BALB/c-nu Farelerde Hepatokarsinom Saptanması ve Sanleng Jiashen Formülünün Terapötik Etkisinin Araştırılması

Burada, Sanleng Jiashen formülünün ortotopik hepatosellüler karsinomlu BALB/c-nu fareleri üzerindeki terapötik ve vasküler inhibitör etkilerini araştırmak için adım adım protokolü sunuyoruz.

Karaciğer kanserinin ölümcüllüğü ve kimyasal ilaçlara karşı direnç, karaciğer kanseri için geleneksel bitkilerin etkili reçetelerinin araştırılmasını zorunlu kılmıştır. Tekrarlanabilir, manipüle edilmesi kolay ve karaciğer kanserinin patofizyolojik süreçlerini yüksek oranda taklit eden hayvan modelleri, etkili ilaç adaylarının başarılı bir şekilde taranması için ön koşuldur. Bu arada, güvenilir ilaç etkinliği değerlendirme göstergeleri ve araçları da anti-karaciğer kanseri ilaç araştırma ve geliştirmesinin garantisidir.

Sanleng Jiashen formülü, Sparganium stoloni erum, Buch içeren geleneksel Çin tıbbının temsili bir reçetesi. -Jambon. (Sanleng), Panax ginseng C. A. Mey. (ginseng), Rheum officinale Baill. (ravent) ve Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong), karaciğeri beslemek ve ısıyı temizlemek, toksinleri uzaklaştırmak ve karaciğer kanserini tedavi etmek için kan dolaşımını teşvik etmek için reçete edilir. Bu deneysel protokol, liyofilize Sanleng Jiashen formülünün hazırlanmasını ve BALB/c-nu farelerinde in-situ karaciğer kanserinin kuruluş sürecini açıklar. Histopatolojik boyama, kanser belirteçlerinin immünohistokimyasal tespiti, farelerin in vivo görüntülemesi ve civciv embriyosu koryoallantoik membran testi, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanseri dokusunun malign proliferasyonu üzerindeki inhibisyonu ve anti-anjiyogenez etkisini araştırmak için kullanıldı. Veriler, Sanleng Jiashen formülünün, tümör kütlesi hacminin azalması, patolojik hasarın iyileşmesi ve kanser belirteci ki67'nin daha düşük seviyeleri ile kendini gösteren karaciğer kanseri dokusunun malign proliferasyonuna etkili bir şekilde direnebileceğini göstermektedir.

Anjiyogenezin üstün inhibisyonu ayrıca Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanserinin ilerlemesini ve bozulmasını tedavi etme ve önleme potansiyeline sahip olabileceğini düşündürmektedir. Tüm deney şeması, bir karaciğer kanseri modelinin kurulması ve optimizasyonu için bir referans sağlayan fare karaciğer kanserinin tedavisinde geleneksel Çin tıbbı bileşenlerinin kapsamlı bir sürecini ve ayrıca karaciğer kanserini önlemek ve tedavi etmek için ilaçların araştırılması ve geliştirilmesini göstermektedir.

Karaciğer kanseri, karaciğerden kaynaklanan ölümcül bir kanserdir ve dünya çapında kansere bağlı ölümlerin en yaygın ikinci nedenidir¹. Amerika Birleşik Devletleri'nde ve bazı gelişmekte olan ülkelerde karaciğer hastalığı oranları yüksek seviyeler göstermektedir ve 2030 yılına kadar dünya çapında 1 milyondan fazla karaciğer kanseri vakası olabilir². Sigara, obezite ve alkol gibi sağlıksız yaşam alışkanlıkları ve hepatit B, hepatit C ve diğer virüslerin tahribatı nedeniyle, karaciğer kanserinin görülme sıklığı ve mortalitesi^{her geçen} yıl önemli ölçüde artmıştır. Farklı histolojik özelliklere ve kötü prognoza sahip heterojen bir malign tümör olan karaciğer kanseri, hepatosellüler karsinom, intrahepatik kolanjiokarsinom ve fibrolameller karaciğer kanseri dahil olmak üzere çok geniş bir insidans aralığına sahiptir⁴. Karaciğer kanseri genellikle ileri bir aşamada teşhis edilir ve birçok ileri hasta radyasyon tedavisi için aday değildir⁵. Multikinaz inhibitörü sorafenib, ilerlemiş karaciğer kanseri olan hastalar için oldukça kabul gören bir ilaçtır, ancak hastalar genellikle kısa bir süre içinde önemli direnç geliştirir⁶. Şu anda, sorafenib ile birlikte bağışıklık kontrol noktası inhibitörleri PD-1 ve PD-L1, karaciğer kanseri gelişimini kontrol etmede bir miktar ilerleme kaydetmiştir, ancak terapötik etki hala tartışmalıdır⁷.

Ortotopik karaciğer kanseri, karaciğer kanserinin erken bir türüdür: kanser hücreleri karaciğer dokusunun etrafına yayılmamıştır veya organlar arası metastaz meydana gelmez ve karaciğerin işlevi büyük ölçüde etkilenmez⁸. Ortotopik karaciğer kanseri genellikle belirgin rahatsızlık belirtileri göstermediğinden, bazı hastalarda hafif karaciğer ağrısı, yorgunluk ve diğer semptomlar olabilir⁹. Klinik pratikte, karaciğerin renkli Doppler ultrasonografisi ve gelişmiş bilgisayarlı tomografi incelemesi ile karaciğerde önemli yer kaplayan lezyonlar teşhis edilebilir¹⁰. Yayılmamış ve metastaz yapmamış lokal karaciğer kanseri ameliyatla çıkarılabilse de bazı cerrahi riskler ve hastalar için kaçınılmaz psikolojik yük vardır¹¹. Kemoradyoterapi, karaciğer kanseri hücrelerinin tamamını veya bir kısmını öldürebilir ve ilaç kullanan hastalarda uzun süreli immünosupresyon tedavinin etkinliğini etkileyebilir ve diğer hastalıkların riskini artırabilir¹². Bu nedenle, erken karaciğer kanserinin önlenmesi ve tedavisi için güvenli ve etkili ilaç tedavisi aramak, karaciğer kanserinin ilerlemesini ve bozulmasını engellemenin anahtarıdır.

Karaciğer kanserini tedavi eden Çin tıbbının prensibi, vücuttaki denge ve uyum kavramına dayanmaktadır. Çin tıbbı, karaciğer kanserini, karaciğeri etkileyen ve Qi olarak bilinen vücut enerjisindeki bir dengesizlik veya uyumsuzluk olarak görür¹³. Karaciğer kanseri için Çin tıbbı tedavisi, bitkisel ilaç, akupunktur, diyet tedavisi ve yaşam tarzı önerileri dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımları içerir. İlke, Qi'nin dengesini yeniden sağlamak, vücudun savunma mekanizmalarını güçlendirmek ve vücudun kendini iyileştirme yeteneğini teşvik etmektir^14,15. Geleneksel Çin tıbbında karaciğer kanseri "timpanitler" ve "karaciğer birikimi" kategorisine aittir. "Huangdi'nin İç Kanonu" semptomlarının ayrıntılı bir kaydına sahip olduğu sürece, karaciğer kanserine kan stazı ve Zhengqi eksikliği neden olur ve kan stazının giderilmesi, timpanitlerin ortadan kaldırılması ve anayasanın sağlamlaştırılması için vücut direncinin güçlendirilmesi ile tedavi edilir¹³. Sanleng hapı, Yuan hanedanlığında ünlü bir doktor olan Luo Tianyi tarafından yazılan "Weisheng Baojian" kitabından kaynaklanmıştır. Üç çeşit ilaçtan oluşur: Sparganium stoloni erum, Buch. -Jambon. (Sanleng), Ligusticum chuanxiong Hort. (Chuanxiong) ve Rheum officinale Baill. (ravent). Bu üç tür ilaç karaciğer meridyenine girebilir ve karaciğer kanserinin tedavisi için terapötik değere sahip olabilir¹⁴. Sanleng Jiashen formülü 16 g Sanleng, 16 g Panax ginseng C.A.Mey'den oluşur. (ginseng), 8 g ravent ve 2 g Chuanxiong (Şekil 1), karaciğeri tonlamak, ısıyı temizlemek, toksinleri ortadan kaldırmak ve kan dolaşımını teşvik etmek için reçete edilir. Bu bitkilerin kanser önleyici özelliklere sahip olduğuna ve tümör büyümesini azaltmaya, semptomları hafifletmeye ve genel refahı iyileştirmeye yardımcı olduğuna inanılmaktadır. Önceki in vitro deneylerde, Sanleng Jiashen formülü karaciğer kanseri hücrelerinin^{çoğalmasını engelleyebilir 15}. Bununla birlikte, Çin bitkisel bileşiklerinin karaciğer kanseri üzerindeki inhibitör etkisi verimli ve makul bir şekilde nasıl değerlendirilir? Bir BALB/c-nu fare in situ karaciğer kanseri modeli oluşturularak, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer kanseri ve anjiyogenez üzerindeki inhibitör etkisi esas olarak küçük hayvan canlı görüntüleme ve civciv embriyosu koryoallantoik membran testi ile araştırıldı.

Spesifik patojen içermeyen, 5 haftalık ve 18-22 g ağırlığındaki BALB/c-nu erkek çıplak fareler, Jilin Üniversitesi Transformasyon Tıp Fakültesi Hayvan Deney Merkezi'nde beslendi; besleme koşulları 22 °C-24 °C ve %40-%60 bağıl nem idi. Deney hayvanı lisans numarası SYXK(Ji) 2018-0006'dır ve deney süreci Jilin Üniversitesi Etik Kurul kural ve düzenlemelerine uygundur ve hayvan etiği onay numarası 20221228-01'dir.

1. Dondurularak kurutulmuş Sanleng Jiashen formülü^15'in hazırlanması

1. 16 g Sanleng, 16 g ginseng, 8 g ravent ve 2 g Chuanxiong'u akıllı bir kaynatma kabına koyun ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 294 mL deiyonize suda oda sıcaklığında 30 dakika bekletin. Isıttıktan ve kaynattıktan sonra 100 °C'de 30 dakika pişirmeye devam edin ve sıvıyı çift tıbbi gazlı bezden süzün (bkz. Kalıntıya 252 mL deiyonize su ekleyin, 100 °C'de 30 dakika pişirin ve sıvıyı çift gazlı bezle süzün.
2. Adım 1.1'deki süzüntüyü temiz bir paslanmaz çelik tabakta toplayın ve -80 °C'de 12 saat dondurun (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Adım 1.2'deki Sanleng Jiashen formülünü bir vakumlu dondurarak kurutucuya yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakınız) (soğuk tuzak sıcaklığı: -55 °C) ve Sanleng Jiashen formülünün dondurularak kurutulmuş tozunu elde etmek için 48 saat kurutun.

2. Lusiferazı stabil bir şekilde ifade eden HCCLM3 hücre hattının inşası¹⁶

1. 5 × 10⁵ hücreli 24 oyuklu plakaya (Malzeme Tablosuna bakınız) 1.0 mL HCCLM3 hücre süspansiyonu ekleyin ve tam bir ortamda kültür (% 10 fetal sığır serumu +% 1 penisilin-streptomisin çözeltisi + DMEM) (bkz. Malzeme Tablosu) bir hücre inkübatöründe 72 saat boyunca 3 μg / mL puromisin içeren (37 ° C,% 5 CO₂, Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Adım 2.1'de hücre süpernatantını atın ve hücreleri bir hücre inkübatöründe 1 dakika boyunca sindirmek için 100 μL% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). 300 μL tam ortam ekleyin ve yapışan hücreleri serbest bırakmak ve sindirimi sonlandırmak için bir pipet kullanın. Tüm hücre süspansiyonlarını toplayın ve 5 dakika boyunca 1.000 × g'da oda sıcaklığında 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Süpernatanı attıktan sonra, 1 mL tam ortam ekleyin ve pipetleyerek karıştırın.
3. Adım 2.2'den 4 × 10³ HCCLM3 hücresi/oyuğundan 100 μL hücre süspansiyonunu 96 oyuklu bir plakaya ekleyin ve 24 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültürleyin (37 ° C,% 5 CO₂, Malzeme Tablosuna bakınız).
4. Adım 2.3'teki 96 oyuklu plakalara 0.27 μL GFP lentivirus ekleyin ve 15 saat boyunca bir hücre inkübatöründe kültürleyin (37 ° C,% 5 CO₂, Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre süpernatantını atın, 100 μL tam kültür ortamı ekleyin ve 488 nm uyarma dalga boyunda ve 507 nm emisyon dalga boyunda bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüler elde edin (bkz. Malzeme Tablosu).
5. 2 mL GFP lentivirüsünü değiştirin ve 24 saat boyunca kültüre devam edin. 2 mL tam kültür ortamını GFP lentivirüsü olmadan 24 saat daha değiştirin.
   NOT: GFP lentivirüsünün HCCLM3 hücrelerine transfeksiyon verimliliği, ters floresan mikroskobu altında görüldüğü gibi %80 idi.
6. Adım 2.1'den 5 mL 2 × 10⁵ hücre süspansiyonunu 60 mm'lik bir Petri kabına ekleyin ve 24 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültürleyin. 64.5 μL lusiferaz ekleyin ve 15 saat boyunca bir hücre inkübatörde kültüre devam edin (37 ° C,% 5 CO₂, Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Süpernatanı atın ve hücreler Petri kabında% 90 birleşene kadar kültüre devam etmek için 5 mL tam ortam ekleyin. Hücre süpernatantını atın, 2 x 1 mL PBS ile yıkayın ve hücreleri bir hücre inkübatöründe 1 dakika boyunca sindirmek için 1 mL% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin (37 ° C,% 5 CO₂, bkz . 3 mL tam ortam ekleyin ve yapışkan hücreleri serbest bırakmak ve sindirimi sonlandırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Sonraki fare enjeksiyonu için tüm hücre süspansiyonlarını toplayın.
   NOT: Yeterli sayıda hücre elde etmek için, hücreler sürekli olarak geçirildi ve kültürlendi.

3. Karaciğer kanserinin yerinde ve tedavisinde BALB/c-nu çıplak fare modelinin kurulması 15

1. Adım 2.7'de lusiferaz ile transfekte edilmiş 100 μL 1 × 10⁷ HCCLM3 hücresi ve 100 μL matris yapıştırıcısı (Malzeme Tablosuna bakınız) 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 1 mL'lik bir pipetle hafifçe karıştırın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Matris yapıştırıcısının kürlenmesini önlemek için tüm çözelti hazırlama işlemi buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.
2. BALB/c-nu çıplak farelerin sol ve sağ koltuk altlarını iyodopin ile dezenfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu) ve alkolle deiyodize edin (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Adım 3.1'den itibaren 100 μL HCCLM3 hücreleri ve matris yapıştırıcı karışımını 1 mL tek kullanımlık şırınga ile BALB / c-nu çıplak farelerin sol ve sağ koltuk altlarına yavaşça enjekte edin.
   NOT: Yaklaşık 10 gün sonra, BALB/c-nu çıplak fareler, bilateral koltuk altı enjeksiyon bölgesinde yaklaşık 0,5^cm3'lük bir tümör kitlesi geliştirdi.
4. Adım 3.3'te BALB / c-nu çıplak fareleri% 1, 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyonu ile anesteziye tabi tutun. Her iki koltuk altının derisini oftalmik bir makas ve cımbızla kesin (bkz. Malzeme Tablosu) ve deri altı tümör kitlesini nazikçe soyun ve önceden soğutulmuş PBS tamponu içeren bir hücre kültürü kabına (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu) ve bir neşter ile 1 mm³ parçaya kesin (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: BALB / C-NU çıplak farelerin koltuk altı tümör kütlesi, tümör hücresi aktivitesini sürdürmek ve modelin başarı oranını artırmak için 0,5 saat içinde buz üzerinde toplanmalıdır. Örneklemenin sonunda, fareler servikal vertebraların çıkarılmasıyla öldürüldü. Tümörün nekrotik bir kısmı varsa, ortotopik kanser nakli sırasında enfeksiyonu önlemek için sadece balık beyazı tümörü bırakarak çıkarılması gerekir.
5. BALB/c-nu çıplak fareleri intraperitoneal olarak %1, 50 mg/kg sodyum pentobarbital ile anestezik hale getirin (bkz. Malzeme Tablosu), karnı iyotla dezenfekte edin (bkz. Malzeme Tablosu) ve alkolle deiyodize edin (bkz.
6. Karaciğeri ortaya çıkarmak için ksifoid işleminin 0,5 cm altında yaklaşık 1 cm uzaklıkta 45°'lik bir cerrahi kesi kesmek için oftalmik bir makas ve cımbız kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız), karaciğer dokusunu sıkmak için karaciğere hafifçe bastırın ve karaciğeri tartı kağıdı ile sabitleyin.
   NOT: Karaciğeri etkili bir şekilde açığa çıkarmak için farelerin kaburgalarının altına pamuklu çubuklar veya çubuklar yerleştirilebilir.
7. 10 mL'lik tek kullanımlık bir enjeksiyon iğnesi ile adım 3.4'te küçük bir tümör dokusu parçası alın ve tümör kitlesini karaciğer kapsülünün altına sabitlemek için karaciğere yaklaşık 0.5 cm paralel karaciğere implante edin ve iğneyi yavaşça çekin.
   NOT: Erimiş matris yapıştırıcısından 2 damla damlatmak için 1 mL tek kullanımlık bir şırınga kullanın, tümör kitlesini kazara kayma ve kanama olmadan gözlemleyin ve ardından cerrahi insizyonu dikin.
8. Cerrahi kesiyi 12 cm'lik iğne tutma forseps ve 6-0 cerrahi dikişlerle kapatın (bkz. Malzeme Tablosu). Enfeksiyonu önlemek için cerrahi bölgeye eritromisin göz merhemi (Malzeme Tablosuna bakınız) uygulayın. Fareleri ısıtılmış bir pedin üzerine yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve uyandıktan sonra ayrı kafeslerde saklayın.
9. Modellemeden sonraki ilk günden başlayarak, günde bir kez 14 gün boyunca 3.8. adımdan itibaren farelere gavaj yoluyla 7.5 mg / kg sorafenib ve Sanleng Jiashen formülünü (7.8 g / kg, 15.6 g / kg ve 31.2 g / kg) uygulayın. Model grubundaki farelere eşit miktarda normal salin uygulayın.

4. İn vivo görüntüleme değerlendirmesi

NOT: 14. günde, uygulamanın bitiminden 1 saat sonra canlı görüntüleme yapıldı.

1. Bilgisayarı ve in vivo görüntüleme cihazını açın (bkz. Malzeme Tablosu). Programı başlatmak için masaüstündeki Living Image simgesine çift tıklayın. Tüm IVIS sistemini başlatmak için kontrol panelindeki IVIS sistemini başlat'a tıklayın.
   NOT: Makine kendi kendine testi tamamladıktan sonra, kontrol panelindeki sıcaklık durum ışığı kırmızıdır. Sıcaklık düştükten ve ışık yeşile döndükten sonra yaklaşık 5-10 dakika bekleyin, görüntü alımı gerçekleştirilebilir.
2. Farelerin karnını alkolle dezenfekte edin ve tek kullanımlık bir şırınga ile vücut ağırlığının g'ı başına 10 μL D-lusiferin intraperitoneal olarak enjekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). % 1, 50 mg / kg sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon ile fareleri uyuşturun.
   NOT: D-lusiferin, steril PBS ile 15 mg / mL'ye seyreltildi.
3. Adım 4.3'teki anestezi uygulanmış fareleri gözlem kutusuna koyun ve kapıyı kapatın, kontrol panelinde pozlama süresini 30 s olarak ayarlayın: Mod seçimi: örnek türüne göre parlaklığı seçin, varsayılan olarak otomatik programı seçin ve görüntüleri elde etmek için al'a basın.
4. Canlı Görüntü Verilerini Kaydet'e tıklayın, Tüm Canlı Görüntü Veri Dosyalarını seçin ve bilgisayarın masaüstüne kaydedin.
5. Ana ekrandaki Canlı görüntüde Çık'a tıklayın. Sırayla kamera gücünü, görüntüleme aracı gücünü ve bilgisayar gücünü kapatın.
6. Görüntülemeden sonra, anestezi uygulanmış farelere servikal vertebra çıkığı ile ötenazi yapın (% 1 intraperitoneal enjeksiyon, 50 mg / kg sodyum pentobarbital).

5. Hematoksilen-eozin boyama¹⁷

1. Farelerin taze karaciğer dokusunu 4.7. adımdan itibaren 48 saat boyunca %4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve ardından paraformaldehiti yıkamak için her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez akan su ile durulayın (bkz. Malzeme Tablosu).
2. Adım 5.1'deki karaciğer dokularını sırayla %30 etanol, %50 etanol, %70 etanol, %95 etanol, %95 etanol ve susuz etanol içinde 1 saat boyunca dehidre edin (bkz. Malzeme Tablosu).
3. Susuz kalmış karaciğer dokularını 1 saat boyunca şeffaf hale getirmek için sırayla 5.2 ila %50 etanol, %50 ksilen, ksilen, ksilen ve ksilen adımına koyun (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Ksilen uçucu ve toksiktir, bu adım çeker ocakta gerçekleştirilir.
4. Parafin mumunu eritin ve sıcaklığı yaklaşık 55 °C'de tutun. Adım 5.3'teki karaciğer dokusu bloklarını, gömme için balmumu çözeltisi ile doldurulmuş bir parafin gömme makinesine ( Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
5. Adım 5.4'te farelerin karaciğer dokusunun gömülü balmumu bloğunu parafin dilimleme makinesinde sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), 5 μm kalınlığında dilimler halinde kesin, dilimleri 50 °C suda tamamen düz bir şekilde yerleştirin ve bir slaytla alın. Son olarak, 70 ° C'de 20 dakika kurutmak için biyolojik bir doku pişirme makinesine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Adım 5.5'teki 5 μm'lik bölümleri art arda 10 dakika boyunca ksilen, ksilen, susuz etanol ve susuz etanole batırın, ardından sırasıyla %95 etanol, %90 etanol, %80 etanol ve %70 etanol içinde 5 dakika bekletin ve son olarak mum alma işlemi için damıtılmış su ile yıkayın (bkz.
7. Susuz, 5 μm kalınlığında, pararafin balmumu karaciğer dokusu bölümlerini 8 dakika hematoksilen ile boyayın ve ardından akan su ile durulayın.
8. % 1 hidroklorik asit çözeltisinde 10 saniye boyunca farklılaştırın ve 30 dakika boyunca akan su ile durulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
9. % 0.5 eozin çözeltisi ile 1 dakika boya (Malzeme Tablosuna bakınız).
10. Dilimleri kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %95 alkol , %95 alkol , susuz etanol , susuz etanol , ksilen ve ksilen içine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
11. Nötr sakızla kapatın ve ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında fotoğraf çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

6. İmmünohistokimyasal boyama¹⁸

1. Adım 5.6'da fare karaciğerinin 5 μm'lik bölümlerine %1.5_H2O2 damlatın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin, ardından PBS ile 2 x 5 dakika yıkayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. Dokuyu sitrik asit çözeltisi ile 5 dakika onarın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
3. % 0.2 triton X-100 ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin, daha sonra% 0.5 triton X-100 ile oda sıcaklığında 4 dakika inkübe edin ve PBS ile yıkayın.
4. 15 dakika boyunca mühürlemek için keçi serumu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), ardından gece boyunca 4 ° C'de inkübe etmek için PBS (1:300) ile seyreltilmiş ki67 birincil antikorunu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
5. PBS (1:200) ile seyreltilmiş ikincil antikor ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın (bkz.
6. Gelişmekte olan solüsyonla 5 dakika lekeleyin ve çift damıtılmış su ile durulayın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
7. Hematoksilen ile 2 dakika tekrar boyayın,% 1 hidroklorik asit çözeltisinde 10 saniye ayırt edin ve 30 dakika akan su ile durulayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
8. Dilimleri kurutmak için her biri 5 dakika boyunca %95 alkol , %95 alkol , susuz etanol , susuz etanol , ksilen ve ksilen içine koyun (Malzeme Tablosuna bakınız).
9. Nötr sakızla kapatın ve ters çevrilmiş ışık mikroskobu altında fotoğraf çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

7. Civciv embriyosu koryoallantoik membran testi¹⁹

1. Beyaz tüylü tavuk yumurtalarını (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 2 saat bekletin ve dezenfekte etmek için alkol püskürtün. Kafatası matkabı ile hava haznesinde bir delik açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve yumurtaları hava haznesi yukarı bakacak şekilde 7 gün kuluçkaya yatırın (Kuluçka sıcaklığı 37.8-38.2 °C ve bağıl nem %65).
   NOT: Kuluçkanın ilk 3 günü boyunca, civciv embriyosu koryoallantoik zarının kabuğa yapışmasını ve sahte bir hava odası oluşturmasını önlemek için otomatik yumurta çevirme düğmesi açılır.
2. Zayıf/döllenmemiş yumurtaları yumurta aydınlatıcıya atın (Malzeme Tablosuna bakın). Sahte hava odasında bir kafatası matkabıyla bir delik açtıktan sonra (bkz. Malzeme Tablosu) göz cımbızıyla 1 x 1 cm'lik bir pencereyi dikkatlice soyun (bkz. Malzeme Tablosu).
   NOT: Yumurta kabuğunun civciv embriyosu koryoallantoik zarına düşmemesi gerektiğini lütfen unutmayın.
3. Kuluçka süresinin 8. gününde, kontrol grubu hariç sahte hava odasından her yumurtaya 100 μL tümör hücresi süspansiyonu (1 × 10⁶ hücre) ekleyin. İlaç gruplarına 100 μL sorafenib çözeltisi ve Sanleng Jiashen formülü ekleyin. Kontrol ve model gruplarında 100 μL PBS ekleyin.
   NOT: Tümör hücresi süspansiyonu, eşit hacimde HCCLM3 hücreleri ve matris yapıştırıcısından oluşur. İlaç konsantrasyonu şu şekilde ayarlanır: 7.5 mg / kg sorafenib ve Sanleng Jiashen formülü (7.8 g / kg, 15.6 g / kg ve 31.2 g / kg).
4. Pencereyi şeffaf pansumanla örtün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve alkol spreyi ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). 7 günlük inkübasyondan sonra, şeffaf pansumanı çıkarın ve 30 dakikalık bir sabitleme için sahte hava odasından 1 mL fiksatif (metanol: aseton = 1: 1) ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
5. Sabitleyiciyi 1 mL'lik bir şırınga ile atın. Oftalmik makasla sahte hava odasında ~ 5 x 5 cm koryoallantoik membranı kesin ve 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Kanlı civciv embriyo koryoallantoik membran için PBS ile durulayın. Civciv embriyosu için dokuya bağlı koryoallantoik membran, oftalmik makasla ayırın.
6. Adım 7.5'teki koryoallantoik membranı optik mikroskop altına koyun ve damarların fotoğrafını çekin (bkz. Malzeme Tablosu).

Şekil 2A'da gösterildiği gibi, BALB / c-nu farelerinin yerinde karaciğer kanseri modelini oluşturduk ve Sanleng Jiashen formülünün antitümör etkisini değerlendirdik. Şekil 2B, Sanleng Jiashen formülünün karaciğer tümörlerinin büyümesini önemli ölçüde baskılayabildiğini göstermektedir. Patolojik sonuçlar, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki tümör odaklarının çevre doku ile açık sınırlara, daha büyük tümör odaklarına, nodüler genişlemeye ve kompresyon büyümesine sahip olduğunu gösterdi. Bu arada, tümör dokusundaki tümör hücrelerinin düzenlenmesi, karaciğer lobüler yapısı olmadan düzensizdir. Uygun olarak, tümör hücreleri daha az heterojendir ve tümör gövdesinin etrafında büyük kan damarları vardır. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Sanleng Jiashen formülünün farklı konsantrasyonlarının tümör alanı azalmıştır, bu da in situ kanserli farelerin tümör boyutunun ilaç müdahalesinden sonra inhibe edildiğini gösterir (Şekil 2C). Şekil 2D'de bir tümör proliferasyon belirteci olan ki67'nin diğer immünohistokimyasal sonuçları, Sanleng Jiashen formülünün tümör proliferasyonunu büyük ölçüde inhibe edebileceğini de gösterdi. Sanleng Jiashen formülünün karaciğer tümörlerinin büyümesi üzerindeki etkisini daha sezgisel ve doğru bir şekilde araştırmak için, yerinde karaciğer kanserinin tümör kütlesi boyutunu görselleştirmek için küçük hayvan görüntülemesi kullanıldı. Şekil 3'te gösterildiği gibi, Sanleng Jiashen formülü karaciğer tümörlerinin hacmini belirgin bir şekilde azalttı. Sanleng Jiashen formülünün anjiyogenez fenotipini inhibe ederek karaciğer kanserinin büyümesini inhibe edip etmediğini daha fazla doğrulamak için, bu çalışmada Şekil 4A'ya göre civciv embriyo koryoallantoik membran testi yapılmıştır. Şekil 4B,C, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki yeni kan damarlarının sayısının kaotik dağılımla belirgin bir şekilde arttığını göstermektedir. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Sanleng Jiashen formülünün farklı konsantrasyonlarındaki küçük kan damarları belirgin şekilde azaldı ve bazı büyük kan damarları yetersiz kan dolaşımı ile kırıldı, bu da ilaç müdahalesinden sonra anjiyogenezin azaldığını gösterdi.

Şekil 1: Sanleng Jiashen formülünün ilaç bileşimi ve oranı. (A) Sanleng (16 g). (B) ginseng (16 g). (C) ravent (8 g). (D) Chuanxiong (2 g). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: BALB/c-nu farelerinde in situ karaciğer kanseri modelinin oluşturulması ve doku boyanması. (A) İn situ karaciğer kanseri modelinin şematik diyagramı. (B) Karaciğer kanseri dokusunun hacminin çıplak gözle görünümü. Mavi oklar karaciğerin tümör bölgelerini gösterir. (C) Karaciğer kanseri dokusunun patolojik boyanması. Mavi noktalı daireler karaciğer histopatolojik kesitlerindeki tümör alanını gösterir. Ölçek çubukları = 200 μm. (D) hepatosellüler karsinomun ki67 immünohistokimyasal boyanması. Ölçek çubukları = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: BALB/c-nu farelerinde ortotopik karaciğer kanserinin in vivo görüntülemesi. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Sanleng Jiashen formül grupları, BALB / c-nu farelerinde karaciğer tümörlerinin hacminde konsantrasyona bağlı bir azalma gösterdi; n = 5 olur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Civciv embriyosu koryoallantoik membran testinin şematik diyagramı ve sonuçları. (A) Tavuk embriyosu koryoallantoik membran testinin spesifik süreci. (B) Kan damarlarının sayısını görüntülemek. Ölçek çubukları = 0,2 mm. (C) Civciv embriyosu koryoallantoik membranın kan damarı alanının istatistiksel sonuçları. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubunun vasküler alanı önemli ölçüde artmıştır. Model grubu ile karşılaştırıldığında, Sanleng Jiashen formül grupları vasküler proliferasyonda konsantrasyona bağlı bir azalma gösterdi; n = 3 olur. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, ^###p < 0.001; Model grubu ile karşılaştırıldığında, p < 0.001. Veriler Tek Yönlü Varyans Analizi (ANOVA) ve ardından Tukey testi ile analiz edilmiştir. Veriler ortalama ± SD olarak sunulmuştur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sanleng Jiashen formülündeki Sanleng, ginseng, ravent ve Chuanxiong'un karaciğer kanseri tedavisi üzerinde farmakolojik etkileri olduğunu çok sayıda kanıt doğrulamıştır. Çalışmalar, Sanleng'in tümör hücresi istilasını ve metastazı önlemek, hücre apoptozunu indüklemek ve hücre döngüsünü ve tümör mikro çevresini düzenlemek için tümör hücrelerinin çoğalmasını ve büyümesini önemli ölçüde engelleyebileceğini göstermiştir²⁰. Sanleng'deki aktif bileşen olan kaempferolün, proliferasyonu inhibe ederek, otofajiyi teşvik ederek ve oksidatif stresi düzenleyerek mide kanseri²¹, prostat kanseri²² ve karaciğer kanseri^23'ün oluşumunu ve gelişimini engelleyebileceği kanıtlanmıştır. Myricetin, antitümör aktiviteye sahip önemli bir ginseng bileşiğidir. Myricetin'in apoptozu²⁴ indükleyerek mesane kanserinin büyümesini sınırlayabildiği ve hücre döngüsü durmasını²⁴ indükleyerek akciğer adenokarsinomunun proliferasyonunu durdurabildiği bilinmektedir. Daha da önemlisi, myricetin, anjiyogenezi inhibe ederek karaciğer kanseri hücrelerinin büyümesini kısıtlayabilir²⁵. Şu anda, myricetin, karaciğer koruması için Avrupa'da bir sağlık ürünü olarak pazarlanmaktadır ve ilaç değeri daha fazla araştırmaya değer.

Şu anda, ginsenosidler Rh2 ve Rg3, sadece tümör büyümesini, tümör anjiyogenezini, invazyonu ve metastazı inhibe etmekle kalmayıp aynı zamanda vücudun bağışıklığını da iyileştirebilen klinik antitümör ilaçlarda yaygın olarak kullanılmaktadır²⁶. Ana bileşeni olarak ginsenosid Rg3 içeren Shenyi kapsülü, tümör hastalarında Qi eksikliği semptomlarını iyileştirmek için pazarlanmıştır. Klinik olarak, Shenyi kapsülünün primer akciğer kanseri²⁷ ve karaciğer kanseri olan hastaların bağışıklığını düzenleyebileceğine, ileri karaciğer kanseri olan hastalarda kemoterapinin toksik ve yan etkilerini iyileştirebileceğine ve sorafenib direnci²⁸ olan hastalar için adjuvan tedavi olarak hizmet edebileceğine inanılmaktadır. Ek olarak, ginsenosid Rg3, tümör mikroçevresini yeniden şekillendirmek ve besinlerin tümör emilim yolunu etkili bir şekilde bloke etmek için anjiyogenezi inhibe edebilir ve anti-tümör bağışıklığını teşvik edebilir, böylece büyümesini ve metastazı inhibe edebilir²⁹.

Raventin iki etkili bileşeni olarak, emodin ve aloe emodin, raventin antitümör aktivite göstermesi için anahtar bileşiklerdir. Kanıtlar, emodinin kolon kanseri, karaciğer kanseri ve gırtlak kanseri hücrelerinin apoptozunu indükleyebileceğini göstermektedir in vitro ve in vivo PI3K / AKT ve MAPK sinyal yolları³⁰ aracılığıyla. İn vivo deneylerde, emodin, muhtemelen proliferasyonu inhibe ederek ve apoptozu indükleyerek tümör büyümesini inhibe etmek için karaciğer ve böbrek fonksiyonlarını iyileştirdi³¹. Bu arada, meme kanseri hücrelerinin ve vasküler endotel hücrelerinin ko-kültürü yoluyla, aloe emodinin müdahalesinden sonra, ko-kültür sistemindeki insan göbek damarı endotel hücrelerinin proliferasyonunun gözle görülür şekilde azaldığı ve aloe emodinin anjiyogenez yolunu inhibe ederek meme kanseri hücrelerinin proliferasyonunu inhibe edebileceğini gösterdi³². Tetrametilpirazin, karaciğer kanserinin çoklu ilaç direncini tersine çevirebilir ve mekanizması, P-gp³³ ekspresyonunun inhibe edilmesi ile ilgilidir. Ligusticum chuanxiong polisakkarit, hücre döngüsünün durması, tümör hücresi apoptozunun indüksiyonu ve tümör anjiyogenezinin inhibisyonu ile ilgili olan HepG2 hücreleri üzerinde belirgin bir inhibitör etkiye sahiptir ^34,35. Özetlemek gerekirse, Sanleng Jiashen formülü karaciğer kanseri tedavisinde büyük potansiyel uygulama değerine sahiptir. Bu protokol ayrıca Sanleng Jiashen formülünün BALB / c-nu farelerinde in-situ karaciğer kanserinin proliferasyonunu inhibe edebileceğini ve anjiyogenezi inhibe etmek için üstün farmakolojik aktivite gösterdiğini ön olarak doğruladı. Bu veriler, karaciğer kanseri tedavisinde Sanleng Jiashen reçetesinin potansiyel moleküler mekanizmasını daha fazla araştırmak için bir referans sağlar.

Tümör vasküler displazisi, kanser oluşumu ve gelişiminin önemli bir özelliğidir. Bu çalışmada, Sanleng Jiashen formülünün tümör anjiyogenezini inhibe edip edemeyeceğini değerlendirmek için civciv embriyosu koryoallantoik membran testi seçildi. İlk olarak, tavuk embriyosu ile yapılan deneyler ek hayvan etik onayı gerektirmez ve ucuzdur ve gerçekleştirilmesi kolaydır. İkincisi, tavuk embriyolarının bağışıklık sistemi, nispeten mükemmel bir tümör ilaç etkinliği değerlendirme modeli olan kuluçkadan sonraki 15 gün içinde gelişmez ve fiyat çıplak farelerinkinden daha düşüktür. Üçüncüsü, tavuk embriyosu allantoik membran testinin, optik koherens tomografi, konfokal mikroskopi, manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ve floresan görüntülemeyi birleştirerek sonuçları gerçek zamanlı olarak da tespit edebildiği bildirilmiştir. Küçük hayvanların in vivo görüntülemesinde, ister biyolüminesans ister floresan görüntüleme olsun, lüminesans sonuçları birçok faktörden etkilenir. Örneğin, biyolüminesans sürecinde, floresan yoğunluğu, enjekte edilen hücrelerin kalitesi, lusiferaz enjeksiyonunun zamanı ve model bölgesinin derinliği ile önemli ölçüde ilişkilidir. Bu nedenle, karaciğer kanserinin teşhisi ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi için MRG teknolojisi de gereklidir.

Özetle, bu makale, yerinde karaciğer kanseri için bir BALB/c-nu fare modeli oluşturdu ve geleneksel Çin tıbbı Sanleng Jiashen formülünün, anjiyogenezin inhibisyonu ile ilişkili olabilecek küçük hayvan görüntüleme ve civciv embriyo koryoallantoik membran deneyleri yoluyla yerinde karaciğer kanserinin çoğalmasını etkili bir şekilde inhibe edebileceğini doğruladı. Bu yerleşik yöntemler, karaciğer kanseri tedavisi için geleneksel Çin ilaçlarının hızlı ve verimli bir şekilde taranması için bir referans sağlar. Bununla birlikte, karaciğer kanserinin tedavisinde karmaşık bileşenler içeren Sanleng Jiashen formülünün maddi temeli ve moleküler mekanizmasının, kimyasal analiz tekniklerinin¹⁸ ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve yüzey plazmon rezonansı ^36,37 gibi moleküler etkileşim araştırma yöntemlerinin birleştirilmesiyle daha da açıklığa kavuşturulması gerekmektedir.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu çalışma, Çin Felsefe ve Sosyal Bilimler Vakfı (20VYJ070), Jilin İl Eğitim Departmanı Projesi (JJKH20230963KJ) ve Changchun Çin Tıbbı Üniversitesi'ndeki Xinglin Scholars Mühendislik Projesi'nin İkinci Partisi (QNKXJ2-2021+ZR25) tarafından desteklenmiştir.