detecting single unlabeled proteins secreted from individual living ...

Mühendislik

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

A Guide to Build a Highly Inclined Swept Tile Microscope for Extended Field-of-view Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain large field-of-view, high-contrast images in thick cells and tissues. Here, we introduce highly inclined swept tile (HIST) microscopy that overcomes this problem. A pair of cylindrical lenses was implemented to generate an elongated excitation beam that was scanned over a large imaging area via a fast galvo mirror. A 4f configuration was used to position optical components. A scientific complementary metal-oxide semiconductor camera detected the fluorescence signal and blocked the out-of-focus background with a dynamic confocal slit synchronized with the beam sweeping. We present a step-by-step instruction on building the HIST microscope with all basic components.

A detailed instruction is described on how to build a highly inclined swept tile (HIST) microscope and its usage for single-molecule imaging.

Son derece eğimli oluşturmak için bir kılavuz döşeme mikroskop genişletilmiş görünümü alan tek molekül görüntüleme için süpürüldü.

Single-molecule imaging has greatly advanced our understanding of molecular mechanisms in biological studies. However, it has been challenging to obtain ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...