Name: a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)
Uploaded: 2014-06-06T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

Yazarlar Hammond Bay Biyolojik İstasyonu, Great Lakes Science Center, US Geological Survey katkısını kabul. Biz de lazer tarama konfokal mikroskopi onun teknik destek için Michigan State Üniversitesi İleri Mikroskopi Merkezi&#39;nde Dr Melinda Frame teşekkür ederim. Bu çalışma YWCD ve WML Büyük Göller Balıkçılık Komisyonu hibe tarafından desteklenmektedir.

1.. Çözüm Hazırlığı <ol><li> 1 L sağlayın 10x 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (PBS, pH 7.4): 26.2 gr sodyum fosfat (monobazik), 115 g sodyum fosfat (dibazik), 87.66 g NaCI ve tartılır. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L&#39;ye hacmi getirmek <ol><li> 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PBS alın ve 900 ml damıtık H2O eklemek </li><li> 100 ml 10x PBS al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L&#39;ye getir hacim: 1 L 0.1 M fosfat tampon tuzlu su (pH 7.4),% 0.1 Triton X-100 ile yapın </li></ol></li><li> 26.2 g sodyum fosfat (monobazik) ve 115 g sodyum fosfat (dibazik) tartılır: 1 L 10x 0.1 M fosfat tamponu (PB, pH 7.4) olun. Yaklaşık 800 ml distile H 2 O içinde çözülür, pH ayarlanması, ve distile H 2 O. ile 1 L&#39;ye hacmi getirmek <ol><li> 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: Al 100 ml 10x PB,ve H 2 O. damıtılmış 900 ml ekle </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile 1 L 0.1 M fosfat tamponu (pH 7.4) Marka: 100 ml 10x PB al, 1 ml Triton X-100 ekleyin ve damıtık H2O ile 1 L&#39;ye kadar ses getirmek </li></ol></li><li> 400 ml hidrojel monomer çözeltisi (% 4 akrilamit,% 0.25 bis-akrilamid,% 4 paraformaldehit,% 0.0075 amonyum persülfat, 0.1 M PBS içinde% 0.0005 saponin) Marka: 0.3 g amonyum persülfat ve 0.2 g saponin tartılır. 210 ml damıtılmış 2 H ekleme O, 40 ml% 40 akrilamit,% 2 10 mi bis-akrilamid, 40 ml 10x PBS (pH 7.4), 100 ml% 16 paraformaldehit ve iyice karıştırın. </li><li> (0.2 M borik asit,% 4 SDS) 4 L temizleme çözeltisi oluşturunuz: SDS g 49,464 g borik asit ve 160 tartılır. , Yaklaşık 3,5 L distile H 2 O eritin NaOH ile 8.5 pH ayarlamak ve 4 L. hacmi getirmek </li><li> 1 L% 80 gliserol çözeltisi Marka:, 800 ml gliserol ölçmek 200 ml damıtık H2O ekleyin ve iyice karıştırın. </li></ol> 2.. Doku Hazırlanması <ol><li> Her bir 15 ml santrifüj tüpüne hidrojel monomer çözeltisi ve kısım 10 mi hazırlayın. </li><li> Bütün doku inceleyin ve 4 ° C&#39;de 2 gün için hidrojel saptamak Hidrojel çözelti en az 10x doku hacmi olduğundan emin olun. </li><li> Bir çeker ocak için (15 ml santrifüj tüpüne) hidrojel sabit doku getirin. </li><li> , TEMED 5 ul ekleyerek hidrojel sabit doku polimerize iyice karıştırın ve 2-3 saat boyunca oda sıcaklığında, çeker ocak içinde bekletin. </li><li> İyice fazla jelin çıkarılması. Not: Ekstra jel boyama esnasında temizleme sürecini ve antikor sokulmasına engel olacaktır. </li><li> Doku saydam hale gelinceye kadar, birkaç gün boyunca 70 rpm&#39;de ve 50 ° C&#39;de ayarlanmış bir kuluçka çalkalayıcı içinde çözelti temizleme 10 ml sabit doku inkübe edin. , En az günde bir kez temizleme çözeltisi değiştirmek ve temizleme solüsyonu değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 70 r% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml 0.1 M PB içerisinde dokuyu durulayınpm ve 37 ° C gecede. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 2 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile PB primer antikor çözeltisi içindeki açıklık dokuyu inkübe edin. Not: Bütün daldırın doku için yeterli birincil antikor çözüm olun. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> Karanlık bir odada ya da loş ışık altında, aşağıdaki adımları uygulayın. Fotoğraf beyazlatma önlemek için folyo ile örtün örnekleri. </li><li> % 0.1 Triton X-100 ile PB floresan ikincil antikor çözeltisi ve 1 gün boyunca 70 rpm ve 37 ° C de bloke serumu ile berraklaştırılmış dokuyu inkübe edin. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C &#39;de% 0.1 Triton X-100 ile 10 ml PB doku durulayın. Bu adımı 3 kez tekrarlayın ve aşırı jel f kaldırmakTampon çözeltisi değiştirirken doku rom. </li><li> Gece boyunca 70 rpm ve 37 ° C de 10 ml PBS içinde doku durulayın. Bu adım 3 kez tekrarlayın ve tampon çözeltisi değiştirirken dokudan fazla jelin çıkarılması. </li><li> 70 rpm ve 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca% 80 gliserol içinde berraklaştırılmış doku inkübe edin. </li><li> Önce konfokal mikroskopi için 4 ° C&#39;de floresan lekeli doku saklayın. </li></ol>

<ol>
	<li>Applegate, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+in+Michigan.">Natural history of the sea lamprey (Petromyzon marinus) in Michigan.</a> US Fish and Wildlife Service Special Science Report on Fishery Service. (55), (1950).</li><li>Hardisty, M. W., Potter, I. C., Hardisty, M. W., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+biology+of+adult+lampreys.">The general biology of adult lampreys.</a> The biology of lampreys. 1, 127-206 (1971).</li><li>Youson, J. H., Potter, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+description+of+the+stages+in+the+metamorphosis+of+the+anadromous+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">A description of the stages in the metamorphosis of the anadromous sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> Can. J. Zool. 57, 1808-1817 (1979).</li><li>Boomer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+apoptosis+is+an+early+event+during+induced+metamorphosis+in+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.">Cholangiocyte apoptosis is an early event during induced metamorphosis in the sea lamprey, Petromyzon marinus L.</a> J. Pediatr. Surg. 45, 114-120 (2010).</li><li>Kasai, M., Suzuki, H., Ohashi, E., Ohi, R., Chiba, T., Okamoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technique+and+results+of+operative+management+of+biliary+atresia.">Technique and results of operative management of biliary atresia.</a> World J. Surg. 2, 571-580 (1978).</li><li>Suzuki, T., Hashimoto, T., Kondo, S., Sato, Y., Hussein, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluating+patients&#8217;+outcome+post-Kasai+operation:+a+19-year+experience+with+modification+of+the+hepatic+portoenterostomy+and+applying+a+novel+steroid+therapy+regimen.">Evaluating patients&#8217; outcome post-Kasai operation: a 19-year experience with modification of the hepatic portoenterostomy and applying a novel steroid therapy regimen.</a> Pediatr. Surg. Int. 26, 825-830 (2010).</li><li>Hartley, J. L., Davenport, M., Kelly, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia.">Biliary atresia.</a> Lancet. 374, 1704-1713 (2009).</li><li>Morecki, R., Glaser, J. H., Cho, S., Balistreri, W. F., Horwitz, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biliary+atresia+and+reovirus+type+3+infection.">Biliary atresia and reovirus type 3 infection.</a> New Engl. J. Med. 307, 481-484 (1982).</li><li>Shimadera, S., Iwai, N., Deguchi, E., Kimura, O., Fumino, S., Yokoyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inv+mouse+as+an+experimental+model+of+biliary+atresia.">The inv mouse as an experimental model of biliary atresia.</a> J. Pediatr. Surg. 42, 1555-1560 (2007).</li><li>Sidon, E. W., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+changes+in+the+liver+of+the+sea+lamprey,+Petromyzon+marinus+L.,+during+metamorphosis:+I.+Atresia+of+the+bile+ducts.">Morphological changes in the liver of the sea lamprey, Petromyzon marinus L., during metamorphosis: I. Atresia of the bile ducts.</a> J. Morphol. 177, 109-124 (1983).</li><li>Yeh, C. -. Y., Chung-Davidson, Y. -. W., Wang, H., Li, K., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+synthesis+and+secretion+of+bile+salts+as+an+adaptation+to+developmental+biliary+atresia+in+the+sea+lamprey.">Intestinal synthesis and secretion of bile salts as an adaptation to developmental biliary atresia in the sea lamprey.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 109, 11419-11424 (2012).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Alarc&#243;n, V. B., Filosa, M. F., Youson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokeratins+in+the+liver+of+the+sea+lamprey+(Petromyzon+marinus)+before+and+after+metamorphosis.">Cytokeratins in the liver of the sea lamprey (Petromyzon marinus) before and after metamorphosis.</a> Cell Tissue Res. 287, 365-374 (1997).</li><li>Youson, J. H., Ogilvie, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+features+of+degeneration+of+the+gallbladder+during+lamprey+biliary+atresia.">Ultrastructural features of degeneration of the gallbladder during lamprey biliary atresia.</a> Tissue and Cell. 22, 477-492 (1990).</li><li>Morii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+apoptosis+in+the+cystic+duct+during+metamorphosis+of+a+Japanese+lamprey,+Lethenteron+reissneri.">Onset of apoptosis in the cystic duct during metamorphosis of a Japanese lamprey, Lethenteron reissneri.</a> Anat. Rec. 293, 1155-1166 (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, nano gözenekli bir hidrojel oluşturmak üzere, poliakrilamid ile bozulmamış doku çapraz bağlar ve daha sonra optik saydamlık ve makromoleküler geçirgenliği elde etmek için doku plazma zarı uzak şeritler &quot;açıklık&quot; 12 olarak adlandırılan yeni bir yöntem, modifiye edilir. &quot;BERRAKLIK&quot; uzun menzilli projeksiyon ve sinir sisteminde yerel devre kablolama sağlam doku görüntüleme sağlar. Bu yeni yöntem, başkalaşım sırasında deniz lamprey karaciğerde tüm safra kanallarının görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Bu yüksek çözünürlüklü bilgi edinmek ve bu tüm safra sistemi veya geleneksel gömme kullanarak ve yöntemleri kesit merkezi sinir sistemi gibi karmaşık bir sistemden, küresel bir bakış açısı sağlamak için biyolojide bir sorundur. Bu modifiye AÇIKLIK yöntem, bir lazer ışını normal bir lazer tarama confoca düşük güç floresan objektif (4x) ile 1-2 mm kalınlığa kadar sağlam deniz lamprey larva karaciğer içinden nüfuz etmesine olanak tanırl mikroskop. Daha derin nüfuz daha gelişmiş bir çoklu foton konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir. Üç boyutlu görüntüleri 3 boyutlu rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak yeniden inşa edilebilir. Geleneksel yöntemler kullanılarak karşılaştırılabilir sonuçlar elde, zahmetli olması birçok bölümden parça parça yeniden içeren ve küçük doku hacimleri sınırlı olurdu. Bu yeni yöntem, sağlam sistemleri 12 bütün yapısal analizler değerli bilgiler sağlar, daha az emek-yoğun, daha verimli ve tekrarlanabilir. Bu yeni yöntemin diğer bir avantajı, numune farklı antikorlarla boyama ile 12 için birden çok kez tekrar edilebilir olmasıdır. Bu durum, aynı örnekte farklı moleküler işaretlerin arasındaki karşılaştırma daha güvenilir ve tekrarlanabilir hale getirir. Hidrojel tarafından oluşturulan istikrarlı bir çerçevede ince yapısının zarar vermeden antikorların etkili bir şekilde uzaklaştırılmasını sağlar ve bir lo için antijenliğini korurng süre 12. Temizleme çözeltisi bu nedenle, bir antikor-soyma çözeltisi 12 olarak hareket eden, bağlayıcı antikorlar ve denatüre bozar. Boyama birkaç tur deniz taşemen karaciğer örneklerinde yapılmıştır ve yapısı ve boyama optimum kalmıştır. Orijinal &quot;CLARITY&quot; protokol 12 Bu protokolde iki önemli değişiklikler vardır. (1) kök üretici ayıraçları (amonyum persülfat ve TEMED) yerine VA044 olan hidrojel polimerizasyonunu başlatmak ve hızlandırmak için kullanıldı. VA044 ışığa ve mevcut değil ABD (2) Hayır özel inşa elektroforez odası kullanılır olmasıdır. Dokularda (karaciğer lamprey genel fare beyni) büyüklüğüne bağlı olarak CLARITY yöntemi 12, içinde, elektroforetik doku temizleme, plazma zarının çıkarma hızlandırmak için gereklidir. Ismarlama bir elektroforez odası için başlangıç ​​maliyeti önlemek için, biz ilk exi kullanılırLaboratuvarımızda agaroz jel elektroforez cihazları acı. Bu çok verimsiz olduğunu kanıtladı. Bununla birlikte, yükseltilmiş bir sıcaklıkta (50 ° C) ile temizleme çözeltisi içinde inkübasyon plazma zarı açıklıkta çok etkilidir. &quot;Açıklık&quot; için yazarlar hidrojel saponin kullanımına karşı uyarıda de, bizim prosedürde deniz lamprey dokuda şeffaflığını iyileştirir. Konfokal görüntüleme için tek dezavantajı deniz taşemen doku güçlü otomatik floresan olmasıdır. Florofor seçimi immünofloresan boyama öncesi ve sonrası görüntü karşılaştırılarak test edilmelidir. Deniz taşemen metamorfoz sırasında, safra kesesi epitel regresyon metamorfik aşamaları 2 ve 3 arasında başlar. Metamorfik evre 4 olarak, safra kesesi, deniz taşemen karaciğer 14 tamamen kaybolur. Safra kanalı dejenerasyon en dra olduğunumatic metamorfik evre 3 ve 4 15 arasında. Bu modifiye yöntem, insan biliyer atrezi için anlayışlar sağlayabilir tüm safra sisteminin dejenerasyonu hücresel ve moleküler mekanizmaları incelemek için güçlü bir araçtır.

Deniz taşemen üç ayrı yaşam boyunca gelişir 1,2 aşamaları. Larva deniz taşemen (L) bentik filtre besleyiciler olarak yuvalarda çoğu zaman harcamak. Dış morfoloji ve iç organlarda 3 yeniden dramatik değişiklikler yedi metamorfik aşamaları geçtikten sonra, elde edilen yavrular (JV) kütle 100 defadan fazla vücut artırarak, konak balık kan ve doku sıvıları ile beslenirler sırasında bir parazit sahne girin . Okyanus veya büyük göllerde konak balık besleme, 1.0 ila 1.5 yıl sonra, yetişkin erken bahar aylarında beslenme durdurma ve yumurtlamak için akarsulara göç ve ardından 1,2 ölür. Metamorfoz sırasında, deniz taşemen karaciğer safra kesesi ve safra yolları, tüm, insan bebekte hastalık safra yolları atrezisi taklit eden evrimsel bir mutant fenotip kaybeder. Bebek biliyer atrezi 4,5,6,7 ciddi tıbbi komplikasyonlar nadir bir pediatrik karaciğer hastalığıdır, 8,9,10, ancak safra atrezi patogenezi ve etyolojisi 4 büyük ölçüde bilinmemektedir. Cerrahi müdahale (Kasai prosedürü) 5 gerçekleştirilir sürece biliyer atrezi ile hastalar doğumdan sonra iki yıl içinde ölmektedir. Daha sonra, bu hastalar geniş klinik yönetimi ve genellikle karaciğer nakli 6. gerektirir. Biliyer atrezi etiyopatogenezinin Birçok teori gibi viral enfeksiyon, konjenital malformasyon, otoimmün hastalık, toksik ve hakaret olarak önerilmiştir. Ancak, safra atrezi gelişimine her katkısı 7,8,9,10 sonuçsuz kalır. Patolojik safra yolları atrezisi acı bebeklerin aksine, deniz taşemen gelişimsel kapsamlı stres nekroinflamasyon, fibrozis veya siroz 10 olmadan safra yolları atrezisi programlanmış geçireceği. Hayvanlar, bu süreçte 10 sırasında geçici kolestazınız acı, ama bu gelişimsel duruma adapte olabilirile de novo sentezi ve bu 11 karaciğer safra tuzunun sentezi azaltma olarak bilinen mekanizmaları ek olarak gelişim safra atrezi, sonra bağırsak safra tuzlarının salgılanması. Deniz lamprey Bu gelişim süreci biliyer atrezi ilerlemesini incelemek için bilinen tek fırsat sağlar. &quot;AÇIKLIK&quot; adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem, bir optik şeffaf Nanogeçirgen hidrojel 12 içine bozulmamış dokusu dönüştürerek karmaşık memeli sinir sistemlerinde yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlar. Deniz taşemen karaciğer ve modifiye BERRAKLIK protokolünü kullanarak, safra dejenerasyon sağlam doku görüntüleme karaciğer metamorfoz boyunca belgelenmiştir olabilir.

<table><tbody><tr><td>40% acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0140</td><td></td></tr><tr><td>2% bis-acrylamide&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>boric acid</td><td>Sigma</td><td>B7901-1KG</td><td></td></tr><tr><td>saponin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>sodium dodecyl sulfate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>L337-500G</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate (monobasic)</td><td>Sigma</td><td>04269-1KG</td><td></td></tr><tr><td>sodium phosphate (dibasic)</td><td>Sigma</td><td>S5136-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>glycerol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G9012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>NaOH pellets&amp;nbsp;</td><td>EMD</td><td>SX0590-3</td><td></td></tr><tr><td>15 ml centrifuge tubes</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dissecting tools&amp;nbsp;</td><td>Any brand</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a new clarification method to visualize biliary degeneration during liver metamorphosis in sea lamprey (petromyzon marinus)

Biliyer atrezi Tayvan 5,000 içinde 1 bildirilen frekans ile tahmini 1 15,000 güneydoğu ABD&#39;de frekans, ancak Doğu Asya ülkelerinde daha yaygın olan, bebeklik nadir bir hastalıktır. Çok biliyer atrezi yönetimi hakkında bilinmesine rağmen, patogenezi hala zor olduğunu. Deniz taşemen (Petromyzon marinus) safra dejenerasyonun mekanizması ve ilerlemesini incelemek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Larva, parazit ve yetişkin: Deniz taşemen üç farklı yaşam evrelerinde yoluyla gelişir. Larva parazitik koleje geçiş sırasında, deniz taşemen dış morfolojisi ve iç organlarda dramatik yeniden yapılanma ve yeniden birlikte metamorfoz tabi. Karaciğerde, tüm bilier sistem safra kesesi ve safra dahil, kaybolur. &quot;AÇIKLIK&quot; adı verilen yeni geliştirilmiş bir yöntem metamorfik deniz lamprey de bağırsak ile tüm karaciğer ve kavşak netleştirmek için güncellenmiştir.safra dejenerasyon süreci lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak görüntülendi ve deniz taşemen metamorfoz sırasında ayırt edildi. Bu yöntem, eşsiz bir hayvan modelinde safra yolları atrezisi incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Birçok önemli gelişme olayları deniz taşemen Başkalaşım sırasında Hepatobilier sistemde meydana. Safra kanalı ve safra kesesi apoptozu ve dejenere (Şekil 1) tabi. Ve konfokal mikroskopi kullanılarak anti-apoptotik işaretleyici BCL2 (cholangiocytes ve hepatositler önce ve başkalaşım 13 sonrasında mevcut CK19) karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19, modifiye arıtma yöntemi ve boyama birleştiren, tüm safra sistemi Z-ekseni (boyunca yakalandı Şekil 2) ve 3-boyutlu yapısı (Şekil 3) yeniden inşa edildi. Lazer tarama konfokal mikroskopi safra yollarının çoğu safra bağırsağa girer kavşak dışında karaciğer içine gömülü olduğundan sağlam karaciğer yoluyla optik bölümünü gerçekleştirmek için kullanılmıştır. Dejeneratif bir süreç merkezi büyük intrahep doğru periferik küçük safra ductules başlayarak, metamorfik aşamalarında 2-4 oluşurönceki çalışmalarda 10 ile tutarlı problemlerle ortak safra kanalı (Şekil 2). <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig1highres.jpg" width="500" /> Deniz taşemen Başkalaşım sırasında Şekil 1.. Safra kesesi dejenerasyon. Sea taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi (siyah oklar) kaybedersiniz. Numuneler metamorfik aşamada 2 ve 3 arasında dış morfolojisi ile hayvanlardan alınmıştır; (evre 2) olmayan veya (evre 3) iris ve gözbebeği keskin farklılaşma, ağız iç dorsal yüzeyinde belirgin papilla gibi projeksiyonlar ile yuvarlak göz yani başlık (iki kademe), ağız boşluğuna dikdörtgen bir giriş (evre 3), ya da &quot;boksör gibi&quot; burun (evre 3) 3 oluşturan sözlü kaputu (evre 2) ve dudakları kalınlaşmış. Safra kesesi de safra üretiminde farklılıklar gösteren rengi değişti unutmayın.I: bağırsak. L:. Karaciğer <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51648/51648fig1highres.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Başkalaşım sırasında deniz taşemen karaciğerde safra ağacını gösteren Konfokal görüntüler. Numuneler Üst paneller ön alınır. Metamorfik safhalar 2 ve 3 arasında dış morfolojisi ile hayvanlardan alınan ve arka ucundan alt paneller yapılmıştır. Karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19 görüntüleri (1:100, fare-anti-CK19, 2 ug ile boyandı / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG, mavi) ve anti-apoptotik işaretleyici Bcl2 (1:100 tavşan-anti- Bcl2; / ml Alexa Fluor 488-eşek-anti-tavşan IgG 2 mikrogram ile boyanmış, yeşil) birleştirilmiş görüntüler oluşturmak için bindirilmiş. Beyaz oklar b göstermektediriliary ağacı. Siyah oklar karanlık dendritik hücreleri apoptotik görünümlü ve karaciğerde kanalikül ve ductules çevreleyen gösterir. I: bağırsak. L: Karaciğer. Ölçek çubuğu:. 500 mikron <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51648/51648fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig3highres.jpg" width="500" /> Birleştirilmiş konfokal z serisinin yeniden Şekil 3.. 3D görüntüler. 3D görüntüler metamorfik safhalar 2 ve 3 arasında üç karaciğerinin konfokal z-serisi yeniden inşa edildi. Karaciğer hücre işaretleyici sitokeratin 19 birleştirilmiş görüntülerin optik bölümleri (1:100 fare- anti-CK19, 2 ug / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG&#39;si ile boyandı, mavi) ve anti-apoptotik işaretleyici Bcl2 (1:100 tavşan-anti-Bcl2, 2 ug / ml Alexa Fluor 488-eşek ile boyanmış -anti-tavşan IgG; yeşil) 3D görüntüler oluşturmak için üreticinin yazılımı ile yeniden inşa edilir. Üst panel alınan ön ve arka ucundan alt panelleri vardır. Beyaz oklar safra yolları gösterir. Siyah oklar karanlık dendritik hücreleri apoptotik görünümlü ve karaciğerde kanalikül ve ductules çevreleyen gösterir. I: bağırsak. L: Karaciğer. Ölçek çubuğu:. 500 mikron <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51648/51648fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51648/51648fig4highres.jpg" width="500" /> .. 3 floresan kanalları Şekil 4 lümeninde safra damlacıkları ile safra kanalları gösteren bir konfokal optik bölüm Birleştirilmiş görüntü; mavi: fare anti-c-Myc (1:100) / 2 ug / ml Alexa Fluor 350 keçi-anti-fare IgG; yeşil: 2 mcg / ml Nissl yeşil; Kırmızı: Tavşan anti-TGFβRII (1:100) / 2 mcg / ml Alexa Fluor 594-eşek-anti-tavşan. Ölçek çubuğu: 500 mikron. Safra damlacıklar Siyah oklar ile belirtilmiştir. Karaciğer numune metamorfik evre 2 ve 3 arasında alındı. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51648/51648fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus at JoVE.com

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Deniz taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi ve safra yolları, insan safra atrezi ile benzer bir süreç kaybedersiniz. Yeni bir tespit ve açıklama yöntemi (AÇIKLIK) lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak tüm safra yolları görselleştirmek için güncellenmiştir. Bu yöntem safra dejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar.

Deniz taşemen Karaciğer Metamorfoz sırasında Safra Hastalığı gözünüzde Yeni Bir Açıklama Yöntemi ( Petromyzon marinus)

Biliary atresia is a rare disease of infancy, with an estimated 1 in 15,000 frequency in the southeast United States, but more common in East Asian ...

a-new-clarification-method-to-visualize-biliary-degeneration-during

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey (Petromyzon marinus)

13.7K Görüntüleme.  Michigan State University.  Deniz taşemen Başkalaşım sırasında safra kesesi ve safra yolları, insan safra atrezi ile benzer bir süreç kaybedersiniz. Yeni bir tespit ve açıklama yöntemi (AÇIKLIK) lazer tarama konfokal mikroskopi kullanılarak tüm safra yolları görselleştirmek için güncellenmiştir. Bu yöntem safra dejenerasyonu incelemek için güçlü bir araç sağlar. 

Video: A New Clarification Method to Visualize Biliary Degeneration During Liver Metamorphosis in Sea Lamprey Petromyzon marinus

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or biliary-driven liver regeneration. In hepatocyte-driven liver regeneration, regenerating hepatocytes are derived from preexisting hepatocytes, whereas, in biliary-driven regeneration, regenerating hepatocytes are derived from biliary epithelial cells (BECs). For hepatocyte-driven liver regeneration, there are excellent rodent models that have significantly contributed to the current understanding of liver regeneration. However, no such rodent model exists for biliary-driven liver regeneration. We recently reported on a zebrafish liver injury model in which BECs extensively give rise to hepatocytes upon severe hepatocyte loss. In this model, hepatocytes are specifically ablated by a pharmacogenetic means. Here we present in detail the methods to ablate hepatocytes and to analyze the BEC-driven liver regeneration process. This hepatocyte-specific ablation model can be further used to discover the underlying molecular and cellular mechanisms of biliary-driven liver regeneration. Moreover, these methods can be applied to chemical screens to identify small molecules that augment or suppress liver regeneration.

To help assess the molecular mechanisms underlying zebrafish biliary-driven liver regeneration, we established a liver injury model in which the nitroreductase-expressing hepatocytes are genetically ablated upon metronidazole treatment. In this protocol, we describe how to adeptly manipulate, monitor and analyze hepatocyte ablation and biliary-driven liver regeneration.

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Gelişim Biyolojisi

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

Bioassay-güdümlü ayırma kullanarak deniz taşemen Feromonlar tanımlaması

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Biyokimya

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all liver cancer cases. With the introduction of effective treatments to prevent and treat hepatitis B/C, non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD), and the more aggressive form know as non-alcoholic steatohepatitis (NASH), are quickly becoming the number one risk factors to develop HCC in modern societies. To better understand the role NASH has on the development of HCC we designed a NASH-associated HCC zebrafish. The optical clarity and genetic tractability of the zebrafish larvae make them an appealing and powerful model to study the liver microenvironment and immune cell composition using non-invasive fluorescent live imaging. This protocol describes how to use a NASH-associated HCC zebrafish model to investigate the effect of cholesterol surplus in the liver microenvironment and its impact on immune cell composition at early stages of the disease. First, we feed HCC larvae (s704Tg), which express hepatocyte-specific activated beta-catenin, with a 10% high cholesterol diet for 8 days to develop a NASH-associated HCC model. Here we describe how to make use of different transgenic lines to evaluate several early malignancy features in the liver by non-invasive confocal microscopy, such as liver area, cell, and nuclear morphology (hepatocytes area, nuclear area, nuclear:cytoplasmic ratio (N:C ratio), nuclear circularity, micronuclei/nuclear herniation scoring) and angiogenesis. Then, using transgenic lines with tagged immune cells (neutrophils, macrophages, and T cells) we show how to analyze liver immune cell composition in NASH-associated HCC larvae. The described techniques are useful to evaluate liver microenvironment and immune cell composition at early hepatocarcinogenesis stages, but they can also be modified to study such features in other liver disease models.

Here, we present how to generate a non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD)-associated Hepatocellular Carcinoma (HCC) zebrafish model to study the impact of cholesterol surplus on liver microenvironment and immune cell landscape.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

Kanser Araştırmaları

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques are used, including serum chemistry, histological analysis, and immunostaining for specific markers. Although these techniques can provide important information about the biliary system, they often do not present a full picture of bile duct (BD) developmental defects across the whole liver. This is in part due to the robust ability of the mouse liver to drain the bile even in animals with significant impairment in biliary development. Here we present a simple method to calculate the average number of BDs associated with each portal vein (PV) in sections covering all lobes of mutant/transgenic mice. In this method, livers are mounted and sectioned in a stereotypic manner to facilitate comparison among various genotypes and experimental conditions. BDs are identified via light microscopy of cytokeratin-stained cholangiocytes, and then counted and divided by the total number of PVs present in liver section. As an example, we show how this method can clearly distinguish between wild-type mice and a mouse model of Alagille syndrome. The method presented here cannot substitute for techniques that visualize the three-dimensional structure of the biliary tree. However, it offers an easy and direct way to quantitatively assess BD development and the degree of ductular reaction formation in mice.

We present a rather simple and sensitive method for accurate quantification of bile duct density in the mouse liver. This method can aid in determining the effects of genetic and environmental modifiers and the effectiveness of potential therapies in mouse models of biliary diseases.

Fare karaciğerinde safra kanalı yoğunluğu belirlenmesi

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several weeks, and this is accompanied by short distance regeneration (a few mm) of propriospinal axons and spinal-projecting axons from the brainstem. Among the 36 large identifiable spinal-projecting neurons, some are good regenerators and others are bad regenerators. These neurons can most easily be identified in wholemount CNS preparations. In order to understand the neuron-intrinsic mechanisms that favor or inhibit axon regeneration after injury in the vertebrates CNS, we determine differences in gene expression between the good and bad regenerators, and how expression is influenced by spinal cord transection. This paper illustrates the techniques for housing larval and recently transformed adult sea lampreys in fresh water tanks, producing complete spinal cord transections under microscopic vision, and preparing brain and spinal cord wholemounts for in situ hybridization. Briefly, animals are kept at 16&#160;&#176;C and anesthetized in 1% Benzocaine in lamprey Ringer. The spinal cord is transected with iridectomy scissors via a dorsal approach and the animal is allowed to recover in fresh water tanks at 23 &#176;C. For in situ hybridization, animals are reanesthetized and the brain and cord removed via a dorsal approach.

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Lampreys recover locomotion after a complete spinal cord injury. However, some spinal-projecting neurons are good regenerators and others are not. This paper illustrates the techniques for housing sea lamprey larvae (and recently transformed adults), producing complete spinal cord transections and preparing wholemount brains and spinal cords for in situ hybridization.

Sonradan wholemount için komple Omurilik Yaralanmalı ve Beyin Diseksiyon Protokolü<em&gt; Yerinde</em&gt; Larva Deniz taşemen içinde Hibritleşme

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

Nörobilim

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval liver size in zebrafish HCC models provides a means to rapidly assess the effects of drugs and other manipulations on an oncogene-related phenotype. Here we show how to fix zebrafish larvae, dissect the tissues surrounding the liver, photograph livers using bright-field microscopy, measure liver area, and analyze results. This protocol enables rapid, precise quantification of liver size. As this method involves measuring liver area, it may underestimate differences in liver volume, and complementary methodologies are required to differentiate between changes in cell size and changes in cell number. The dissection technique described herein is an excellent tool to visualize the liver, gut, and pancreas in their natural positions for myriad downstream applications including immunofluorescence staining and in situ hybridization. The described strategy for quantifying larval liver size is applicable to many aspects of liver development and regeneration.

Here we demonstrate a method for quantifying liver size in larval zebrafish, providing a way to assess the effects of genetic and pharmacologic manipulations on liver growth and development.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Examining Muscle Regeneration in Zebrafish Models of Muscle Disease

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, the muscle stem cell is activated and undergoes cell proliferation to generate a pool of myoblasts, which subsequently differentiate to form new muscle fibers. In many muscle wasting conditions, including muscular dystrophy and ageing, this process is impaired resulting in the inability of muscle to regenerate. The process of muscle regeneration in zebrafish is highly conserved with mammalian systems providing an excellent system to study muscle stem cell function and regeneration, in muscle wasting conditions such as muscular dystrophy. Here, we present a method to examine muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease. The first step involves the use of a genotyping platform that allows the determination of the genotype of the larvae prior to eliciting an injury. Having determined the genotype, the muscle is injured using a needle stab, following which polarizing light microscopy is used to determine the extent of muscle regeneration. We therefore provide a high throughput pipeline which allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Skeletal muscle regeneration is driven by tissue resident muscle stem cells, which are impaired in many muscle diseases such as muscular dystrophy, and this results in the inability of muscle to regenerate. Here, we describe a protocol that allows the examination of muscle regeneration in zebrafish models of muscle disease.

Kas Hastalığının Zebra Balığı Modellerinde Kas Yenilenmesinin İncelenmesi

Skeletal muscle has a remarkable ability to regenerate following injury, which is driven by obligate tissue resident muscle stem cells. Following injury, ...

Eye Removal in Living Zebrafish Larvae to Examine Innervation-dependent Growth and Development of the Visual System

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis support continuous growth of the entire visual system, both in the eye and the brain. Coordinated growth between the retinae and the optic tectum ensures accurate retinotopic mapping as new neurons are added in the eyes and brain. To address whether retinal axons provide crucial information for regulating tectal stem and progenitor cell behaviors such as survival, proliferation, and/or differentiation, it is necessary to be able to compare innervated and denervated tectal lobes within the same animal and across animals. 
Surgical removal of one eye from living larval zebrafish followed by observation of the optic tectum achieves this goal. The accompanying video demonstrates how to anesthetize larvae, electrolytically sharpen tungsten needles, and use them to remove one eye. It next shows how to dissect brains from fixed zebrafish larvae. Finally, the video provides an overview of the protocol for immunohistochemistry and a demonstration of how to mount stained embryos in low-melting-point agarose for microscopy.

The article explains how to surgically remove eyes from living zebrafish larvae as the first step toward investigating how retinal input influences optic tectum growth and development. In addition, the article provides information about larval anesthetization, fixation, and brain dissection, followed by immunohistochemistry and confocal imaging.

Görsel Sistemin Innervasyona Bağlı Büyümesini ve Gelişimini İncelemek için Canlı Zebra Balığı Larvalarında Göz Çıkarılması

Zebrafish exhibit remarkable life-long growth and regenerative abilities. For example, specialized stem cell niches established during embryogenesis ...

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the three-dimensional (3D) architecture of the organ at the whole-organ level. Liver architecture is characterized by multiple branching lumenized structures, which can be filled with resin, including vascular and biliary trees, establishing a highly stereotyped pattern in the otherwise hepatocyte-rich parenchyma. This protocol describes the pipeline for performing double resin casting micro-computed tomography, or &#34;DUCT&#34;. DUCT entails injecting the portal vein and common bile duct with two different radiopaque synthetic resins, followed by tissue fixation. Quality control by clearing one lobe, or the entire liver, with an optical clearing agent, allows for pre-screening of suitably injected samples. In the second part of the DUCT pipeline, a lobe or the whole liver can be used for micro-computed tomography (microCT) scanning, (semi-)automated segmentation, and 3D rendering of the portal venous and biliary networks. MicroCT results in 3D coordinate data for the two resins allowing for qualitative as well as quantitative analysis of the two systems and their spatial relationship. DUCT can be applied to postnatal and adult mouse liver and can be further extended to other tubular networks, for example, vascular networks and airways in the lungs.

Double resin casting micro-computed tomography, or DUCT, enables visualization, digitalization, and segmentation of two tubular systems simultaneously to facilitate 3D analysis of organ architecture. DUCT combines ex vivo injection of two radiopaque resins followed by micro-computed tomography scanning and segmentation of the tomographic data.

DUCT: Çift Reçine Dökümü ve ardından 3D Karaciğer Analizi için Mikro Bilgisayarlı Tomografi

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Tıp

Dissection and Flat-mounting of the Threespine Stickleback Branchial Skeleton

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species' diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Diseksiyon ve Threespine Stickleback Brankial İskelet Düz montaj

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology ...