Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) ve KFO 146 (MF) tarafından desteklenmiştir, Savunma hibe PC DOD Bölümü 040972 (MO) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü RO1&#39;e CA108835 verir , RO1 Ai44129 (Jps)

HLA-A2-lg Tabanlı KaAPC 1. Üretimi <ol><li> Steril borat tamponu hazırlayın. Su içinde borik asit içindeki bir 0.1 M bir solüsyon yapmak ve 7.0 pH değerinin ayarlanması. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril boncuk yıkama tamponu hazırlayın. Magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanılır. % 3 nihai konsantrasyon, insan AB serumu ekleyin. 2 mM nihai konsantrasyon için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin. % 0.01 nihai konsantrasyona sodyum azid (NaN3) ekleyin. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril içine stoktan epoksi boncuklar (yaklaşık 100 x 10 6 boncuk) 250 ul aktarın, cam tüpe vida. </li><li> Borat tampon 250 ul ilave edin. </li><li> Bir mıknatıs cam şişeyi koyun ve boncuk 2 dakika uymak edelim; aspirat tampon ve mıknatıstan cam şişeyi çıkarın. </li><li> 1 ml borat tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 0.018 mcg 550 ul içine süspanse boncuklar/ Ml HLA-A2-lg ve 3.64 ug / ml anti-insan CD95 mAb (klon CH11) ve hafifçe sallanarak karıştırılır. (Ek bilgi için tartışma bölümüne bakınız.) </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, ucuna bir döndürücü ucunda cam tüpe inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> 2 dakika için bir mıknatıs üzerine cam şişe yerleştirin ve &quot;KaAPC yükleme çözüm&quot; aspire; , mıknatıs cam flakonun çıkarılması boncuk yıkama tamponu 1 ml ekleyin ve sallayarak dikkatle tekrar süspansiyon. </li><li> Adımı yineleyin 1.10 iki kez. </li><li> 1 mi boncuk yıkama tampon maddesi içinde, 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde cam tüpe inkübe edin. Bu noktada, tüm bağlanma yerleri artan protein boncuk yıkama tamponu içinde bulunan insan AB serumu ile bloke edilir. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> Yer cam 2 dakika ve aspire boncuk yıkama tamponu için bir mıknatıs üzerine flakon; mıknatıstan cam tüpe çıkarın ve 1 ml PBS ile bir çözüm yerine. </li></ol> 2. Kalite Kontrol, Peptide Yükleme, Wkülleme, Depolama ve KaAPC Kararlılık <ol><li> Bir FACS tüpü içine, 1.5 x 10 5 KaAPC aktarın ve FACS yıkama tamponu 1 ml ile yıkayın. </li><li> Tampon ve tespiti için, ve anti-fare IgM FITC (klon R6-60.2 1 ul (HLA-A2-Ig Fc bölümü tespiti için), anti-fare IgG1 PE 1 ul yıkama 100 ul FACS içinde süspanse boncuk anti-insan CD95 mAb). </li><li> Tampon ve akış sitometrisi ile lekeleme yıkama oku 250 ul FACS 1 ml FACS yıkama tamponu ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Protokol bölümünde belirtildiği gibi yapılan bir KaAPC toplu Şekil 1. QC lekesi. Lekelenmesi anti-insan CD95 ise, 2. HLA-A2-lg bir anti-fare-PE IgG1 mAb protokolü kullanılarak tespit edilmiştir bölümünde tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (anti-Fas) (se protokolüne bir anti-fare-FITC ile IgM mAb ile saptandıavranış 2.2) (mavi çizgi). Dolgulu siyah grafikler, sırasıyla anti-fare-PE IgG1 mAb ya da anti-fare FITC-lgM mAb ile lekelenmiş, boş boncuklar temsil eder. Sağ üst köşedeki sayılar ortalama floresan yoğunluğu (MFI) gösterir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> Yeni bir steril cam şişenin içine peptid yükleme devri 20 x 10 6 KaAPC için, 2 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin, 5 ug peptit ile 500 ul taze PBS içine aspire PBS ve tekrar süspansiyon boncuk (Unutmayın, sadece HLA-A2 kısıtlı peptidler olacak dimer üzerine bağlanan!). </li><li> Mağaza HLA-A2-lg dimer üzerine yeterli bir peptit yüklenmesine olanak sağlamak üzere, en az 3 gün süre ile, kullanılana kadar 4 ° C &#39;de KaAPC yüklendi. </li><li> Kullanımdan hemen önce, 1,14 belirtildiği gibi KaAPC yüklenen peptidi yıkama; Bu adımı en az 6x tekrarlayın. NOT: Bu ücretsiz peptid t sahip olmasını sağlamak için önemli bir adımdıro yalancı pozitif öldürme sonuçları önlemek için tamamen çıkarılmalıdır; artık serbest peptid antijene özgü T hücre kültürlerinin 9 apoptosisi teşvik ettiği gösterilmiştir. Çözünebilir peptid etkisini ortadan kaldırabilmek için, yüklenen peptid süpernatant kontrol örnekleri çalıştırmak ve KaAPC (3.8 bakınız) yıkandı. </li><li> Hemasitometre kullanarak boncuk saymak ve peptit ve konsantrasyon tarih, adı ile etiketleyin. NOT: Yüklü KaAPC en az bir ay boyunca 4 ° C &#39;de işlevsel kalır. Bir ay sonra, aynı peptid ile yeniden yükleme KaAPC bir yıla kadar kullanılmasını sağlar. </li></ol> 3. KaAPC İn Vitro Öldürme Deneyi <ol><li> Ko-kültür ortamı hazırlayın. Ve% 3 otolog plazma verici (laboratuarda yapılan 6) 3% T hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş tam RPMI ortamı hazırlayın. Donör otolog plazma mevcut değilse, ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu kullanın. </li><li> AnnexinV bağlama tamponu hazırlanmasını hazırlayın. 8.12 g sodyum klorür (NaCI) ve 0.12 g kireci çözündürün990 mi ile kombine edilmiştir 2&#39;ye amonyum klorür (CaCl2), 10 ml 1 M HEPES tamponu O.Add. </li><li> Insan antijen-spesifik T hücrelerini oluşturur. (Ayrıntılı bir protokol için yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanan bir önceki yayını 7 bakınız). Bu peptid özgünlüğü tetramer boyama ile saptandığı haliyle en azından&gt;% 75 olduğundan emin olun. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca KaAPC 1 oranında, 37 ° C de Her numune için, 2 x 10 5 antijene spesifik T hücre / göz (96 yuvarlak tabanlı plaka içindeki), 1 ortak-kültür ortamı içinde 200 ul inkübe C ve% 5 CO2. </li><li> Hasat örnekler ve bir FACS tüpü içine transferi; 1 ml bağlayıcı tampon ile AnnexinV yıkama 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de spin AnnexinV bağlayıcı tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atmak </li><li> 1 ul AnnexinV FITC ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 5 ul 7-AAD ile Leke örnekleri, 1 mi AnnexinV bağlama tamponu ile yıkama; , 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de dönme üst sıvı bir atın250 ul AnnexinV bağlama tamponu içinde tekrar süspansiyon d </li><li> Akış sitometresi örnekleri hemen okuyun. </li><li> KaAPC antijen spesifik öldürmeyi belirlemek için aşağıdaki örnekleri hazırlayın: T hücrelerinin sadece; + T hücreleri, çözünür anti-CD95; T hücreleri boşaltılmış KaAPC +; T hücreleri + olmayan soydaş peptid KaAPC yüklenir; T hücreleri, ortak kökenli + peptid KaAPC yüklenir; Ortak kökenli peptitin T hücreleri + yüzer KaAPC yüklendi. </li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> ., CMVpp65 spesifik T hücreleri (~% 80) 1 oranında, hasat edilmiş ve daha sonra AnnexinV ile boyanmıştır: Şekil 2. KaAPC öldürme deneyi bir Peptid 1 de 48 saat süre ile kültüre KaAPC ya da kontrol boncuk (HLA-A2-lg sadece boncuk) yüklendi edildi ve propidyum iyodür (PI). flow sitometri (bkz protokol bölüm 3.3-3.7) tarafından &quot;soydaş&quot; apopitozun olmak &quot;non-soydaş&quot; CMVpp65 ve yüklü boncuk atıfta içinMart-1 peptid ile yüklü reklamlar. Sayılar her arsa sol alt kadranda canlı T hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="9"><li> , Çapraz-deneyler yaparak, iki farklı özelliklerin antijene-özgü T hücrelerinin üretilmesi için. </li><li> Bundan başka, T hücre popülasyonunun heterojen T hücrelerinin antijene özgü bir eleme analizi ile eşzamanlı KaAPC antijene spesifik tükenmesinin-yeteneklerini değerlendirmek. (Ayrıntılı bir protokol için Schütz ark bakınız. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS ve MF ifşa hiçbir şey yok. NexImmune ve Johns Hopkins Üniversitesi, Dr arasında bir lisans anlaşması altında. Schneck ve Oelke bu makalede açıklanan aAPC ürünlerinin satışlarında Üniversitesi tarafından alınan lisanslı hisse hakkına sahiptir. Onlar da Üniversite politikası uyarınca belirli kısıtlamalara tabidir NexImmune stok sahibi. Dr Schneck şirket &quot;ler Yönetim Kurulu ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. Bu düzenlemenin koşulları faiz politikalarında ihtilafı uyarınca Johns Hopkins Üniversitesi tarafından yönetiliyor.

Protokolde en önemli nokta sinyali 1 (peptid-MHC) ve sinyal 2 (anti-Fas mAb) uygun oranının sağlamaktır. Biz sinyali 1 ve 2 için mükemmel oranını tanımlamak için yoğun titrasyon deneyleri var; nedeniyle HLA-A2 ile lg dimer ya da anti-Fas mAb konsantrasyonlarında çok az farklar varyasyonlar KaAPC işlevselliği de müdahale edebildiği de ortaya çıkmıştır. Böylece, hem sinyallerin yoğunluğunun her zaman kontrol edilmelidir ve her iki protein kalitesi genellikle bu ticari bir kaynaktan sipariş olsa bile test edilmelidir. Farklı tespit deneyleri, farklı konsantrasyonlarda neden olabilir Dahası, konsantrasyon her zaman aynı deneyi ile tespit edilir. HLA-A2-Ig işlevselliği, aynı zamanda, tam olmayan katlama ve / veya verimsiz peptit yüküne bozulabilir. Ayrıca dimer molekülleri proteinin işlevsel etkinliği üzerindeki etkisi olabilir, farklı derecelerde burada toplayabilir. Bu nedenle, actudimer ark miktarı değişebilir ve belirli fonksiyonel KaAPC üretilmesi için gerekli. Ayrıca, sinyal KaAPC anti Fas mAb indükleyici ölümü için ideal aralık son derece sıkı olduğu bulunmuştur. Bizim elimizde büyük miktarlarda 3.64 ug / ml &#39;nin altında miktarları, doza bağlı olarak, indirgenmiş öldürme aktivitesi ile sonuçlanırken mi, Fas pozitif T hücre spesifik olmayan öldürülmesine yol / 3.64 ug. Bu koşullar oldukça sıkı gibi ise de, bu ayrıntıları bir dikkat ve spesifik fonksiyonel KaAPC üretilmesiyle sonuçlanacaktır. Mevcut KaAPC fenotipi saf ya da dinlenme antijen-spesifik T hücrelerini hedefleyen antijene özel aktive edilmiş T hücreleri, ön deneylerde tükenmesi için işlevsel olduğunu da bu popülasyonlar, Fas düşürülmüş sentezlenmesine sahip antijen-özel apoptosis anlamlı endüksiyonunu gösterdi. Bu nedenle, bunları açmak yapmak Hareketsiz T hücreleri üzerinde Fas yukarı düzenlenmesini teşvik etmek için KaAPC üzerine ko-stimülatör bir sinyal ekleme olabilir tasavvurKaAPC için bir hedef haline. Bunun mümkün olduğu da her üç sinyal, dikkatli bir şekilde fonksiyonel bir KaAPC fenotip temin etmek için titre edilmesi gerekir. Bir biyo-uyumlu ya da biyo-bozunabilir matris, damak platformu ayarlanması in vivo uygulanabilirliği KaAPC arttıracaktır. Son zamanlarda, Shen ve ark. KaAPC -TRP2 11b, anti-Fas (klon Jo2) ve anti-His / H2-Kd konjüge 5 um lateks boncuklar kullanılarak in vivo kullanımı başarılı bildirmişlerdir. Bu yapay antijen sunan hücreler (aAPC) &#39;deki genel kavramı başarılı bir şekilde mil boyutlu parçacıklar 12 um büyüklükte transfer edilebilir ve bu işlevsellik parçacık geometrisine 13 etkisi olduğunu göstermek mümkün olmuştur. Bu yüzden, boyutu ve / veya gelecekteki KaAPC şekli değiştirilerek bir organa özgü otoimmün hastalıkların başarılı bir tedavisi için bir anahtar olabilir in vivo işlevselliği ve biyo-dağılımı üzerindeki etkisi mümkün olabilir tasarlar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC donör durumu ve ön arıtma bağımsızdır, zaman ve maliyet etkin bir yaklaşım &quot;raftan&quot; kullanımı kolay bir hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin önemli eksikliklerin üstesinden. KaAPC kişisel ya da parakrin öldürme sinyal hedefleri ve CTL&#39;nin sitolitik efektör fonksiyonlara duyarlı değildirler. KaAPC ilgili hastalık antijenin belirlenmesini gerektirir ve spesifik HLA tipi üzerinde de durulacaktır. Tip 1 diyabet için halen çeşitli uygun HLA-A2 ile kısıtlı antijenler birlikte, GvHH skleroz ve katları 2, i daha da artırmak ve uygulanabilirliğini genişletecektir moleküllerin yanı sıra, yeni otoimmün ilgili antijenlerin tanımlanmasını eden dimer ilave HLA sınıf gelişimini tespit edilmiştir KaAPC. Ayrıca tek bir aynı anda birden fazla antijenleri hedeflemek üzere farklı epitoplarına yönelik KaAPC kullanılarak düşünülebilir. Özetle, KaAPC bir için esnek bir platformdur teknolojiyi temsilantigene-özgü T hücresi kaybı. Onların &quot;lego benzeri&quot; yapısı örneğin genişletmek ve in vitro ve in vivo uygulanabilirliği ve bunların daha sonradan arttırabildiğini gibi çeşitli matrisler üzerinde PD1 veya izleme aracı olarak ek yardımcı-uyarıcı ya da inhibitör sinyalleri, yeni sinyalleri dahil sağlar. Bu yazıda KaAPC farklı özellikteki T hücresi bunların karışımlarından antijen-spesifik T hücrelerinin ortadan kaldırılması için, birinci kordon dayalı yaklaşımı oluşturmak için adım adım protokol mevcut. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. KaAPC antijen spesifik şekilde CTL ortadan kaldırmak veya 1 Fas + efektör-hafızalı CTL aktive PKH26-etiketlenmiş ve karıştırıldı aynı donörden alınan CMVpp65 özgü CTL PKH67 etiketli:. CMVpp65 KaAPC 1 oranında, ve ko-kültive 48 saat karıştırıldı. Kontrol kültürleri yüksüz KaAPC ya da 1 ug / ml ile muamele edildisuda çözünür, anti-Fas mAb (klon CH11). Canlı hücreler minimum kaybı muamele edilmemiş karışık CTL kültürlerinde (t karışımı) olarak tespit edilmiştir. T karışımı her CTL nüfus için orijinal FACS verileri gösterilmiştir. Önce her iki T hücre popülasyonlarının 10 ayrı yolluk tarafından yayınlanan apoptoz analizi yapıldı. Sol üst kadranda tasvir Numaraları toplam hücrelerin% temsil eder. Gösteren Şekil, üç bağımsız deneyin üzerinden, temsilci bir deneyden elde edilir. Bu araştırma aslında Blood yayınlandı. . Schütz, C. ve ark katil yapay antijen sunan hücreler: yeni bir strateji spesifik T hücreleri silmek için kan.. 2008, 111, 3546-52. Telif Amerikan Hematoloji Derneği. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Son yirmi yıl içinde çok fazla ilerleme otoimmün hastalıkların patojenik mekanizmasının anlaşılması yönünde gerçekleştirilen edilmiştir. Bununla birlikte, en yaygın tedavi yaklaşımları kortikosteroidler yanı sıra, purin analogları gibi bağışıklık bastırıcı ilaçlar, alkile edici maddeler ve kalsinörin inhibitörü 1 dayanmaktadır. Bu tür ilaçların kullanımı büyük ölçüde hastaların prognozu gelişmiş, henüz tedavi altta yatan immünolojik arıza tedavi sağlamaz. Ayrıca, hastalar enfeksiyonlara ve kanser gelişmesine karşı savunmasız hale gelir. Bu nedenle T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların ve allograft reddinin tedavisi için nihai hedefi özel olarak ise, aynı zamanda, el değmemiş ve immünolojik bozuklukları mücadele için yetkili kalan bağışıklık sistemini terk ederken neden olan T hücrelerinin sadece hastalık hedef etmektir. Kullanarak antijen-sunan hücreler (APC), periferal T hücresi tepkilerini bastırmak için bir tedavi olarak birinci kadar erken olarak nitelendirildiçeşitli gruplar tarafından 1970&#39;lerde. Daha sonra pek çok hücre tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir beri (Schütz&#39;ün ve ark. 2 gözden). Immunoregülatuar hücreleri otoimmünite, allogreft reddi ve kronik enfeksiyonların tedavisi için terapötik potansiyelini gösteren umut verici sonuçlar gösterdi FasL ifade katil-APC kullanarak Stratejileri. Ancak, sonuçta kendi klinik uygulanabilirliğini sınırlı FasL&#39;nin Killer-APC kullanan stratejileri ile önemli kısıtlamalar vardır; APC (i) üretimi veya izolasyonu zaman, işgücü ve maliyet yoğun olan, (ii) ikinci sitopeni bağlı bağışıklık bastırma şikayetçi olan hastalar, sınırlı miktarda ve hücrelerin kalitesi sağlar (iii) bu tür çok FasL sonuçlar olarak apoptozu teşvik edici sinyallerle yapılan kaplama ya da APC&#39;nin transdüksiyon Değişken fenotipleri ve (iv) Killer APC sonuç olarak terapötik potansiyelini azaltır T hücreleri efektör fonksiyonlarını sitotoksik duyarlıdır. Bu nedenle, belirli bir tekrarlanabilir katil APC fenoksi garanti etmek zordurin vivo T hücresi tepkilerinin, antijene özel modülasyonu için kullanılabilir türü. Katil APC 3-5 ve yapay antijen sunan hücreler (aAPC) ifade FasL ile daha önceki çalışmalara dayanarak 6,7 oto-reaktif T hücrelerinin antijen-belirgin önlenmesi ya da ortadan kaldırılması için bir tane bazlı yaklaşım (KaAPC) geliştirmiştir in vitro. KaAPC bir HLA-A2-lg dimer (sinyal 1) kovalent bir 4.5 um paramanyetik lateks boncuk bir yüzeyi üzerinde hareketsiz kılınmış bir anti-Fas mAb (apoptoz uyarıcı sinyali) oluşur. Bu antijen-spesifik şekilde birden fazla özgüllüklerinin T hücre kültürlerinden bir Fas / FasL aracılı antijen-spesifik T hücrelerinin tüketilmesi ve etkinleştirme indüklenen hücre ölümü (AICD) yolunun bağımsız olarak gerçekleştirilir. Hedeflenen T hücrelerinde doza bağlı apoptoz zaten 30 dakika 8 sonra hızla uyarılır. KaAPC kolayca kontrollü bir şekilde oluşturulabilir bir raf phenot kapalı tanımlandığı sağlanmasını gerektirmektedirype hem de hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin eksikliklerin üstesinden en. Sonuç olarak, T hücresi KaAPC spesifik tedavi stratejilerinin alanını ilerleyen T-hücresi kaynaklı otoimmün hastalıklar ve allograft reddinin tedavisi için büyük bir potansiyel gösterir.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 epoxybeads</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 magnet</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Screw top glass vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimer</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG1 PE</td><td>BD/Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-well Round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni yaklaşımlar gibi enfeksiyonlar veya maligniteler kontrol etmek için bir azaltılmış yeteneği gibi uzun vadede yan etkiler eşlik eder, bağışıklık sisteminin bastırılması ile, stratejileri çoğunlukla dayanır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar sadece hastalık aracılık hücreleri hedef ve sağlam kalan bağışıklık sistemini terk etmesini geliştirilmesi gerekmektedir. Geçtiğimiz on yıl içinde hücre bazlı immunoterapi çeşitli stratejiler T hücre aracılı bağışıklık tepkileri geliştirilmiştir modüle etmek. Bu yaklaşımlardan en çok tolerans uyarıcı, antijen sunan hücreler (APC) dayanmaktadır. Bununla birlikte, teknik olarak zor ve külfetli olmanın yanı sıra, bu tür yaklaşımlar, hücre bazlı bir tedavi edici kapasitesini sınırlar ve sitotoksik T hücresi tepkilerinin, son derece duyarlıdır. Burada yeniden bırakırken, patolojik T hücrelerinin tükenmesi sağlayan hücresel olmayan killer, yapay antijen sunan hücrelerin üretimi (KaAPC) için bir protokol mevcutisti bağışıklık sistemi bakir ve fonksiyonel. KaAPC bir antijen belirli bir tarz içinde istenmeyen T hücre yanıtını düzenleyerek, otoimmün hastalıkların ve allograft reddi tedavisinde bir potansiyele sahip hücresel immünoterapiye alternatif bir çözümdür.

Bu protokolün özellikleri hücre bazlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kaplama değişmez, aynı zamanda HLA-A2-Ig (1 sinyal) ve anti-Fas mAb (apoptoz sinyali) görüntüleyen bir KaAPC fenotip tanımlanmış kuşağı ya da transdüksiyon etkinliklerinin ve kolay bir üretim (Şekil 1) modüle edilebilir. Ayrıca, KaAPC, T hücrelerinin sitotoksik efektör fonksiyonlara duyarlı değildir ve bunların işlevselliği nitro manipülasyon öncesi ve sonrası otolog antijen sunan hücreler kalitesine bağlı değildir. KaAPC olmayan ortak kökenli KaAPC T hücrelerini (Şekil 2) tüketmek olmaz yüklü iken, ortak kökenli peptid ile yüklü olduğunda in vitro ortamda antijen-spesifik T hücrelerini tüketme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, KaAPC antijene özel bir şekilde T hücresi apoptosis. Daha sonra, farklı T hücresi SPE karışımından antijen-spesifik T hücrelerinin seçici tükenmesi için ikinci KaAPCsadece asgari sitotoksisite komşu T hücreleri sızması olduğunu gösteren cificities, (Şekil 3). Böylece, KaAPC otoimmün hastalıklar ve allograft tedavisi için potansiyel klinik uygulanabilirliği olan insan aktive antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro antijen ile spesifik azaltımı için mükemmel bir araç temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.7K Görüntüleme.  Johns Hopkins University.  Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim. 

Video: Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

Yönbağımlı polimer yapay antijen hücreleri CD8 + T Hücre aktivasyonu için sunma imalatı

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

Çevre

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Kanser Araştırmaları

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Yapay Antijen Hücre (AAPC) Aracılı Aktivasyon ve Doğal Öldürücü T hücreleri genişletilmesi Presenting

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of antigen-specific T cells, B) probe the dynamics of antigen-specific responses, C) understand how antigen-specific responses affect disease state such as autoimmunity, D) demystify heterogeneous responses for antigen-specific T cells, or E) utilize antigen-specific cells for therapy. The tool is based on a magnetic particle that we conjugate antigen-specific and T cell co-stimulatory signals, and that we term as artificial antigen presenting cells (aAPCs). Consequently, since the technology is simple to produce, it can easily be adopted by other laboratories; thus, our purpose here is to describe in detail the fabrication and subsequent use of the aAPCs. We explain how to attach antigen-specific and co-stimulatory signals to the aAPCs, how to utilize them to enrich for antigen-specific T cells, and how to expand antigen-specific T cells. Furthermore, we will highlight engineering design considerations based on experimental and biological information of our experience with characterizing antigen-specific T cells.

Antigen-specific T cells are difficult to characterize or utilize in therapies due to their extremely low frequency. Herein, we provide a protocol to develop a magnetic particle which can bind to antigen-specific T cells to enrich these cells and then to expand them several hundred-fold for both characterization and therapy.

Zenginleştirmek ve nadir antijen spesifik T hücreleri Manyetik Nano tanecikleri ile genişletin

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Mühendislik

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

Otoimmün Diyabet Modelinde Fonksiyonel Testler için Antijene Özgü Primer Fare Sitotoksik T Hücrelerinin Yüksek Verimli Üretimi

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler