Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Bu çalışma NIH hibe R00 CA160574 (SFB) tarafından ve (SMM için) Rutgers Biyoteknoloji Eğitim Programı bursu ile desteklenmektedir.

Bu prosedür Rutgers Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu, New Jersey Eyalet Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Fareler Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı için NIH Kılavuzu&#39;na uygun olarak tedavi edildi. Bilim adamları kurulan ve onaylanmış kılavuzlar için ulusal ve kurumsal hayvan kuruluşlara danışılması gerekir. Başlamadan önce, Tablo 1&#39;de listelenen çözümleri hazırlamak. 1. B Hücre İzolasyon ve Aktivasyon Sonra servikal dislokasyon yapılmıştır CO2 kullanılarak bir fare öldürülür. Vücudun sol tarafı yukarı yani fare yerleştirin ve kürk nemli olana kadar% 70 etanol ile fareyi sprey. 2 ml yıkama tamponu ile bir 35 mm doku kültürü çanağı içinde dalak ve yer ayır. Bir laminar akış başlığı içinde, yavaşça 5 ml şırıngaya yassı ucu kullanılarak doku kültürü çanağı içinde dalak kırmak. <ol><li> 50 içine 70 mikron naylon örgü takınmi boru ve naylon örgü içine 2 ml yıkama tamponu içinde dalak örnek aktarmak. Yavaşça şırınga ucunu kullanarak düz örgü, dalak bozabilir. </li><li> Yıkama tamponu, 8 ml şırınga arka ve 35 mm plaka yıkayın ve 70 um naylon ağ filtre ediniz. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Aspire süpernatant atmak ve ACK lizis tamponu 3 ml pelletini ve. Yığınları parçalamak ve 5 dakika boyunca inkübasyona aşağı kısa süreli olarak pipetle ve. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj yıkama tamponu ve 10 ml ilave edilir. </li><li> Aspire süpernatan atılır ve yıkama tamponu ile 1 ml içinde pipetleme ile daha sonra, tüpün alt kısmını dokunarak pelletini ve. Anti-CD43 MACS mikro boncuklar 50 ul ilave edilir ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, yıkama tamponu ile 10 ml ekleyin, yavaşça karıştırın ve santrifüj. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de, yıkama tamponu ile 10 ml ekleyin, yavaşça karıştırın ve santrifüj. </li><li> Kurulmuş birMACS mıknatıs üzerinde bir sütun koyarak Mini-MACS sütun. Kolonunun altında bir etiketli 15 ml konik tüp yerleştirin. Sütun yıkama tamponu 1 ml ilave edilir ve 15 ml&#39;lik bir tüpe çalışmasına olanak sağlar. </li><li> Yıkama tamponu 1 ml süpernatan aspire ve tekrar süspansiyon. Yıkama tamponu ile çalıştırmak sonra sütununda örnek yükleyin. </li><li> Örnek, kolon içinden geçen sonra sütunu yıkamak için 1 ml yıkama tamponu ilave edin. Doğrudan 15 ml tüp içinde toplanan numuneye yıkama tamponu 7 ml ilave edilir. </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 50 ml&#39;lik bir tüp içine / oyuk 5.000.000 hücreleri için gereken hücre gerekli hacmi aktarın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. LPS 1 ile Ek B hücreli orta: 500 ve 1 IL4: 1.000. </li><li> Süpernatan aspire ve 1,000,000 hücre / ml &#39;lik nihai konsantrasyon için gerekli olan takviye B hücre ortamının uygun hacimde ekleyin. </li><li> Bir nemlendirme 1.000.000 hücre / ml, bir yerde hücreler, 5 ml 6 yuvalı plakalar içinde plakası hücreleri37 ° C&#39;de bir hücre kültürü yetiştirme baskı,% 5 CO2. </li></ol> 2. B Hücre Sabitleme <ol><li> De (100 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon için) B hücre 5 ml ihtiva eden ve 37 °&#39; de 1 saat inkübe C colcemid 50 ul ekle. Bir 37 ° C su banyosu içinde ön ısıtılması, 75 mM KCI çözeltisi. Etiketlenmiş bir 15 ml tüp B hücreleri aktarın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj ile bant ve etiket kapak. </li><li> Tüp içinde 1 ml bırakarak süpernatant aspire ve pipetleme pelletini. Dokunarak veya bir girdap darbe sırasında damla prewarmed KCl damla 5 ml ekleyin. </li><li> KCl 10 ml ekleyin ve tersini karıştırın. 15 dakika süre ile, 37 ° C su banyosu içinde inkübe edin. Tersini taze fiksatif ve karışımın 5 damla ekleyin. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme tüp ve tekrar süspansiyon pelet 1 ml bırakarak süpernatant aspire. </li><li> Dokunarak veya vor üzerinde darbeli ise damla taze fiksatif damla 5 ml ekleyintex. Fiksatif ilave bir 10 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüjleyin. Pipetle tarafından tüp ve tekrar süspansiyon 1 ml bırakarak süpernatant aspire. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 x g&#39;de santrifüj taze sabitleştirici ve 14 ml ilave edilir. </li><li> Adımı tekrarlayın 2.7 kez daha fazla. </li><li> Taze fiksatif 14 ml ekleyin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve kapaklar -20 ° C de bir gece boyunca muhafaza ediniz. </li></ol> Metafaz Kromozom Spread 3. hazırlanması <ol><li> 22.9 ° C ve% 52 nem için düzenlenmiş çevresel odasını ayarlayın. </li><li> Santrifüj, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 300 xg&#39;de B hücrelerinin sabit. Aspire pipetleme tüp ve tekrar süspansiyon 70 ul bırakarak sabitleştirici. </li><li> 35 ° açıyla nem odasında etiketli slaytlar yerleştirin. Bir slayt üzerine yeniden süspanse B hücrelerinin 35 ul damla ve numune başına iki slaytlar bırakın. 30 dakika sonra slaytları saklamak için slaytlar nem odasında kurumaya bırakın37 ° C&#39;de bir slayt kutusu. </li></ol> 4. Telomer PNA BALIK <ol><li> Probe hazırlanması <ol><li> 37 ° C önceden sıcak deiyonize formamiddir. 7 ul önceden ısıtılmış deiyonize formamid ile telomer PNA probu 2 ul karıştırın ve 1 saat boyunca çalkalanarak 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 37 ° C önceden sıcak BALIK usta karışımı. Aşama 4.1.1 karışımına 7 ul önceden ısıtılmış BALIK ana karışımı ilave edin ve 1-3 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 80 ° C&#39;de 8 dakika boyunca prob karışımı denatüre. 37 ° C&#39;de 1 saat boyunca prob önceden tavlanması. </li></ol></li><li> Kromozom Slaytlar Tedavi öncesi <ol><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C&#39;de 0.01 M HCI 50 ml ihtiva eden bir cam slayt, boyama kavanoz önceden ısıtın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2 x SSC içeren farklı bir cam slayt boyama kavanoz Slaytları. </li><li> Önceden ısıtılmış bir cam slayt-boyama kavanoz Pepsin stoklar 2 ul ve alt üst edilerek karıştırılır. Bu cam sl Transfer slaytlaride boyama kavanozu ve 37 ° C&#39;de 90 saniye kuluçkaya. </li><li> Slaytlar sallayarak, oda sıcaklığında 5 dakika her biri için 1x PBS içeren farklı bir cam slayt boyama kavanoz 2x yıkayın. Daha sonra çalkalama, oda sıcaklığında 1 x PBS / MgCI2, 5 dakika için slaytlar yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 10 dakika için taze hazırlanmış% 1 formaldehid / 1x PBS / MgCI2 ihtiva eden bir cam slayt, boyama kavanoza slaytlar aktarın. </li><li> Çalkalanarak oda sıcaklığında 1 x PBS içeren farklı bir cam slayt, boyama kavanoz içinde 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. </li><li> % 70,% 90 ve% 100 etanol ihtiva eden ayrı ayrı cam slayt, boyama kavanoz sahip olan bir etanol su kaybı geliştirilmesidir. </li><li> Daha sonra% 70 etanol,% 90 etanol, ardından% 100 etanol ile başlanarak, 3 dakika boyunca her kavanoza slaytlar aktarın. Bittiğinde -20 ° C&#39;de etanol kavanozları yerleştirin. </li><li> Bir kağıt havlu üzerine aşırı etanol dokunarak ve 35 ° açıyla slaytlar yaslanır tarafından hava kurumaya slaytlar izin ver. Kuruduktan sonra, maBir elmas kalem kullanarak slaytlar arkasında melezleşme için bir 18 x 18 mm alanı çalış. </li></ol></li><li> FISH için Slaytlar denatürasyonu <ol><li> 24 x 60 mm lamel 120 ul% 70 deiyonize formamid / 2X SSC uygulayın. Lamel slayt dokunun. 90 saniye için bir sıcak plaka üzerinde 80 ° C de slayt denatüre. </li><li> Hızlı ve dikkatli bir şekilde lamel kaydırarak ve 3 dakika boyunca% 90 etanol, ardından 3 dakika,% 100 etanol ve her biri için buz soğuğu% 70 etanol içinde slayt yerleştirin. Kuru hava slaytlar izin ver. </li><li> Sıkı bir kapak ve ıslak kağıt mendil ile bir plastik kutu astar ile nemli odasını hazırlayın. Kağıt nemli olabilir, ancak su ile doymuş olmamalıdır. </li><li> Nemli bir oda içinde, sürgü üzerine işaretli bölgeye adım 4.1.3 de önceden tavlanmış prob karışımı geçerli bir 18 x 18 mm kapak slipi ile kapatın ve 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li></ol></li><li> Post-inkübasyon Yıkama <ol><li> Ön sıcak% 50 formamid / 2 x SSC, 1 x SSC ve 4x SSC /% 0.1 Tween-20, 45 ° &#39;deC su banyosu. </li><li> Dikkatlice lamelleri çıkarın ve karanlık ve çalkalanarak önceden ısıtılmış% 50 formamid / 2 x SSC 3xfor 5 dakika ve her bir durumda slaytlar yıkayın. Çalkalama, 3xfor 5 dakika önceden ısıtılmış 1x SSC, her slaytlar yıkayın. Son olarak, önceden ısıtılmış 4x SSC slaytlar yıkama /% 0.1 Tween-20 3xfor her biri 5 dakika. </li><li> Hafif bir korumalı cam slayt,-boyama kavanoz DAPI 3 dakika boyunca slaytlar Leke. </li><li> Çalkalama, 2x SSC içinde 5 dakika boyunca slaytlar yıkayın. 60 x 24 mm kapak camı ile kapak, montaj orta Mowiol 35 ul uygulayın ve 4 ° C&#39;de slaytlar saklayın. </li></ol></li></ol> Kromozomların 5. Mikroskobik Analizi <ol><li> Standart bir epi-floresan mikroskop kullanılarak metafaz slaytlar analiz edin. En iyi sonuçları elde etmek için bu tür MetaSystems Metafer platform olarak otomatik bir sahne ile bir görüntüleme platformu kullanın. DAPI floresan kromozom görselleştirmek için her metafaz yayılması için, bir resim toplamak ve telomer p gelen floresan sinyali için bir resimbornoz. (Örneğin, Cy3- diğer Fluors mevcuttur ve iyi derecede çalışır.) </li><li> Bir görüntü analiz programı ile görüntüleri Yerleşimi ve analiz eder. </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaphase+spreads+and+spectral+karyotyping+of+human+embryonic+stem+cells.">Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Schreck, R. R., Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).</li><li>Gilley, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PKcs+is+critical+for+telomere+capping.">DNA-PKcs is critical for telomere capping.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).</li><li>Bolzan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+aberrations+involving+telomeres+and+interstitial+telomeric+sequences.">Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences.</a> Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).</li><li>Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interstitial+telomeric+repeat+sequences+and+chromosomal+aberrations.">interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations.</a> Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).</li><li>Poon, S. S., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18.">Chapter 18.</a> Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

Yazarlar çatışan çıkarları var.

Aktifleşmiş B lenfositleri, özellikle mitotik kromozom sürülen hazırlamaya uygun olan ise, diğer hücre tipleri de kullanılabilir. T lenfositleri de dalak veya lemf nodlarından saflaştırılabilir gibi, B hücrelerinin avantajları çok paylaşan ve uygun mitojenler 8 ihtiva eden ortam içinde büyüme ile uyarıldıkları zaman, yüksek bir mitotik indeksli sahiptir. Embriyonik Kök hücreler (ES hücreleri) de metafaz kromozom analizi 9 için uygundur. Bu mevcut değilse, colcemid ile d...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Kanser, normal hücre gelişimini düzenleyen genlerin etkileyen mutasyonların birikmesine neden olur. Mutasyon DNA&#39;ya hasar görmesinden kaynaklanır genomunun yapısı ve sekansına değişikliklerin bir sonucudur. DNA hasarı örneğin iyonize edici radyasyon gibi, ekzojen maddeler de dahil olmak üzere, çeşitli işlem vasıtasıyla ortaya çıkabilir ve reaktif oksijen türleri 1 ile temas ile oluşan nükleotid baz veya hasar spontan deaminasyonu gibi normal hücresel metabolizma, bir yan ürün olarak. Memeli hücrelerinin, DNA hasarı tersine veya mola yerlerinde sırası geri yükleyebilirsiniz onarım faaliyetleri bir dizi sahip olmasına rağmen, mutasyonların yine bir hücrenin ömrü boyunca birikir. DNA hasarı, ayrıca, yaşlanma ile ilişkili hastalık 2 ile ilişkili iki işlem, yaşlılık ve kök hücre potens kaybı katkıda bulunabilir. İki işaret adresleme nedenle merkezi öneme DNA hasarının onarımı Anlamakamu sağlığı ificant konular. Artan kanıtlar memeli DNA onarım yolları daha da zorunlu moleküler düzeyde mutasyon bastırmakla alakası süreçleri anlamak için yapım, kanser hücre genomu 3,4 evrimine katkıda düşündürmektedir. Kromozom anormallikleri doğrudan görselleştirme özel bir hücre türü genomik instabilite ölçüde belirleyen güçlü ve kantitatif bir araçtır. Metafaz hücrelerinden özet kromozomları izole ve ışık veya floresan mikroskopi kullanılarak kontrol edilebilir. Bu tür yaklaşımlar, sitogenetik birkaç on yıl boyunca uygulamada olmuştur ve translokasyonları veya DNA tamir aktiviteleri kaybı ile ilgili kromozom anormallikleri belirli türleri görünümünü göstermek için kullanılabilir. Protokol birkaç potansiyel uzantıları kendisini ödünç: kromozomlar in situ hibridizasyon spektral karyotip (SKY) veya çok renkli floresan için sondalar ile etiketli olabilir(MFISH) translakosyon 5,6 tanımlamak için. Bu teknikler aynı zamanda bu protokol ile mümkündür ötesinde ek bilgi sağlar kromozom translokasyonların sıklığını ve tespit edilecek kompleks kromozom translokasyonların yapısını, etkinleştirin. Seçenek olarak ise, diziye özgü problar olarak üretilir ve seçilen genomik DNA&#39;sı sitelerinin 7 kopma frekansı test etmek için de kullanılabilir. Bu protokol, biz metafaz kromozom hazırlanması B lenfositlerden yayılır açıklar. Telomerik tekrarlar için bir fluoresan olarak işaretlenmiş peptid nükleik asit (PNA) sistemi etkin metafaz kromozomda telomerlerin işaretleyen kullanılır Bu protokol, bir çok avantaja sahiptir yayılır. B hücreleri, yüksek kaliteli sürülen sürekli olarak üretilebilir ve böylece yüksek bir mitotik indeksli, büyümesi için teşvik edilebilir. Genetiği değiştirilmiş farelerde B hücreleri de çok daha az katkı analizini bulandırabilir sekonder genetik mutasyonlar içeren muhtemeldirgenomik bütünlük belirli genler. PNA-BALIK yaklaşım bir günde tamamlanmış ve kromozom kırılmaları daha doğru puanlama veriyor olabilir. Özellikle bu protokolde tarif edilen özel ekipmanla birlikte, bu yaklaşım kullanılarak, çok tutarlı, yüksek kaliteli sürülen ürünlerin üretilmesi ve hızlı oranı ve genomik instabilite tür analiz etmek mümkündür.

<table><tbody><tr><td>50% Dextran sulfate</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &amp;mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-beads</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

Arızalı DNA onarım tümörigeneze yol mutasyonların kök nedenidir genomik istikrarsızlık, artan yol açar. Farklı hücre tiplerinde frekans ve kromozom anormallikleri türü analizi DNA onarım geçiş yollarında bazı kusurların araştırılmasına izin verir. Anlama memeli DNA tamir biyoloji büyük ölçüde spesifik gen knock-out ile farelerin üretimi ile yardımcı olmuştur. Bu protokolün amacı, fare B lenfositleri genomik istikrarsızlık ölçümüdür. PNA-BALIK sondaları (peptid nükleik asit - in situ hibridizasyon floresan) ile telomerlerin Etiketleme metafaz kromozom yayılır genomik istikrarsızlık hızlı analiz kolaylaştırır. Normal ploidi ve daha yüksek bir mitotik indeks çünkü B hücreleri, fibroblastlar göre spesifik avantajları vardır. B hücrelerinin kısa dönemli kültür bu nedenle daha az ikincil genetik mutasyona uğramış ihtimali olan bir birincil hücre popülasyonunda genomik instabilite hassas ölçüm sağlartipik olarak transforme edilmiş fibroblastlar veya hastanın hücre soylarında bulundu olandan s.

Bir hücreden türetilen metafaz kromozomlarda (Şekil 1A) (Fare hücreleri kullanılarak gerçekleştirilen varsa) 40 kromozom içeren ayrı bir küme oluşturmak gerekir. Her kromozom bir açık mavi küre gibi görünür bir ucunda, bir sentromer vardır. Normal kromozom olarak iki telomer sinyaller her bir sentromer ile kromatidlerin ve iki sinyalin sonunda görülür. Interfaz çekirdekleri de slaytta mevcut olacaktır. Bu kırmızı telomer sinyalleri ile mavi küreler, ama hiçbir yoğunlaşmış...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH at JoVE.com

Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür.

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

rapid-analysis-chromosome-aberrations-mouse-b-lymphocytes-pna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K Görüntüleme.  Rutgers, the State University of New Jersey.  DNA onarım yolları genomik bütünlüğünü korumak ve mutasyon ve kanser önlenmesi için gereklidir. Bu protokolün amacı, metafaz telomerik DNA tekrarlar in situ hibridizasyon (FISH) floresan kullanılarak fare B hücreleri yayılır içinde kromozom anormallikleri doğrudan gözlem ile genomik istikrarsızlık ölçümüdür. 

Video: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Sistem

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Genetik

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (mFISH) ve ışınlanmış Farelerde Spektral Karyotipik (SKY)

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

Tıp

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

Zebrabalığı Spermatositlerinden Meiotik Kromozom Spreadlerinin Hazırlanması

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Kanser Araştırmaları

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Sayısal ve Yapısal Değişmeler Algılama Tüm 24 İnsan Kromozomlar Aynı zamanda Roman OctoChrome BALIK Test kullanma

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Biyoloji

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D Nükleer teşkilatında değişiklikler Eğitim için 3D-korunmuş Tane Çekirdekle ilgili Kombine İmmünofloresan ve DNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the variable coding exons of the Ig heavy and light chain gene loci. This process of somatic hypermutation (SHM) requires the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which converts deoxycytidines (C), into deoxyuridines (U). Processing the AID-generated U:G mismatches into mutations by the base excision and mismatch repair pathways introduces new Ig coding sequences that may produce a higher affinity Ig. Mutations in AID or DNA repair genes can block or significantly alter the types of mutations observed in the Ig loci. We describe a protocol to quantify JH4 intron mutations that uses fluorescence activated cell sorting (FACS), PCR, and Sanger sequencing. Although this assay does not directly measure Ig affinity maturation, it is indicative of mutations in Ig variable coding sequences. Additionally, these methods utilize common molecular biology techniques which&#160;analyze&#160;mutations in Ig sequences of multiple B cell clones. Thus, this assay is an invaluable tool in the study of SHM and Ig diversification.

Presented here is an assay to quantify somatic hypermutation within the immunoglobulin heavy chain gene locus using germinal center B cells from mouse Peyer&#8217;s patches.

Fare Peyer Yamalarından Germinal Center B hücrelerinin JH4 intronunda Somatik Hipermütasyon Analizi

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

PNA-FISH ile Fare B Lenfositlerindeki kromozom anormallikleri hızlı Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Bir Kullanarak Ortam Partikül Madde kaynaklı kromozomal anormallikler Analizi

Çoklu Floresan Inter-kromozomal Kararlı sapmaları Algılama