İntravezikal Hücre Uygulama Tekniği ile Murin Yüzeysel Mesane Kanseri Modelinin Oluşturulması

Bu protokol, yüzeysel mesane kanserinin ortotopik bir modelini oluşturmak için benzersiz bir yöntemi tanımlar.

Bu çalışma, yüksek verimlilik ve hassas tümör lokalizasyonu ile ortotopik bir murin mesane tümör modeli oluşturmak için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır. Dişi C57BL / 6J fareleri sırtüstü pozisyonda uyuşturduktan sonra, içeriğini boşaltmak için mesaneye 24 G'lik bir intravenöz iğne yerleştirilir. Daha sonra 34 G'lik bir dağıtım iğnesi kateterden sokulur, mesane kubbe mukozasında fokal bir yaralanma oluşturmak için beş kez döndürülür ve ardından çıkarılır. MB49 hücre süspansiyonu aspire edilir ve kateter yoluyla mesaneye yerleştirilen 30 G'lık bir dağıtım iğnesine bağlanır. Tümör hücreleri basınç altında mesaneye submukozal olarak enjekte edilir. Bu teknik, farelerde minimal travma, yüksek tümör alma oranı ve sabit bir tümör konumu ile sonuçlanır. Basitlik ve mükemmel tekrarlanabilirlik ile karakterizedir. Bu model, mesane kanseri için intravezikal tedaviler geliştirmek için ideal bir deneysel platform sağlar ve bu malignite için tedavi stratejilerinin ilerlemesini ve optimizasyonunu kolaylaştırır.

Mesane kanseri, insidans ve prognozda cinsiyete özgü belirgin eşitsizliklerle birlikte önemli bir küresel sağlık yükünü temsil etmektedir. Bu malignite, her biri farklı patojenik yolaklarla ilişkili farklı moleküler alt tiplerle karakterizedir. Kas invaziv olmayan mesane kanseri (NMIBC) ve kas invaziv mesane kanseri (MIBC) arasında moleküler ve patolojik özellikler önemli ölçüde farklılık ^gösterir1,2. NMIBC, vakaların yaklaşık% 75'ini oluşturur ve metastaz veya yayılma olmadan lokalize kalan geçiş epitel kökenli tümörleri içerir. Tersine, MIBC, kanser hücrelerinin mesanenin kas tabakasına sızması ile karakterizedir, buna yüksek yayılma riski eşlik eder ve klinik uygulamada sıklıkla sistektomi gerektirir³.

Klinik öncesi araştırmalarda, hastalığın yüzeysel aşamasını doğru bir şekilde temsil eden modeller, ilaç tedavilerini değerlendirmek için gereklidir. Bu nedenle, yüzeyel mesane karsinomu in situ modelinin oluşturulması, klinik ilaçların ve yenilikçi damlatma tedavilerinin geliştirilmesi için kritik bir araştırma aracı olarak hizmet etmesi açısından büyük önem taşımaktadır.

Murin ortotopik mesane kanseri modellerinin geliştirilmesi geleneksel olarak zorluklarla karşı karşıya kalmıştır. Kimyasal olarak indüklenen modeller genellikle yüzeysel tümörler olarak başlar, ancak büyük ölçekli deneylerde faydalarını sınırlayan değişkenlik ile invaziv formlara dönüşebilir⁴. Tümör hücrelerinin mesane duvarından⁵ enjeksiyonuna dayanan geleneksel ortotopik implantasyon modelleri, yüzeysel mesane kanserini aslına uygun olarak yeniden üretmek için mücadele eder. Tümör hücresi damlatma ^6,7,8,9,10 ile birlikte mukozal yaralanma dahil olmak üzere alternatif yöntemler denenmiştir, ancak yüksek mortalite oranları ve düşük tümör alma oranları ile sınırlıdır ve daha geniş uygulamalarını engellemektedir.

Bu çalışma, mevcut modellere kıyasla daha fazla stabilite, daha düşük mortalite ve sabit tümör pozisyonu gösteren bir yüzeyel mesane kanseri modeli oluşturmak için yeni bir yöntem geliştirmeyi amaçlamaktadır. Mevcut model, hastalığın erken evrelerinde daha kesin bir temsilini elde ederek, önleyici ve terapötik müdahalelerin titiz değerlendirmesini geliştirmeye ve böylece mesane kanseri tedavisini ilerletmeye hazırdır.

Tüm hayvan deney protokolleri ve prosedürleri, Tianjin, Çin'deki Tianjin Tıp Üniversitesi Hayvan Deneyleri için Etik İnceleme Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay numarası SYXK: 2020-0010). Bu çalışma için altı ila sekiz haftalık dişi C57BL / 6J fareleri kullanıldı. Hayvanlar, 12 saatlik aydınlık-karanlık döngüsü, 21-25 °C arasında değişen sıcaklıklar, %30-%70 arasında ayarlanabilir nem seviyeleri ve aksi belirtilmedikçe yiyecek ve suya sınırsız erişim dahil olmak üzere kontrollü çevre koşulları altında barındırıldı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Hücre hazırlığı

1. Fare mesane kanseri hücre hattı MB49'u, optimal büyümeyi desteklemek için% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) kültürleyin.
2. Hücre kültürlerini standart koşullar altında% 5 CO₂ içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de tutun. Hücre sağlığını ve canlılığını sağlamak için ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
3. Standartlaştırılmış bir tripsin sindirim prosedürü kullanarak hücreleri hasat edin. Tripsin uyguladıktan ve kısa bir süre inkübe ettikten sonra hücreleri kültür şişesinden çıkarmak için hafifçe pipetleyin.
4. Tam hücre yoğunluğunu belirlemek için bir hemositometre kullanarak hasat edilen hücreleri sayın. Hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2 x 10³ / μL'ye yeniden süspanse ederek tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın. Hücre canlılığını korumak için bu süspansiyonu buz üzerinde tutun.

2. Hayvan hazırlama

1. Grup, fareleri (kafes başına 5 fare) ayrı ayrı havalandırılan polikarbonat kafeslerde barındırır.
2. Çalışmanın başlamasından önce farelerin 7 gün boyunca alışmasına izin verin.

3. Hayvan ortotopik tümör modeli üretimi

1. % 2.5'lik bir Avertin çözeltisi kullanarak intraperitoneal enjeksiyon yoluyla farelere anestezi uygulayın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
2. Fareler, derinlikte bir artış ile solunum hızında bir azalma, göz kapağı ve kornea reflekslerinin olmaması, kas tonusu ve refleks tepkilerinin azalması ve kuyruk tutamına tepki olmaması ile belirtildiği gibi ameliyat için uygun bir anestezi seviyesine ulaşana kadar bekleyin.
3. Prosedürü kolaylaştırmak için anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü pozisyonda konumlandırın.
4. Üretral kateterizasyon prosedürü için iğne stilesi çıkarılmış 24 G intravenöz kateter kullanın. Rahatsızlığı en aza indirmek ve düzgün yerleştirmeyi kolaylaştırmak için katetere bol miktarda yağlama uygulayın.
5. Fareyi sırtüstü pozisyonda tutarken, vulvar kıvrımların hemen arkasında ve vajinanın önünde yer alan üretrayı tanımlayın.
   1. Kasık kemiğinin altında gezinmek için üretraya 45 derecelik bir açıyla yaklaşarak kateterizasyona başlayın. Kateteri üretradan mesaneye yönlendirmek için daha sığ bir açıya ayarlayın.
6. Dirence karşı aşırı kuvvet uygulamaktan kaçının, çünkü bu üretra veya mesane delinmesine neden olabilir. Kateter içindeki idrarı kontrol ederek kateterin mesane lümeni içindeki konumunu onaylayın.
7. İdrarın mesaneden boşaltılmasını kolaylaştırmak için farenin alt karnına hafifçe baskı uygulayın. İşlemin sonraki adımlarına hazırlanmak için mesanenin tamamen boşaltıldığından emin olun.
8. 24 G intravenöz kateteri yavaşça mesanenin üst kısmına doğru itin. Kateterin ucunun mesanenin tepesi ile temas ettiğinden emin olun.
   1. Temas onaylandıktan sonra, kateteri serbest bırakın ve hafifçe geri çekilmesine izin verin. Stabiliteyi sağlamak ve yerinden çıkmayı önlemek için kateteri fareye göre sabit bir konumda tutun.
9. Modifiye edilmiş 34 G dağıtım iğnesini 24 G kateter boyunca yerleştirin. İğneyi mesanenin tepesine ulaşana kadar ilerletin.
   1. Yerleştirildikten sonra, mesanenin tepesinde lokalize bir mukozal yaralanma oluşturmak için iğneyi altı kez döndürün. Rotasyonu tamamladıktan sonra, iğneyi kateter boyunca dikkatlice geri çekin.
10. 30 G dağıtım iğnesini 1 mL'lik bir şırınganın üstüne bağlayın. İğne ve şırınga arasında güvenli bir bağlantı olduğundan emin olun.
    1. Bağlandıktan sonra, pistonu yavaşça geri çekerek önceden hazırlanmış 2 x 10³/μL MB49 hücreli süspansiyonu şırıngaya çekin. Hücre süspansiyonunun herhangi bir hava kabarcığı olmadan şırıngaya aspire edildiğini doğrulayın.
11. 30 G dağıtım iğnesini 24 G kateter boyunca yerleştirin. İğnenin kateter içinde düzgün şekilde hizalandığından ve sabitlendiğinden emin olun.
    1. Yerleştirildikten sonra, içeriği enjekte etmek için 1 mL şırınganın pistonuna basınç uygulayın (1. adımda hazırlanmıştır). İçeriğin önemli bir hacim azalması olmadan teslim edildiğinden emin olmak için piston üzerindeki basıncı 60 saniye boyunca sabit tutun.
    2. 60 saniye sonra, şırıngayı ve 30 G dağıtım iğnesini kateterden dikkatlice çekin.

4. Ameliyat sonrası izleme

1. Anestezi uygulanmış fareyi, doğru refleks geri dönene kadar bir ısıtma yastığı üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
2. Yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın gözetimsiz bırakılmadığından emin olun.
3. Hayvanı tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine iade etmeyin.

Submukozal enjeksiyonların etkinliği başlangıçta Tripan Mavisi uygulaması ile değerlendirildi. Enjeksiyondan sonra, boyanın submukozal tabaka içindeki dağılımı net bir şekilde görüntülendi ve enjekte edilen maddelerin kesin ve kontrollü bir şekilde verildiğini doğruladı (Şekil 1).

Tümör gelişimi titizlikle takip edildi. İmplantasyondan yaklaşık 14 gün sonra, mesane neoplazisinin göstergesi olan kriti...

Mesane kanseri ile ilgili araştırmalar, hem temel hem de uygulamalı araştırmalar için vazgeçilmez olan hayvan modellerine dayanmaktadır. Tümör büyüme ortamını daha iyi taklit etmek için, ortotopik mesane tümör modelleri, deri altı tümör modellerine kıyasla üstün bir yaklaşım sağlar¹¹.

Şu anda, ortotopik mesane kanseri modelleri deneysel amaçlara dayalı olarak iki ana tipe ayrılabilir: hastadan türetilmiş ...

Yazarlar rekabet eden çıkarları olmadığını beyan ederler.

Bu çalışma, Tianjin Belediye Sağlık Endüstrisi Anahtar Proje fonu tarafından desteklenmiştir (hibe no. TJWJ2022XK014), Tianjin Belediye Eğitim Komisyonu'nun Bilimsel Araştırma Projesi fonu (hibe no. 2022ZD069), Tianjin Üroloji Enstitüsü Yetenek Finansman Programı (hibe no. MYSRC202310), Tianjin Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesi Klinik Tıp Araştırma Projesi fonu (hibe no. 2023LC03), Tianjin Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesi Gençlik Fonu (hibe no. 2022ydey15) ve Tianjin Tıp Üniversitesi İkinci Hastanesi Üroloji Anabilim Dalı Yetenek Geliştirme Projesi (hibe no. MNRC202313). Sponsorlar, makalenin hazırlanmasında, gözden geçirilmesinde ve onaylanmasında rol oynamıştır.