The authors thank researchers at the University of Iowa, Drs. Luis Tecedor, Ines Martins and Beverly Davidson for instructions and helpful comments regarding striatal cultures, and Drs. Kara Gordon, Nicole Bode and Pedro Gonzalez-Alegre for genotyping assistance and discussions. We also thank Dr. Eric Weyand (Animal Identification and Marking Systems) for helpful comments regarding tattooing, and Dr. Shutaro Katsurabayashi (Fukuoka University) for helpful comments regarding the mouse culture. This work was supported by grants from the American Heart Association, the Department of Defense (Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), the Dystonia Medical Research Foundation, the Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation, the National Science Foundation, and the Whitehall Foundation (N.C.H.).

NOT: Bu çalışmada yapılan tüm hayvan prosedürleri Iowa Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Paw Pedleri dövme yapılması kullanma Fareler 1. Uzun süreli Kimlik <ol><li> Deneyci bakan pençe ped (plantar yüzeyi) ile bir pençe hareketsiz. Başparmak ve işaret parmağı ile pençe tutun. Pençe sıkmamaya özen gösterin. NOT: Kararlı immobilizasyon dövme pigmenti pençe pad dermis içine yerleştirilir sağlamak için önemlidir, ve bu nedenle 7 kalıcıdır. </li><li> Bir gazlı bez sünger veya bez üzerinde% 70 etanol ile pençe pedi çubukla. </li><li> Bir pamuk uçlu aplikatör cilt yağı uygulayın ve nazikçe pençe ped birkaç kez yüzeyine karşı ucunu basın. Cilt yağ çok az miktarda kullanmak; mevcut olduğunda büyük miktarlarda, cilde ulaşmasını dövme pigmenti önleyecektir. </li><li> Hemen önce dövme mürekkebi içine dövme iğneleri ipuçları Dipdövme için. Ağrı ve enfeksiyon olasılığını azaltmak için, ve aynı zamanda dövme verimliliğini artırmak için, temiz, aseptik ve keskin dövme iğne kullanın. </li><li> Pençe ped yüzeyi cilt yağı ile kaplı iken, pençe pad merkezinde cilde karşı dikey ve hafifçe dövme iğne ipuçları basın ve mürekkep birden çok kez enjekte edilir. Elektrik dövme sistemi hakkında bilgi almak için Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> Yavaşça, bir gazlı bez sünger üzerinde% 70 etanol Sprey cilt yüzeyinde ekstra dövme pigmenti kaldırmak için pençe karşı basın ve dövme kalitesini kontrol edin. Pençe pad orta normal deri pigmentasyonu farklı bir karanlık, yuvarlak nokta olduğunu kontrol edin. Dövme koyu veya kolay görüntüleme için yeterince büyük değilse, önce dövme adımları tekrarlayın. </li></ol> Fast PCR Genotipleme Kit kullanarak 2. Genotipleme Yenidoğan Fareler <ol><li> % 70 etanol ile bir fare kuyruk distal ucunu dezenfekte kuyruk 5 mm ya da daha az kesimipucu ve PCR için kullanılan tipte 8 boru şeridin bir tüpe aktarın. Örneklerin arasında çapraz bulaşmayı önlemek için her yavru için bir un-kullanılan jilet kullanın. Seçenek olarak ise, bir makas kullanımı, ancak bu durumda, dikkatli bir şekilde ve iyice% 70 etanol kullanılarak bıçaklar üzerinde kalan doku çıkarın. Kanama kontrol edin. Kanama oluşursa kanama durana kadar, bir gazlı bez sünger ile kuyruk kesme kısmına basınç uygulayın. </li><li> Bir örnek ihtiva eden her bir PCR tüpü DNA ekstraksiyon çözeltisinden 200 ul ekle. Kit hakkında kompozisyonu ve bilgi Malzemeleri / Ekipman Tablo bakın. </li><li> PCR termal döngü içine boru şeridi yerleştirin ve aşağıdaki programı kullanılarak DNA çıkarma işlemini başlatmak: 1 döngü, 55 ° C&#39;de 10 dakika, 10 dakika boyunca 95 ° C &#39;de 1 döngü için, ve 4 ° C&#39;de tutma. Not: Bu, daha sonra, PCR için kullanılan aynı PCR termal döngü cihazı olup. </li><li> DNA ekstraksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, termal döngü a gelen tüp şeridi çıkarınnd 5 kez ters çevirin. </li><li> Bir un-kullanılan bir 8-tüp şerit tüp, ve ile karıştırmak için her numunenin Transfer çözüm (DNA özü) 4 ul: 2X PCR Hazır II 10 ul, ileri ve geri primerler karışık 2 ul (tavsiye edilen 0.5 uM, her numune için nükleazsız H 2 O dizileri için Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız), ve 4 ul. Bir masa üstü santrifüj kullanılarak Spin kısaca (örneğin, 3 sn). Işlerken dışında her zaman buz üzerinde tüpler tutun. </li><li> Termal bisiklet gerçekleştirin. Görmek Termal program Malzemeleri / Ekipman Tablosu. </li><li> Çoğaltılan DNA ürünleri algılar. Doğrudan bir agaroz jel, bir kuyu içine PCR&#39;dir (20 ul), toplam reaksiyon çözeltisinin yerleştirin. Ayrı bir kuyuya moleküler ağırlık belirteçleri yükleyin. Bir elektrik alanı uygulanır. </li><li> Ultraviyole ışık altında floresan bantları görüntülerini elde edin. </li></ol> Fare Beyin Neuron 3. İlköğretim KültürüGlial Besleyici Layer s NOT: Beyin diseksiyon ve hücre ayrışma (3.1) için prosedürler izleyen tüm prosedürler için ortaktır. Fare glial kültürlerinden prosedürleri (3.2), sıçan glial kültürleri (3.3) ve fare nöronal kültürlerinde (3.4) daha sonra ayrı ayrı açıklanmaktadır. <ol><li> Beyin Diseksiyon ve Hücresel Dissocaiation <ol><li> Hızla beyin kaldırmak ve Hanks solüsyonu içine yerleştirmek, başı kesilerek bir fare veya sıçan yavrusuna Kurban (bileşim için tablo 1 e bakınız) +% 20 (buz üzerinde tutulur), bir 35 mm çanak fetal sığır serumu (FBS). </li><li> İki hemisfer içine orta hat boyunca beyin kesin. Beynin her yarımkürede ilgi bölgeyi (örneğin, serebral korteks, striatum ve hipokampus) sökün. Yüzeyden meninksler ve büyük kan damarları çıkarın. Cerrahi bıçak kullanarak 4-10 ince dilimler halinde beyin bölgesini kesin. </li><li> Zekâ, bir kez 15 ml&#39;lik santrifüj tüp içinde beyin dilimleri durulayınh Hanks çözeltisi +% 20 FBS, Hanks ile sonra da 3 defa &#39;(serumsuz örneğin) bir (4 ° C). , Durulama 5-10 ml solüsyon ekleyin, dilim tüpün dibinde yerleşmek beyin, üst çözüm aspirat, izin ve taze bir çözüm eklemek için. Çözüm aspire durulama işlemi bitirin. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak tripsin içeren sindirim çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin dilim içeren tüp içine doğrudan filtrat ekleyin. Trypsinization oda sıcaklığında 13 dakika devam edelim. </li><li> En iyi şekilde aspire ve 7-10 mi Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C) ilave etmek suretiyle tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks ile iki kez, beyin dilimleri yıkayın &#39;çözeltisi +% 20 FBS ve Hanks daha sonra üç kez&#39; solüsyonu (yani serumsuz) (4 ° C). Solut aspire durulama işlemi bitirmekiyonu temsil etmektedir. </li><li> 3 ml&#39;lik bir şırınga ve bir 0.2 um şırınga filtresi kullanılarak ayrışma çözeltisi (bileşim için tablo 1 e bakınız), 2 ml filtre ve beyin kesitleri ile doğrudan boruya filtrat ekleyin. </li><li> Mekanik görünür doku parçaları kaybolana kadar hafifçe, 10-20 kez öğütülerek hücreleri ayırmak. Bir pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanın ve triturasyonun sırasında kabarcıkları yapmaktan kaçınmak. </li><li> Küçük parçalar yerleşmek için 3 dakika bekleyin. </li><li> Çözeltisi çoğunluğu aktarın (~ 1.5 mi, altındaki bir bir solüsyon) kullanılarak, 3 mi Hanks solüsyonu +% 20 FBS çözeltisi (4 ° C) ihtiva eden bir 15 mL santrifüj tüpüne pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti. Altındaki herhangi bir tortu dahil tipik kültür bozulması ile sonuçlanır, çünkü tüm çözüm transferi yapmayın. </li><li> 4 ° C&#39;de ~ 185 g (~ 1100 rpm) 13 dakika santrifüj uygulayın. </li><li> Yavaşça süpernatant aspire,eklemek 1 ml önceden ısıtılmış pelet orta (37 ° C) kaplama ve hafifçe pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipet kullanarak birkaç kez pipetleme bunu tekrar süspansiyon. NOT: Ortamı kaplama Üç farklı farklı kültür amaçlı kullanılır: fare nöronları orta-2 kaplama, fare glial hücreler orta-1 kaplama, ve sıçan nöronlar ve glial hücreler orta-3 kaplama (kompozisyonlar için Tablo 1&#39;e bakınız) . </li><li> Hemasitometre veya otomatik hücre sayıcı kullanılarak, hücre süspansiyonu 10 ul çıkarın% 0.4 tripan mavisi çözeltisi 10 ul ile karıştırarak, ve canlı hücrelerin yoğunluğunu ölçmek. </li></ol></li><li> Fare Glial Kültürleri <ol><li> Fare hücreleri sağlıklı kültürleri kurulmasına yardım etmek lamelleri yıkayın. <ol><li> Cam bir Petri kabı içinde% 70 nitrik asit içinde cam lamelleri (yuvarlak, 12 mm çapında) daldırın. Alüminyum folyo kullanarak ışıktan koruyun ve bir yörünge çalkalayıcı O / N üzerine yerleştirin. </li><li> Cam coversli durulayındamıtılmış su ile Petri kabındaki PS en az üç kez. Distile su onları bırakın. Bir yörünge çalkalayıcı O / N çanak yerleştirin. </li><li> Biyolojik güvenlik kabininde bir Whatman 150 mm filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın. </li><li> Lamelleri otoklavlayın. </li><li> 24-çukurlu kültür kabına lamelleri yerleştirin. </li></ol></li><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 göre fare yavrular beyin hücreleri elde. Not: serebral kortekste fare glial besleyici tabakanın hazırlanması için tipiktir. Bununla birlikte, bu hipokampus ve striatum gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi için hücre yoğunluğu, uygun ayarlamadan sonra çalışır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 1: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). Ön ısınma kültür ortamı için, kültür inkübatör çözümü (% 5 CO 2 -95% O 2, 37 ° C) O / N, yerleştirmeksıcaklık ve pH değerleri, stabilize olmasına izin verin. </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, bir kaplanmamış T25 kültür şişesine hücre süspansiyonu aktarın. Kültür inkübatör içine yerleştirilir. </li><li> Nitro (DIV), 1 gün içinde iki defa kaplama ile T25 şişesi içinde kültürlenmiş hücrelerin durulama orta 1 (4 ° C). Geri kuvöz içine balon yerleştirin. Bir girdap hareket birkaç kez taze ortamın ~ 5 ml ekleyerek, tamamen Pasteur pipeti şişeye içinde orta aspire ve yavaşça şişeyi eğerek durulama yapınız. </li><li> 6-9 DIV anda, (yani, bir trypsinization gün önce ve 3.2.8-3.2.13 adımda, lamelleri kaplama), (hücre dışı matriks proteinleri ile kaplama malzemesinin 100 ul yer hakkında yorumlar için Malzemeleri / Ekipman bkz: İçindekiler Kaplama bir kültür kabı içinde cam lameller üzerine bir malzeme) ve kültürü inkübatöründe kültür kaplarına yerleştirin. </li><li> 7-10 DIV, at hücreleri 20-4 olduğunda0% konfluent (mekansal sürekli), onları trypsinize. <ol><li> Bir şişe içinde tüm solüsyonu aspirasyon ve ~ Hanks solüsyonu (4 ° C) 13 ml ilave etmek suretiyle, bir kez balon yıkayın, yumuşak bir dönme hareketi bir şişe içinde bir kaç kez tilt ve tamamen çözelti aspire. </li><li> 4 mi tripsin-EDTA çözeltisi DNaz çözeltisi (nihai konsantrasyon, 750 birim / ml) 40 ul ekle 0.2 mikron bir şırınga filtreden geçirilmiştir çözeltisinin, ve şişe hücreler doğrudan filtrat ekleyin. </li><li> Tripsinizasyon kuluçka makinesi içinde 37 ° C&#39;de 13 dakika sürmesine izin verin. </li><li> Şişeye 100% FBS (4 ° C) 2 ml ekleyerek tripsin solüsyonu nötralize. </li><li> Hanks çözeltisi +% 20 FBS (4 ° C), santrifüj ~ 4 ml, bir 5- ila 10-mi bir pipet kullanarak 15 ml santrifüj tüpüne tripsinize hücreleri transfer ~ 185 g ve 13 dakika süre ile 4 ° C ve süpernatant aspire. </li></ol></li><li> Ön Warme 1 ml pelletinid kaplama orta-1. </li><li> Aşama 3.1.13 göre hücre yoğunluğu ölçülür. </li><li> Lamelleri ~ yeniden süspanse glial hücreler 50 ul kaplama cam lamelleri tamamen malzeme, ve plaka aspire. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> Inkübatör lamelleri kültür çanak yerleştirin. </li><li> 20-60 dakika sonra, önceden ısıtılmış her kuyuya orta-1 kaplama 1 ml ekleyin ve inkübatör geri çanak yerleştirin. Not: kaplama ortam ilave edilirken, lamel ortamda yüzer olmayacak şekilde, (hayır kaplama hücreler vardır) lamel çevresini aşağı basın başka bir pipet kullanmak yararlı olacaktır. </li><li> (Cam lamel üzerinde, yani,), glial besleyici tabakanın 1 DIV içinde 1 ml orta yerine önceden ısıtılmış kaplama orta 1, bir kuyu içinde çözelti her aspirasyon ve daha sonra taze aracı ile doldurarak. </li><li> Glial besleyici tabakasının 2-3 DIV at zaman celher bir oyuğa, bundan dolayı DNA replikasyonu ve inhibe etmek için, Ls mitotik durdurucu (81,2 ve 204,8 uM nihai konsantrasyonlar, sırasıyla 5-floro-2&#39;-deoksiüridin + üridin karışımı 10 ul) ekleyin,% 80-100 konfluent Glial hücre çoğalmasını bastırmak. </li><li> Hücreler% 90-100 sıklıkta (glial besleyici tabaka nöronlar kaplama önce 1-2 saat) zaman 7-9 DIV de, kültür ortamı yerine önceden ısıtılmış kaplama, orta-2 (37 ° C). Not: Nöronlar adım 3.4 kullanarak, aynı gün kaplama olacaktır. </li></ol></li><li> Sıçan Glial Kültürleri <ol><li> Kaplama aynı kaplama malzemesi ile T25 kültür şişesi. NOT: Bu adımda 3.3.5 içinde yapışkan olmayan hücreler daha sonra çıkarılması için gereklidir. <ol><li> Şişeye kaplama malzemesinin 2.0 ml ilave edilir, ve kültürü inkübatöründe balon yerleştirin. </li><li> 2-3 saat sonra, şişenin taban kurur, böylece, tam olarak kaplama malzemesini aspire. </li></ol></li><li> Hücreler elde edilirsıçan yavrularından, 3.1 adım göre yöntem. NOT: hipokampus CA3-CA1 bölgesi sıçan glial besleyici tabaka hazırlamak için kullanılır. Bununla birlikte, bu tür beyin bölgelerinden gibi diğer beyin bölgelerinde, farklı sayı ve farklı bölgelerden hücre verimi hücre yoğunluğunda farklılıklar için ayarlama yapıldıktan sonra çalışacaktır. </li><li> Önceden ısıtılmış son hücre süspansiyonu, orta 3: kaplama ~ 4 ml (~ 1 mi). </li><li> Pamuk takılı, yangın cilalı Pasteur pipeti kullanarak, kaplamalı T25 kültür balona hücre süspansiyonu aktarın. Kültürü inkübatöründe (% 5 CO2 -95% O 2, 37 ° C) tutulur. </li><li> 2-3 DIV hücreler% 20-40 konfluent olduğunda, kapağı sıkıca kapama balonu çalkalamak, yapışkan olmayan ya da zayıf biçimde yapışmayan hücreler giderilmiş kuvvetli bir şekilde ~ 10 kat çözeltisi, aspirasyon ile kaplama 4-5 mi ekleme Orta-3 (4 ° C&#39;de). Bir kez bu işlemi tekrarlayın. (Örn tüm şişe zemin üzerinde kültür hücreleri incelemek,tamamen kaldırılır) hücre vücudun dış kenar faz parlak görünen o ki için, yani nöronal (görünür olanlar onaylamak için faz-kontrast mikroskobu) kullanılarak. Bu hücreleri kaldırmak ve daha sonra inkübatör şişeyi geri dönmek için gerektiği kadar işlemi tekrarlayın. NOT: gücü ve bireysel deneyci arasında farklılık olabilir gerekli &#39;sallar&#39; toplam sayısı. Önemli olan bir dizi sayıya sallar toplam sayısını tutmak, ancak nöron benzeri hücreler ortadan kalkar onaylamak değildir. </li><li> 6-8 DIV hücreler% 90-100 sıklıkta olduğu, geçiş adımı 3.2.8 olduğu gibi bunları trypsinizing glial hücreler olduğunda. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, bir kaplanmamış T75 şişeye tripsinize hücreleri transferi, orta-3 (4 ° C), kaplama 10 mi ekleyin ve kültür onları orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelletini inkübatör. NOT: Sıçan glial hücreler iki kez geçişli olacak; Buna fare glial hücreler arbirden çok pasajlar sonra sağlıksız hale çünkü e sadece bir kez pasajlanır. Sıçan, glial hücreler, herhangi bir kaplama malzemesi ile kaplanmıştır değildir T75 şişeleri içinde pasajlanmağa devam edilecektir. Kaplama sıçan glial hücreler çok hızlı büyür ve daha sonra nöronal kültür durumunu bozulacaktır birçok kirpikli hücreler (varsayılan ependimal hücreler), verim sağlar. </li><li> Bir şişe içinde, glial kültür 17-19 DIV de (örneğin, 11 gün pasaj ve tripsinleme bir gün önce ve 3.3.9-3.3.14 adımlarla lamelleri üzerine kaplama sonrası), (yıkanmamış cam lameller üzerine kaplama malzemesinin 100 ul koyun yuvarlak, 12 mm çapında) bir kültür çanak ve kültür inkübatör kültür çanak yerleştirin. NOT: sıçan glial kültürler için, bir fark ile veya lamelleri yıkama olmadan kültür sonuçlarında fark edildi. </li><li> Bir şişede glial kültür 18-20 DIV anda (yani, Pasajlanması sonra 12 gün), st göre, kültür hücreleri trypsinizing glial besleyici tabaka hazırlamakep 3.2.8. </li><li> Santrifüj sırasında, cam lamelleri tamamen kaplama malzemesi aspire. </li><li> Santrifüj işleminden sonra, adım 3.1.13 göre, orta-3 (4 ° C), kaplama, 1 ml pelet tekrar süspansiyon ve hücre yoğunluğunun ölçülmesi. </li><li> 10 4 canlı hücre / ml glial yoğunluğunu ayarlayın ve kaplamalı cam lamelleri glial hücre süspansiyonu 100 ul plaka. NOT: Bu hücreler glial besleyici tabaka kuracak. </li><li> 20-60 dakika süreyle kuvöz içine lamelleri ile kültür çanak yerleştirin. </li><li> Her bir orta-3 (4 ° C) kaplama için 1 ml ilave edilir, ve inkübatör çanak yerleştirin. </li><li> Lamel hücreleri% 40-80 konfluent olduğunda, glial besleyici tabaka 3-4 DIV, içinde önceden ısıtılmış bir büyüme ortamı, 1 ml ilave (sitosin β-D-arabinofuranosid içeren (bileşim için tablo 1 e bakınız) Araç, 4 uM nihai konsantrasyon), glial hücre çoğalmasını durdurmak için. Plaka nöronGlial besleyici tabakasının 7-9 DIV s at hücreleri adım 3.4 kullanarak,% 60-80 konfluent olduğunda. </li></ol></li><li> Fare nöronal kültürlerinde <ol><li> Adım 1 ve 2&#39;ye göre etiket ve genotip doğan farenin. </li><li> Adım 3.1 için fare yavrular kullanın. </li><li> Canlı hücre süspansiyonu yoğunluğunu ayarlamak için ~ kullanılarak, 2.0 x 10 5 hücre / ml önceden ısıtılmış orta 2 fare, glial hücreler üzerinde kaplama ya da kullanımı için kaplama kaplama orta 3 sıçan glial hücreler üzerine kaplama için. </li><li> Yavaşça her kültür ortamı hücre süspansiyonuna eklenmeden tarafından iyi glial besleyici tabaka, hücreler plaka. Not: eklenecek hücre süspansiyonu hacmi de bir kültürde hücrelerin hedef numarası ile belirlenecektir. Örneğin, plakasının hücre süspansiyonu 60 ul / kuyucuk 12,000 hücre elde etmek için. </li><li> Nöronlar kaplama sonra hiçbir çözüm değişiklikler gerekli olduğunu unutmayın. Kültür boyunca, iç o nemlendirerek kuyulardan çözümün buharlaşmasını önlemek için dikkatli olunkültürü inkübatöründe f. </li></ol></li></ol>

The author (Zhengmin Huang) is the president of EZ BioResearch LLC that produces reagents described in this article.

Burada sunulan protokol kuyruk ipuçları fareler genotiplemeye, / etiket fareler tanımlamak için dövme prosedürlerini içerir ve düşük yoğunlukta kültür fare beyin nöronları için. 6-8 yavrular kullanıldığı deneylerde bir turunda, bu işlemler genellikle 6-7 saat toplam sırasıyla ~ 0.5 saat, ~ 4 saat ve ~ 2 saat, gerektirir. (Glial besleyici katmanlar önceden hazırlık hariç) tek bir çalışma günden kısa bir sürede - Bu nöronal kültürlerin kaplama için pups &#39;doğum sırasında gerekli tüm prosedürleri tamamlamak için bir tek deneyci için pratik yapar. Dövme Histoloji, hücre fonksiyonu ve hayvan davranışlarının analizi gibi hayvanların uzun süreli kimlik yetiştiriciliği ve bilimsel çalışmaların amaçları için gereklidir. Hızla yürütülen ve hayvanın yaşam 7,22-25 çok sürer, çünkü yeni doğan hayvanların dövme avantajlıdır. Tpençe yastıkları üzerinde attooing, süspansiyon, örneğin, test edilebilir davranışları koruyarak ya da 22,26 kavrama göre 23 kırpma ayak daha iyi olabilir bazı çalışmalar bu tür eksiklikler kaydetti değil rağmen (örneğin, 25). Ya da reddetme dövme sonra yavrular cannibalizing annelerin hiçbir örneği yoktu. Hayvanların uzun süreli kimlik diğer yöntemler için son değerlendirmeleri 7,23,24 bakın. Genotipleme Bizim protokolde bir kritik özelliği hızlı genotipleme yönteminin kullanılmasıdır. Benzer genotipleme yöntemleri önceki raporlarda (örneğin, 27,28) &#39;de tarif edilmiş olmasına rağmen, burada açıklanan sistem en az iki gelişmeler var. Birincisi, bu başlangıç ​​dokusu, hayvanların yaşına ve amplikon uzunluğu miktarı belli varyasyonları tolere edebilir. Bundan dolayı, başarılı genotipleme 1 gün kadar küçük ve 6 aylık olarak farelere, kullanılarak elde edilebilir ve kullanılarak gerçekleştirilebilirprimer çiftleri geniş yelpazesi. İkinci olarak, bu yöntem, DNA öz çıkarma aşaması için bir durdurma çözeltisi gerektirmez. Bu aşırı tüp işleme ve pipetlenmesini ortadan kaldırır ve bir PCR makinesi ile sürecin paralel çoklu tüp otomasyonu sağlar. örneklerin sayısı kadar ölçeklendirilebilir (örneğin, 96 numune) henüz kolay ve eş zamanlı olarak işlenir. Ayrıca numune tipi kuyruk klipleri sınırlı değildir; kullanılabilecek diğer örnek türleri kulak yumruklar, ayak kupürleri, tüm erken embriyo, plasenta ve dokuları 2-4,29,30 içerir. Farklı hayvan türleri de kullanılabilir. Böylece genotipleme prosedürleri güvenilir (düşük intra-tahlil varyans ile tekrarlanabilir) ve (koşular arasında ya da laboratuvarlar arasında inter-analiz varyans düşük) tekrarlanabilir, yüksek ölçeklenebilirlik avantajı var. Bazı dikkatli sonuçlarının beklenen kalitesini elde etmek için gerekli olduğunu unutmayın. Birincisi, DNA ekstraksiyon sırasında, protokol büyük bir değişim sonuçlarını bozabilir.Örneğin, DNA ekstraksiyonu çözeltisi hacminde belirgin bir azalma (örneğin, aşama 2.2&#39;de 200 100 ul ile ilgili), yine genotipleme sağlar, ancak güvenirliğini azaltabilir ve PCR sonuçları varyasyon neden olabilir. Bu koşullar altında, bu 4 2 ul DNA özü hacmini azaltmak ve PCR reaksiyonları (adım 2.5) sırasında hacim değişikliği telafi etmek için 2 ila 4 ul gelen H2O hacmini artırmak için tavsiye edilir. Kuyruk genel yapısını korur ve tamamen dekompoze olmaz, ancak ikinci DNA çekip çıkarma işleminin sonunda, çözelti hemen bir çok durumda, santrifüj olmadan PCR için kullanılabilir. Fakat tüplerin bu tarif edilen ters doku (adım 2.4), genomik DNA ayrıştırma amacıyla gereklidir. Anlaşılacağı gibi, ikinci dahil sonuçsuz PCR sonuçlara sebep olur, çünkü tüpün altındaki enkaz Üst, çözeltinin berrak parçası kullanılması da önemlidir. Bunlaradımlar az zaman ve çaba ile etkili olacaktır. Aynı şekilde iyi sonuçlar aktif (inversiyon yerine) örnek vorteks ile elde edilebilir santrifugasyonu ve kullanımı takip etmektedir. Üçüncü olarak, bir DNA ekstraksiyon işleminden sonra, DNA, uzun süreli (örneğin,&gt; iki hafta) muhafaza edilebilir. Bu mikrosantrifüj (örneğin, 2 dakika süreyle 4 ° C&#39;de 3,000-13,000 g) yeni tüplere süpernatantlar aktarabilir ve -80 ° C&#39;de saklayın kullanılarak çözelti santrifüj önerilir. Saklı ekstre genotipleme için kullanılacak olduğunda, kısa bir süre için, çözüldükten sonra numune santrifüj ve süpernatant kullanın. Nöronal kültürler Protokolde bir diğer önemli özelliği, düşük plaka yoğunluğunda nöron hücreleri oluşturmak için bir glial besleyici tabaka kullanılmasıdır. Tipik haliyle, memeli beyin nöronlarının birincil kültürlerinde, hücreler, bir glia olmaksızın kaplanmış lamelleri, nispeten yüksek bir yoğunluk ile kaplanırl besleyici tabakası (örneğin, 31-39). Nöronların kaplama yoğunluğu, bu yöntem kullanılarak azaltıldığı zaman, daha önce rapor edildiği gibi 40-42, gliyal tabakanın ilk olmaması muhtemelen zayıf glial için, kötü nöronal büyüme ve dendritik uzantı (Şekil 8-10 levhalar, B, C) ​​yol açar Büyüme 43,44. Başarılı, düşük yoğunluklu nöronal kültürler yöntemden en az üç ana türleri tarafından üretilebilir. Bir yaklaşımda, Neuro temelli vasat bir kültür ortamı olarak kullanılır. Bu glial besleyici bir tabaka yokluğunda kültür nöronları için mümkün kılar, ve düşük yoğunluklu nöronal kültürler 45,46 için kullanılabilir. Ikinci bir yöntem (&#39;Banker tipi&#39; ve modifikasyonu) ise, gliyal hücreler, aynı kuyu nöronların birlikte kültürlenir ama fiziksel olarak ayrılır. Bu bağlamda glial hücreler doğrudan temas etmeden nöronlara &#39;trofik destek&#39; sağlamak1,41,42,47-49. Üçüncü bir yaklaşımda, nöronlar nöronal büyüme (örneğin, 50-53) (Şekil 8-10) destekleyen bir önceden belirlenmiş glial besleyici tabaka ile kaplanmıştır. Spesifik olarak, fare beyin nöronları fareler 8,34,54 veya sıçanlar 41,55,56 hazırlanabilir glial besleyici bir tabaka ile kaplanmıştır. Biz Neurobasal Orta nöronal hayatta 57 etkileyebilir çünkü, astrositik glial hücreler nöronal fonksiyonlar 8,58 düzenlenmesinde esas olacak, düşük yoğunluklu kültürüne üç yaklaşımın son tercih, ve nöronlar ve glial hücreler arasındaki fiziksel temas olabilir Önemli. Fare ve sıçan glial hücrelerin kültürlenmesi için prosedürler 59,60 benzer, ama fare glial hücreler genel fare daha hızlı in vitro büyüme karşılamak için hafifçe olarak var. sıçan hücre kültürü için prosedürler 61-63 modifiye edildi. Bir glial besleyici laye kullanımıDüşük yoğunluklu nöronal kültürler için r, 1 (gerektiğinde, hızlı genotipleme yerine pups &#39;doğum ve yeni doğan ölümleri ya da kültür penceresinin sonunda arasındaki dönemde nöronların edilene besleyici tabakanın genotip eşleşmesi için kolaylaştırır -2 doğum sonrası gün). Bir beyin (örn, norepinefrin-salan odağı coeruleus ve dopamin-salgılatıcı substantia nigra) küçük çekirdeklerin kültür nöronlar çalıştığında glial besleyici bir tabaka Düşük yoğunluklu kültürü de önemli bir yöntemdir. Bu çekirdekler nöron yalnızca az sayıda içeren ve kaçınılmaz olarak, düşük yoğunluklu kültürleri 64-67 verim olacaktır. Birincil kültüründe, hipokampus, serebral korteks, motor bölgesi ve farelerin striatum CA3-CA1 bölgesinden laboratuvarımızda hazırlandı. Aynı prosedürler, örneğin bütün hipokamp (dahil için, diğer beyin bölgeleri temsil eden nöron hücreleri hazırlamak için kullanılabilirdentat girus) ve bütün serebral korteks uding. Hipokampus ve locus coeruleus gibi beyin bölgelerinde sıçan nöron sıçan glial besleyici tabaka ile, benzer bir şekilde kültürlenmiştir. Bu kültürlenmiş nöronlar genellikle deney amacına bağlı olarak kültür tam yaş, in vitro 1-4 hafta kullanılır. Bu glial besleyici bir tabaka üzerinde kültüre bazı nöronlar fazla 10 hafta 34,68 hayatta olabilir not olduğunu. Düşük yoğunluklu nöronal kültürler potansiyel bir sorun, nöronal özellikleri, yüksek yoğunluklu kültürlerinde veya yerinde nöronlarda daha farklı olabilmesidir. Bu sistemlerin karşılaştırılması gibi nöronal yoğunluk, nöronlardan salgılanan çözünür faktörler, nöron-to-nöron teması, ve glial-nöronal etkileşimleri gibi birçok faktörün, nasıl etkilendiği nöronal gelişim ve olgunlaşma incelemek için ilginç bir fırsat sağlar. Özet olarak, tattooing-tabanlı fare etiketleme uzun ömürlü, Genotipleme yöntemi hızlı ve kültür yöntemi, düşük yoğunlukta fare nöronları kaplama sağlar. Burada açıklanan protokol diğer genetik mutasyonlar barındıran diğer hayvan türlerinin kendi bütünlüğü içinde uygulanabilir. Ayrıca, protokol tek tek adımları, başka amaçlar için de kullanılabilir. Böylece protokol deneyci &#39;ihtiyaçlarına dayalı uygulamalar geniş bir yelpazede kullanılabilir.

Genetik hastalıkların kemirgen modelleri, normal protein ve nükleik asit, aynı zamanda, bu kusurların patofizyolojik fizyolojik işlevleri açısından yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Örnekler önemli hücresel fonksiyonlara yer alan proteinleri eksikliği olan fareler, aynı zamanda, Alzheimer hastalığı gibi hastalıkların fare modelleri yer alır. Ancak, bazı genetik manipülasyonlar kısa bir süre yenidoğan öldürücülüğü veya doğumdan sonra birkaç gün yol açabilir. Bu gibi durumlarda, birincil hücre kültürleri, canlı hücrelerin ölümünden önce embriyonik veya neonatal yavrular elde edilebilir, çünkü önemli bir araç olup, bu in vitro en az birkaç hafta muhafaza edilebilir, ve bu süre içinde, erken nöronal gelişimi ile takip edilebilir , biyokimyasal, fonksiyonel ve morfolojik deneyler. Birincil kültürler için, bu düşük yoğunluklu nöronlar plaka için yararlı olabilir; Bu bireysel somata, dendrit, akson milleri ve sinir TERMI görselleştirmek mümkün kılaryüksek uzaysal çözünürlükte rken,. Bununla birlikte, düşük yoğunlukta nöron sağkalım ve farklılaşma, tipik olarak bir glial besleyici tabaka kaplama gerektirir, ko-kültür glia 1 şartlandırılmış fiziksel bunlarla temas üzerine ya da ortam içinde kültürlenen yokluğunda glial hücreler. Glial besleyici katmanlar üzerinde düşük-yoğunluklu nöronal kültürlerin kurulması önceden hızlı ve güvenilir genotipleme bağlı olabilir - bir kaç gün aksine bir kaç saat içinde. Nöronal genotip daha önceden hazırlanmış bir glial besleyici tabakanın edilene uyumlu olması gerekir, hız özellikle önemlidir. Daha pratik bir örnek olarak, genotip arasında yavrular bir deney etkinliğini optimize etmek için, oluşturma kültürlerinde kullanmadan karar vermek için gerekli olabilir. Burada önceki yayınlarda 2-6 hızlı, basitleştirilmiş ve güvenilir bir fare genotip için kullanılır olmuştur çalışma protokolü göstermektedir. Fare kuyrukları veBir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılır. Bu protokol, doku nükleik asitlerin tek aşamalı ekstraksiyon ve (&#39;durdurma çözeltisi&#39;), bir nükleik asit saflaştırma adımı veya bir sonlandırma tamponu kullanılmasını gerektirmez. Bu genotipleme yönteminin güvenilirliği farkları örneklerin başlangıç ​​miktarı, hayvanların yaş ve PCR amplikonlarının uzunluğuna göre sokulduğunda bir dizi test sonuçlarını gösteren açıklanmaktadır. Bu kit otomatik çıkarma ve güvenilirlik avantajlar sunuyor. Kapsamlı olma uğruna, genotip farelerin uzun vadeli belirlenmesi için dövme kullanımı da gösterilmiştir. Dövme (epidermisin altında) derinin dermiş için dövme mürekkep uygulanarak elde edilir 7. Bir prosedür dövmeler gibi kuyrukları ve ayak gibi vücudun diğer bölgelerine uygulanabilir olmasına rağmen, yeni doğan ya da 1 gün eski farelerin pençe yastıkları dövme için tarif edilir ve Anim içinHer yaştan als. Buna ek olarak, yöntemler, glial besleyici tabakalarının 2,8 farklı optimize hazırlanması göre, bir düşük yoğunlukta fare nöronlar kaplama ve kültür olması gerekmektedir. (; P.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 gen TOR1A bir mutasyon nedeniyle otozomal dominant hareket bozukluğu - Biz miras nörolojik bozukluk DYT1 distoni bir genetik fare modeli kullanın. Protein açılımı, protein kompleksi demontaj, membran kaçakçılığı ve vezikül füzyon: kodlanan protein, Torsina, üyeleri genellikle, hastabakıcı gibi işlevleri yerine yardımcı (AAA +) proteinlerin ailesi, &quot;çeşitli hücresel faaliyetler ile ilgili ATPazların&quot; aittir 10-13. Mutasyon glutamik asit için bir kodonun bir çerçeve içi silme ile sonuçlanır, ve erken başlangıçlı genel izole distoni &#39;14,15 ortaya konulmasına neden olur. Bununla birlikte, yolBu bozukluk sorumlu ophysiological mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır kalır. Bir knock-fare modelinde, mutant alel Tor1a AE olarak, burada bahsedilen Tor1a tm2Wtd vardır. Heterozigot AE-Torsina knock-farelerin DYT1 distoni ile canlı ve genetik taklit insan hastalar, oysa homozigot knock-fareler genetik kökenli 18 etkilenen doğum sonrası ölüm gecikme ile, doğumdan 16,17 sonra ölürler. homozigot knock-farelerin erken ölüm hayvanların genotipleme ve nöronal kültürlerin kurulması hem hızla tamamlanmasını gerektirmektedir. Genotipleme başka örnek olarak, Tfap2a (transkripsiyon faktörü, AP-2α, arttırıcı protein 2α bağlanma geçirmek için) kullanılır. Bu gen tarafından kodlanan bir protein, proliferasyon, diferansiyasyon, hayatta kalma ve apoptoz 19 gibi çok sayıda hücresel işlemleri düzenleyen önemlidir.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS - tattooing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Machine Cleanser</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NMCR3</td><td>This is used to clean the needles and the holder after tattooing.</td></tr><tr><td>Machine Drying Agent</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NDAR4</td><td>This is used to dry the needles and holder after cleaning.</td></tr><tr><td>Neonate Tattoo Black Pigment</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NBP01</td><td></td></tr><tr><td>Skin Prep Applicator</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSPA1</td><td>Q-tip.</td></tr><tr><td>Skin Prep solution</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NSP01</td><td>This reagent delivers a thin layer of oil that enhances the efficiency of tattooing and prevents tattoo fading, by (information from vendor): 1) preventing non-tattooed skin from being stained temporarily, thereby allowing the quality of a paw pad tattoo to be easily evaluated before the pup is returned to its home cage &amp;ndash; the stained skin surface can be confused with the tattooed skin, 2) reducing skin damage during tattooing &amp;ndash; softening the skin and lubricating the needle will help the needle penetrate the skin without causing skin damage, and 3) preventing molecular oxygen from entering the skin, thereby reducing inflammatory responses to reactive oxygen species that can be generated.</td></tr><tr><td>REAGENTS - genotyping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZ Fast Tissue/Tail PCR Genotyping Kit (Strip Tube Format)</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td></td></tr><tr><td>2X PCR Ready Mix II</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>A red, loading dye for electrophoresis is included in the 2X PCR Ready Mix solution.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution A</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td></tr><tr><td>Tissue Lysis Solution B</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>G2001-100</td><td>Prepare DNA Extraction Solution by mixing 20 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution A and 180 &amp;micro;l of Tissue Lysis Solution B per specimen.</td></tr><tr><td>Acetic acid, glacial</td><td>VWR</td><td>BDH 3092</td><td></td></tr><tr><td>Agarose optimized grade, molecular biology grade</td><td>rpi</td><td>A20090-500&amp;nbsp;</td><td>We use 2% agarose gels in TAE buffer containing the SYBR Safe DNA gel stain (diluted 10,000-fold) or ethidium bromide (0.5 &amp;micro;g/ml gel volume).</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Aerosol-Free, 0.1-10 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG104-96RS&amp;nbsp;</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 0.5-20 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2020-RS</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Filtered Pipet Tips, Premium Fit Filter Tips, 1-200 &amp;micro;l</td><td>Dot Scientific Inc</td><td>UG2812-RS</td><td>Use pipette tips that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. For all steps involving DNA, use filtered pipette tips to avoid cross-contamination.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 100 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1001</td><td>We use either of these three molecular weight markers.</td></tr><tr><td>Molecular weight marker, EZ DNA Even Ladders 1000 bp</td><td>EZ BioResearch LLC</td><td>L1010</td><td></td></tr><tr><td>Molecular weight marker, TrackIt, 100 bp DNA Ladder</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10488-058</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubes, 8-tube strips with individually attached dome top caps, natural, 0.2 ml&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2900</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase. An 8-tube strip is easy to handle and to group the specimens than individual tubes.</td></tr><tr><td>PCR tubes, Ultraflux Individual&amp;nbsp;</td><td>rpi</td><td>145660</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td></tr><tr><td>Seal-Rite 0.5 ml microcentrifuge tube, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0000</td><td>Use tubes that are sterile and free of DNA, RNase and DNase.</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA gel stain * 10,000x concentration in DMSO</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>rpi</td><td>T60040-1000</td><td></td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tor1a gene in &amp;Delta;E-torsinA knock-in mice</td><td></td><td></td><td>5&#039;-AGT CTG TGG CTG GCT CTC CC-3&#039; (forward) and 5&#039;-CCT CAG GCT GCT CAC AAC CAC-3&#039; (reverse) (reference 18). These primers were used at a final concentration of 1.0 ng/&amp;micro;l (~0.16 &amp;micro;M) (reference 2).</td></tr><tr><td>Primers for amplifying Tfap2a gene in wild-type mice</td><td></td><td></td><td>5&#039;-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3&#039; (forward), 5&#039;-CGT GTG GCT GTT GGG GTT GTT GCT GAG GTA-3&#039; (reverse) for the 498-bp amplicon, 5&#039;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#039; (forward), 5&#039;-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3&#039; (reverse) for the 983-bp amplicon, and 5&#039;-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3&#039; (forward), 5&#039;-ACA GTG TAG TAA GGC AAA GCA AGG AG-3&#039; (reverse) for the 1990-bp amplicon. These primers are used at 0.5 &amp;micro;M.</td></tr><tr><td>REAGENTS - cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Fluoro-2&amp;prime;-deoxyuridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503-100MG</td><td>See comments section of uridine for more information.</td></tr><tr><td>B-27 supplement</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dishes 35 x 10 mm Dishes, Tissue Culture-treated</td><td>BD falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, T25, Tissue Culture-treated, Canted-neck, plug-seal cap, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Growth Area, 70 ml</td><td>BD falcon</td><td>353082</td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Flasks, T75, Tissue Culture-treated, Canted-neck, vented cap, 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Growth Area, 250 ml</td><td>BD falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Conical Tube, polypropylene, 15 ml</td><td>BD falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Countess (cell number counter) chamber slides</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine &amp;beta;-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6645-100mg</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose (Dextrose) anhydrous, SigmaUltra, 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Dish, Petri glass 100 x 15 mm</td><td>Pyrex</td><td>3160-101</td><td></td></tr><tr><td>Distilled water</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>15230-147</td><td></td></tr><tr><td>DNase Type II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-200KU</td><td>Stock solution is prepared at 1,500 units/20 &amp;mu;l = 75,000 units/ml in distilled water.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, GlutaMAX, pyruvate</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10569-010, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 &amp;micro;m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fast PES Filter Unit, 500 ml, 90 mm diameter membrane, 0.2 &amp;micro;m Pore Size</td><td>Nalgene</td><td>569-0020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 12 mm Round, thickness 0.09&amp;ndash;0.12 mm, No. 0</td><td>Carolina</td><td>633017</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salts</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2387-10X</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, &amp;ge;99.5% (titration)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid, 37%, A.C.S reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148-100 ML</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5500-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;(7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O), BioUltra, &amp;ge;99.5% (Fluka)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix solution, Phenol Red-Free</td><td>BD Biosciences</td><td>356237</td><td>This is the coating material for coverslips and flasks. 1) To prepare it, thaw the Matrigel Basement Membrane Matrix solution on ice, which usually takes ~1 day. Using a pre-cooled pipette, aliquot the thawed solution into pre-cooled T25 flasks on ice, and store the flasks at -20 &amp;deg;C. To prepare the working Matrigel solution, thaw the aliquotted Matrigel in a flask on ice, dilute 50-fold by adding pre-cooled MEM solution and keep the diluted solution at 4 &amp;deg;C. It is important to pre-cool all cultureware and media that come into contact with Matrigel, except during and after the coating of coverslips, to prevent it from prematurely forming a gel. 2) To coat the glass coverslips or culture flasks with Matrigel, apply the Matrigel solution to the surface. Before plating cells, it is important to completely dry up the surface. For this purpose, it might be helpful to aspirate Matrigel during the cellular centrifugation immediately before plating the cells and to allow enough time for drying.</td></tr><tr><td>Minimum Essential Medium (MEM)</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>MITO+ Serum Extender, 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355006</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 24-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Plates, Tissue Culture-treated 6-well plate</td><td>BD falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid</td><td>VWR</td><td>bdh 3044</td><td></td></tr><tr><td>NS (Neuronal Supplement) 21&amp;nbsp;</td><td>prepared in the lab</td><td></td><td>Source: reference 69</td></tr><tr><td>Pasteur pipets, 5 &amp;frac34;&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6A</td><td>Use this cotton-plugged 5 &amp;frac34;&amp;rdquo; Pasteur pipette for cellular trituration. Fire-polish the tip beforehand to smooth the cut surface and to reduce the internal diameter to 50-80% of the original. Too small a tip will disrupt the cells and reduce cell viability, but too large a tip will decrease the efficiency of trituration.</td></tr><tr><td>Pasteur pipets, 9&amp;rdquo;&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), SigmaUltra, &amp;ge;99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 2 ml</td><td>BD falcon</td><td>357507</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 5 ml&amp;nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 10 ml</td><td>BD falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 25 ml</td><td>BD falcon</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Serological pipet, 50 ml&amp;nbsp;</td><td>BD falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate (NaHCO3, Sodium hydrogen carbonate), SigmaUltra, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), SigmaUltra, &amp;ge;99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydroxide (NaOH), pellets, 99.998% trace metals basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>480878-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic heptahydrate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;(7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)), &amp;ge;99.99%, Aldrich</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431478-250G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose, SigmaUltra, &amp;ge;99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903-250G</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filter, sterile, 0.2 &amp;micro;m</td><td>Corning</td><td>431219</td><td></td></tr><tr><td>Syringe, 3 ml</td><td>BD falcon</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin, Holo, bovine plasma</td><td>Calbiochem</td><td>616420</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue stain, 0.4%</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>T10282</td><td>This is used for counting live/dead cells. Renew an old trypan blue solution if it is re-used many times (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; several times a week for several weeks), because it will form precipitates and result in erroneous readouts of cellular density.</td></tr><tr><td>Trypsin, type XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1005-5G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution, 0.25%&amp;nbsp;</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3003-5G</td><td>Stock solution is prepared at 50-mg 5-fluoro-2&#039;-deoxyuridine and 125 mg uridine in 25 ml DMEM (8.12 and 20.48 mM, respectively).</td></tr><tr><td>REAGENTS - immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibody, rabbit polyclonal anti-MAP2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5622</td><td></td></tr><tr><td>Antibody, mouse monoclonal anti-GFAP cocktail</td><td>Merck Millipore</td><td>NE1015</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - tattooing</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS</td><td>Animal Identification and Marking Systems, Inc.</td><td>NEO&amp;#8211;9</td><td>This Neonate Rodent Tattooing System is an electric system that works by rapidly moving 1- or 3-point tattoo needles vertically into the skin. Activate the tattoo machine once for approximately 0.5 sec, while the tattoo needle tips are kept perpendicular to the skin surface. We prefer three-needle tattooing to maximize the tattooed area, but one-needle tattooing is effective on narrower areas, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; the toes, or if fine mechanical control is necessary, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; when numbers are tattooed. Two rounds of tattooing at the slowest speed (setting &quot;1&quot; out of 3 steps) are typically sufficient to produce a visible and long-lasting tattoo of the paw pads.</td></tr><tr><td>EQUIPMENT - genotyping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis system, horizontal, Wide Mini&amp;#8211;Sub Cell GT</td><td>BIO&amp;#8211;RAD</td><td>170&amp;#8211;4405</td><td>Typical electrophoresis parameters are electrical field strength at 6 V/cm and 25 min duration for a 10 cm gel.</td></tr><tr><td>FluorChem 8800</td><td>ProteinSimple</td><td>FluorChem 8800</td><td></td></tr><tr><td>PCR, MJ Mini Thermal Cycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC-1148EDU</td><td>Our PCR reactions for the Tor1a gene in &amp;#916;E-torsinA knock-in mice are as follows: 1 cycle of denaturation at 94 &amp;#176;C for 3 min, 35 cycles of denaturation at 94 &amp;#176;C for 30 sec, annealing at 58 &amp;#176;C for 30 sec, extension at 72 &amp;#176;C for 2 min. This is followed by final extension at 72 &amp;#176;C for 10 min, and holding at 4 &amp;#176;C.</td></tr><tr><td>Power supply, PowerPac Basic</td><td>BIO-RAD</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT - cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated cell counter, Countess</td><td>GIBCO-Invitrogen</td><td>C10310</td><td>This automated cell counter separately measures the densities of live and dead cells (non stained and stained by trypan blue, respectively). It is important to know the optimal range of density measurements: the counter that we use has the highest accuracy in the range from 1 x 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; to 4 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt; cells/ml. If the measured cell density values fall outside the recommended range, adjust the resuspension volume appropriately.</td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet, Class II, Type A2</td><td>NUAIRE</td><td>NU-425-400</td><td>This hood is used for all cell culture procedures, except for brain dissection.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator, AutoFlow, Humidity Control Water Jacket</td><td>NUAIRE</td><td>NU-4850</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal Clean Bench</td><td>NUAIRE</td><td>NU-201-330</td><td>This clean bench is used for brain dissection (steps 3.1.1 and 3.1.2 of &quot;Brain Dissection and Cellular Dissociation)&quot;.</td></tr><tr><td>Orbit LS Low Speed Shaker</td><td>Labnet</td><td>S2030-LS-B</td><td></td></tr><tr><td>SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge</td><td>Fisher</td><td>46910 (centrifuge)/46922 (rotor)</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons

Memeli nöronların yapısının ve fonksiyonunun yüksek çözünürlüklü analizi genellikle nöronlarının birincil kültürleri analizi ve ardından tek tek hayvanların genotipleme gerektirir. Genotyped için yenidoğan fareler, hızlı genotiplendirmesi etiketleme, ve bu farelerin beyin nöronları düşük yoğunluklu kültürleri kurulması: Biz prosedürlerin bir dizi tarif. Bireysel fareler yetişkinlikte süren uzun süreli kimlik sağlar dövme, tarafından etiketlenir. Açıklanan protokol tarafından Genotipleme hızlı ve verimli ve iyi güvenilirlik ile nükleik asitin otomatik çıkarılması için izin verir. Bu yenidoğan letalitesinin muzdarip farelerde, örneğin geleneksel genotiplemede için yeterli zaman mevcut değildir şartlar altında yararlıdır. Primer nöronal kültürlerin yüksek uzaysal çözünürlükte görüntüleme deneyleri sağlayan düşük yoğunlukta, oluşturulur. Bu kültür yöntemi öncesinde nöronal kaplama için glial besleyici katmanlar hazırlanmasını gerektirir. protocol hareket bozukluğu DYT1 distoni (AE-Torsina knock-in fareleri) bir fare modelinde bütünüyle uygulanır ve nöronal kültürler, bu farelerin hipokampus, serebral korteks ve striatum hazırlanır. Bu protokol, diğer türlere ait hayvanlar için, hem de diğer genetik mutasyonlar olan farelere de uygulanabilir. Ayrıca, protokol bireysel bileşenleri izole alt projeler için kullanılabilir. Böylece bu protokol nörobilim hem de biyolojik ve tıbbi bilimlerin diğer alanlarında değil, sadece geniş bir uygulama, sahip olacaktır.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons at JoVE.com

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır.

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

rapid-genotyping-animals-followed-establishing-primary-cultures-brain

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.2K Görüntüleme.  University of Iowa Carver College of Medicine.  Biz etiketleme ve yenidoğan farelerin genotiplenmesi ve onlardan birincil nöronal kültürlerin üreten prosedürleri açıklar. genotyping, hızlı, verimli ve güvenilir, ve otomatik nükleik asit ekstraksiyon için izin verir. Bu neonatally öldürücü fareler ve genotipleme önce tamamlanmasını gerektirmektedir kültürleri için özellikle yararlıdır. 

Video: Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Bir Co-kültür Sistemde nöronal bağlantıları Oluşumunda değerlendirilmesi için bir optogenetic Yaklaşım

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Gelişim Biyolojisi

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

In utero Elektroporasyon Kortikal nöronlar Altküme Gen Fonksiyonu Öğrenmenin İlköğretim Nöronal Kültür takip

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Nörobilim

Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, many protocols for differentiating hiPSCs into neurons have been developed. However, these protocols are often slow with high variability, low reproducibility, and low efficiency. In addition, the neurons obtained with these protocols are often immature and lack adequate functional activity both at the single-cell and network levels unless the neurons are cultured for several months. Partially due to these limitations, the functional properties of hiPSC-derived neuronal networks are still not well characterized. Here, we adapt a recently published protocol that describes production of human neurons from hiPSCs by forced expression of the transcription factor neurogenin-212. This protocol is rapid (yielding mature neurons within 3 weeks) and efficient, with nearly 100% conversion efficiency of transduced cells (&#62;95% of DAPI-positive cells are MAP2 positive). Furthermore, the protocol yields a homogeneous population of excitatory neurons that would allow the investigation of cell-type specific contributions to neurological disorders. We modified the original protocol by generating stably transduced hiPSC cells, giving us explicit control over the total number of neurons. These cells are then used to generate hiPSC-derived neuronal networks on micro-electrode arrays. In this way, the spontaneous electrophysiological activity of hiPSC-derived neuronal networks can be measured and characterized, while retaining interexperimental consistency in terms of cell density. The presented protocol is broadly applicable, especially for mechanistic and pharmacological studies on human neuronal networks.

We modify and implement a previously published protocol describing the rapid, reproducible, and efficient differentiation of human&#160;induced&#160;Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) into excitatory cortical neurons12. Specifically, our modification allows for control of neuronal cell density and use on micro-electrode arrays to measure electrophysiological properties at the network level.

Mikro-elektrot dizileri Ağ Aktivite Ölçüm uyarılmış pluripotent kök hücrelerin Rapid Nöronal Farklılaşma

Neurons derived from human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) provide a promising new tool for studying neurological disorders. In the past decade, ...

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Microglia account for approximately 12% of the total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered the major cell types of the nervous system, microglia play a significant role in normal brain physiology by monitoring tissue for debris and pathogens and maintaining homeostasis in the parenchyma via phagocytic activity 1,2. Microglia are activated during a number of injury and disease conditions, including neurodegenerative disease, traumatic brain injury, and nervous system infection 3. Under these activating conditions, microglia increase their phagocytic activity, undergo morpohological and proliferative change, and actively secrete reactive oxygen and nitrogen species, pro-inflammatory chemokines and cytokines, often activating a paracrine or autocrine loop 4-6. As these microglial responses contribute to disease pathogenesis in neurological conditions, research focused on microglia is warranted.
	Due to the cellular heterogeneity of the brain, it is technically difficult to obtain sufficient microglial sample material with high purity during in vivo experiments. Current research on the neuroprotective and neurotoxic functions of microglia require a routine technical method to consistently generate pure and healthy microglia with sufficient yield for study. We present, in text and video, a protocol to isolate pure primary microglia from mixed glia cultures for a variety of downstream applications. Briefly, this technique utilizes dissociated brain tissue from neonatal rat pups to produce mixed glial cell cultures. After the mixed glial cultures reach confluency, primary microglia are mechanically isolated from the culture by a brief duration of shaking. The microglia are then plated at high purity for experimental study.
	The principle and protocol of this methodology have been described in the literature 7,8. Additionally, alternate methodologies to isolate primary microglia are well described 9-12. Homogenized brain tissue may be separated by density gradient centrifugation to yield primary microglia 12. However, the centrifugation is of moderate length (45 min) and may cause cellular damage and activation, as well as, cause enriched microglia and other cellular populations. Another protocol has been utilized to isolate primary microglia in a variety of organisms by prolonged (16 hr) shaking while in culture 9-11. After shaking, the media supernatant is centrifuged to isolate microglia. This longer two-step isolation method may also perturb microglial function and activation. We chiefly utilize the following microglia isolation protocol in our laboratory for a number of reasons: (1) primary microglia simulate in vivo biology more faithfully than immortalized rodent microglia cell lines, (2) nominal mechanical disruption minimizes potential cellular dysfunction or activation, and (3) sufficient yield can be obtained without passage of the mixed glial cell cultures.
	It is important to note that this protocol uses brain tissue from neonatal rat pups to isolate microglia and that using older rats to isolate microglia can significantly impact the yield, activation status, and functional properties of isolated microglia. There is evidence that aging is linked with microglia dysfunction, increased neuroinflammation and neurodegenerative pathologies, so previous studies have used ex vivo adult microglia to better understand the role of microglia in neurodegenerative diseases where aging is important parameter. However, ex vivo microglia cannot be kept in culture for prolonged periods of time. Therefore, while this protocol extends the life of primary microglia in culture, it should be noted that the microglia behave differently from adult microglia and in vitro studies should be carefully considered when translated to an in vivo setting.

Isolating primary microglia from the cellular heterogeneity of the brain is essential to investigate their role in both physiological and pathological conditions. This protocol describes a mechanical isolation and mixed cell culture technique that provides high yield and high purity, viable primary microglial cells for in vitro study and downstream applications.

Yenidoğan Rat Beyin Dokusu Karışık Glial Hücre Kültürleri Primer mikroglia İzolasyonu

Microglia account for approximately 12% of the  total cellular population in the mammalian brain. While neurons and astrocytes are considered  the major ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Primary Neuron Culture System for the Study of Herpes Simplex Virus Latency and Reactivation

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent reactivation events that ensure transmission and contribute to clinical disease. Current antivirals do not impact the latent reservoir and there are no vaccines. While the molecular details of lytic replication are well-characterized, mechanisms controlling latency in neurons remain elusive. Our present understanding of latency is derived from in vivo studies using small animal models, which have been indispensable for defining viral gene requirements and the role of immune responses. However, it is impossible to distinguish specific effects on the virus-neuron relationship from more general consequences of infection mediated by immune or non-neuronal support cells in live animals. In addition, animal experimentation is costly, time-consuming, and limited in terms of available options for manipulating host processes. To overcome these limitations, a neuron-only system is desperately needed that reproduces the in vivo characteristics of latency and reactivation but offers the benefits of tissue culture in terms of homogeneity and accessibility.
Here we present an in vitro model utilizing cultured primary sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG) (Figure 1) to study HSV-1 latency and reactivation that fits most if not all of the desired criteria. After eliminating non-neuronal cells, near-homogeneous TrkA+ neuron cultures are infected with HSV-1 in the presence of acyclovir (ACV) to suppress lytic replication. Following ACV removal, non-productive HSV-1 infections that faithfully exhibit accepted hallmarks of latency are efficiently established. Notably, lytic mRNAs, proteins, and infectious virus become undetectable, even in the absence of selection, but latency-associated transcript (LAT) expression persists in neuronal nuclei. Viral genomes are maintained at an average copy number of 25 per neuron and can be induced to productively replicate by interfering with PI3-Kinase / Akt signaling or the simple withdrawal of nerve growth factor1. A recombinant HSV-1 encoding EGFP fused to the viral lytic protein Us11 provides a functional, real-time marker for replication resulting from reactivation that is readily quantified. In addition to chemical treatments, genetic methodologies such as RNA-interference or gene delivery via lentiviral vectors can be successfully applied to the system permitting mechanistic studies that are very difficult, if not impossible, in animals. In summary, the SCG-based HSV-1 latency / reactivation system provides a powerful, necessary tool to unravel the molecular mechanisms controlling HSV1 latency and reactivation in neurons, a long standing puzzle in virology whose solution may offer fresh insights into developing new therapies that target the latent herpesvirus reservoir.

The protocol describes an efficient and reproducible model system to study herpes simplex virus type 1 (HSV-1) latency and reactivation. The assay employs homogenous sympathetic neuron cultures and allows for the molecular dissection of virus-neuron interactions using a variety of tools including RNA interference and expression of recombinant proteins.

Herpes Çalışmaları A Primer Nöron Kültür Sistem Virüs gecikmesi ve Yeniden Simplex

Herpes simplex virus type-1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. This latent reservoir is the source of recurrent ...

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

Genetiği Tanımlı Nöral Devre arasında Tracing Viral

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

 CNS Etkileşim Çalışmaları için Primer Mikroglia ve Nöron Ko-Kültür Protokolü

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS homeostasis. They are a major population of immune cells associated with CNS disease activity, adopting&#160;reactive phenotypes that potentially contribute to neuronal injury during chronic neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis (MS). The distinct mechanisms by which microglia regulate neuronal function and survival during health and disease remain limited due to challenges in resolving the complex in vivo interactions between microglia, neurons, and other CNS environmental factors. Thus, the in vitro approach of co-culturing microglia and neurons remains a valuable tool for studying microglia-neuronal interactions. Here, we present a protocol to generate and co-culture primary microglia and neurons from mice. Specifically, microglia were isolated after 9-10 days in vitro from a mixed glia culture established from brain homogenates derived from neonatal mice between post-natal days 0-2. Neuronal cells were isolated from brain cortices of mouse embryos between embryonic days 16-18. After 4-5 days in vitro, neuronal cells were seeded in 96-well plates, followed by the addition of microglia to form the co-culture. Careful timing is critical for this protocol as both cell types need to reach experimental maturity to establish the co-culture. Overall, this co-culture can be useful for studying microglia-neuron interactions and can provide multiple readouts, including immunofluorescence microscopy, live imaging, as well as RNA and protein assays.

Yazar Spotlight: Hastalık Koşullarında Mikroglia-Nöronal Etkileşimleri İncelemek için İn Vitro Ko-Kültür Modeli

This protocol describes a microglia-neuronal co-culture established from primary neuronal cells isolated from mouse embryos at embryonic days 15-16 and primary microglia generated from the brains of neonatal mice at post-natal days 1-2.