Domuz Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin (piPSC'ler) Nöral Progenitör Hücrelere (NPC'ler) Farklılaşması

Bu protokol, domuz kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (piPSC'ler) türetilen nöral progenitör hücrelerin kimyasal farklılaşması ve kültürü için bir yöntemi tanımlar.

iPSC'den türetilmiş nöronlar, özellikle kemirgenler gibi klinik öncesi araştırmalarda kullanılan çoğu hayvan modeli, bulguları kliniğe çevirme kriterlerini karşılayamadığında, akıl hastalığında nörojenez ve erken fenotipik değişiklikleri incelemek için çekici in vitro modellerdir. İnsan olmayan primatlar, köpekler ve domuzlar, esas olarak insanlarla fizyolojik, genetik ve anatomik benzerlikleri nedeniyle, biyomedikal araştırma ve ilaç geliştirme amaçları için daha uygun modeller olarak kabul edilir. Domuz modeli, translasyonel sinirbilime özel ilgi göstermiş, güvenlik ve allotransplantasyon testlerini mümkün kılmıştır. Burada, domuz iPSC'lerinin oluşumu, nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) daha fazla farklılaşması ile birlikte açıklanmaktadır. Üretilen hücreler, RT-qPCR ile doğrulanan NPC belirteçleri Nestin ve GFAP'ı eksprese etti ve immünofloresan ile Nestin, b-Tubulin III ve Vimentin için pozitifti. Bu sonuçlar, rejeneratif ve translasyonel tıp araştırmaları için ilginç ve yeterli bir model olan büyük bir hayvan modelinden kimyasal inhibitörlerle in vitro indüksiyondan sonra NPC benzeri hücrelerin üretilmesine dair kanıtları göstermektedir.

Birçok araştırmacı insanlarda nörolojik hastalıkların hücresel mekanizmalarını ve patolojik gelişimini daha iyi anlamayı amaçlasa da, insanlarda manyetik rezonans görüntüleme (MRI) gibi invaziv olmayan tekniklerin kullanılmasının birçok sınırlaması vardır ve çoğu durumda yol izleme ve hücre içi kayıt gibi invaziv tekniklerin uygulanmasının imkansızlığı vardır¹. Donörlerin uzun süreli agonal durumları beyni etkileyebileceğinden ve çalışmalara müdahale edebileceğinden, ölüm sonrası iyi kalitede beyin dokusu elde etmek de zordur². Bu nedenle, translasyonel araştırmalarda onlarca yıldır kullanılan hayvan modellerinin bugüne kadar hem alakalı hem de sorgulanabilir olması gerekliliği vardır. Belirli bir hayvan modelinin seçimi, son zamanlardaki deneysel tasarım ve planlamada merkezi bir soru haline gelmekte ve tutarlı sonuçlar elde etmek için en uygun modelin seçiminin yalnızca farklı türlerin fizyolojisi hakkında değil, aynı zamanda daha da önemlisi, araştırmanın özel amaçları hakkında derin bilgi gerektirdiğini açıkça ortaya koymaktadır³.

Bununla birlikte, hayvan modelleri, bazı benzersiz gelişimsel, anatomik, moleküler ve genetik özelliklere sahip olduğu için insan beyninin yapısını ve gelişimini teslim ederken sıklıkla sınırlamalar sunar. Bu nedenle, kemirgenlerden elde edilen veriler gibi araştırmada kullanılan hayvanlardan toplanan verileri yorumlamak ve tahmin etmek biraz zordur¹.

Transgenik modeller de dahil olmak üzere günümüzde mevcut olan çok çeşitli hayvan modelleri arasında, insan olmayan primatlar, köpekler ve domuz eti gibi bazı büyük hayvanlar çok değerli kabul edilmektedir⁴. Organ büyüklüğü açısından insanlar ve domuz arasındaki fizyolojik, genetik ve anatomik benzerlikler, bu modellerin tanı ve tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesindeki önemini vurgulamaktadır. Özellikle, domuz modeli, güvenlik ve allotransplantasyon testlerini mümkün kılan translasyonel sinirbilime özel bir ilgi kazanmıştır. Kardiyovasküler, pulmoner, gastrointestinal hastalıklarla ilgili araştırmalarda ve özellikle yeni tedavilerin test edilmesinde kullanılmıştır (örneğin, kök hücrelerle yapılan rejeneratif tıp çalışmalarında^{5, 6}).

Bu bağlamda, in vitro modeller ve daha spesifik olarak indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) türetilmiş nöronlar, özellikle kemirgenler gibi klinik öncesi araştırmalarda kullanılan çoğu hayvan modeli, bulguları kliniğe tercüme etme kriterlerini karşılayamadığında, akıl hastalığında nörojenez ve erken fenotipik değişikliklerin incelenmesine izin vermek için çekici modellerdir.

NPC'lerin in vitro hastalık modellemesi için ilginç bir araç olduğu gösterildiğinden, iPSC'lerin kullanımı, özellikle iPSC'lerden türetilmiş nöral progenitör hücreler (NPC) kullanılarak in vitro hastalık modellemesine izin vererek sinirbilime büyük ölçüde fayda sağlamıştır ^7,8,9. iPSC'ler, Alzheimer hastalığı¹⁰, şizofreni¹¹ ve Parkinson hastalığı, Rett sendromu, spinal müsküler atrofi, Down sendromu ve amyotrofik lateral skleroz gibi diğer birçok hastalıktan Mungenast ve işbirlikçileri tarafından derlendiği üzere^{başarıyla oluşturulmuştur 2}. Klinik öncesi hayvan model sistemleri de iPSC'den türetilmiş NPC'leri fonksiyonel omurga greftleri olarak kullandığı, minimal veya hiç immün yanıt tespit edilmediği bildirilmiştir 12,13,14.

Burada, domuz iPSC'lerinin oluşumu ve varsayılan nöral progenitör hücrelere daha fazla kimyasal farklılaşma açıklanmaktadır (Şekil 1 ve Şekil 2). Üretilen hücreler, RT-qPCR ile doğrulanan NPC belirteçleri Nestin ve GFAP'ı eksprese etti ve immünofloresan ile Nestin, β-Tubulin III ve Vimentin için pozitifti. Bu sonuçlar, rejeneratif ve translasyonel tıp araştırmaları için önemli ve yeterli bir model olan büyük bir hayvan modelinden kimyasal indüksiyonlarla in vitro indüksiyondan sonra NPC benzeri hücrelerin üretilmesinin kanıtlarını göstermektedir.

Bu deneyler, São Paulo Üniversitesi Hayvan Bilimi ve Gıda Mühendisliği Fakültesi Hayvan Deneyleri Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (izin numaraları: 5130110517 ve 4134290716 numara).

NOT: Hücresel kültür ve inkübasyonları içeren tüm prosedürler kontrollü bir atmosferde (havada 38.5 °C ve %20 CO₂ , maksimum nem) gerçekleştirilir. Hücresel geçiş, ayrışma reaktifi ile 5 dakikalık inkübasyon ile gerçekleştirildi ve santrifüjlemeden sonra hücreler geri kazanıldı (300 x g).

1. Domuz fibroblastının iPSC'ye yeniden programlanması

1. Deney hazırlığı
   1. Aksi belirtilmedikçe, %10 fetal sığır serumu (FBS), 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler ve %1 antibiyotik (penisilin / streptomisin) ile desteklenmiş Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'undan (IMDM) oluşan fibroblast ve 293 kültür ortamını hazırlayın.
   2. % 20 serum replasmanı, 0.1 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 mM glutamin, 3.85 μM β-merkaptoetanol, 10 ng / mL bFGF ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş düşük ozmolaliteli DMEM / F12'den (insan embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin büyümesi için optimize edilmiş) oluşan iPSC kültür ortamını (yeniden programlama ortamı) hazırlayın.
   3. Gerektiğinde, fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler) bir T75 şişesine (10 mL) tohumlayın ve ertesi gün% 70-80 birleşme elde edin (T75 başına yaklaşık 6 x 10⁵ ). Ertesi gün, 200 μL 0.5 mg / mL mitomisin C ile 2 saat 30 dakikalık bir inkübasyon ile inaktive edin (önceden ortam değişikliği olmadan MEF'leri içeren T75'e mitomisin ekleyin).
   4. Kuluçka süresinden sonra, 5 dakika boyunca bir ayrışma çözeltisi ile inkübasyondan sonra hücreleri geri kazanın ve 1x10⁵ konsantrasyonda 6 oyuklu bir plakada daha önce jelatin ile kaplanmış kuyucuklara tohumlayın.
   5. Kuyuları, 37 ° C'de 20 dakika boyunca% 0.1'lik bir jelatin çözeltisi ile inkübe ederek kaplayın (tüm kuyuyu kaplamak için oyuk başına yaklaşık 1 mL jelatin çözeltisi) ve hemen aspire edin. Daha sonra çözeltiyi çıkarın ve kültür ortamı (oyuk başına 2 mL) ile değiştirin.
2. Transfeksiyon ve lentiviral üretim
   1. Kültür: T75 kültür şişesindeki 293 hücre, yaklaşık% 90 birleşmeye ulaşana kadar.
   2. Hücreleri ayırın ve antibiyotik kullanmadan yeni T75 şişesi başına 5 x 10⁶ hücre tohumlayın.
   3. Ertesi gün, transfeksiyon için şişe başına (T75) iki çözelti hazırlayın: 1: 1.5 mL IMDM (antibiyotik yok, serum yok) her vektörün uygun konsantrasyonu ile (12 μg OSKM; 1.2 μg TAT; 1.2 μg REV; 1.2 μg hgpm2 ve 2.4 μg VSVG_{2 ° nesil,}); ve 2: 1.5 mL IMDM (antibiyotik yok, serum yok) artı 36 μL lipofeksiyon reaktifi (veya üretici tarafından önerildiği gibi) ¹⁵.
   4. Çözeltileri karıştırın ve 15 dakika inkübe edin.
   5. Bu arada, 293 hücrenin ortamını değiştirin ve şişe başına% 10 FBS ile desteklenmiş sadece 7 mL IMDM ekleyin.
   6. Kuluçka süresinden sonra, her şişeye 3 mL lipofeksiyon reaktifi + plazmit ekleyin. Ortamı 6 saat sonra IMDM %10 FBS ile değiştirin (isteğe bağlı).
   7. 24, 48 ve 72 saatlik zaman noktalarında ortam (tam hacim - T75 başına 10 mL) toplayın. 0,45 mm PVDF filtre ile filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeden önce dengelemek için tartın.
   8. 48.960 x g'da 1 saat 30 dakika santrifüjleyin.
   9. Süpernatanı dökerek atın ve kalan içeriği (yaklaşık 200 μL) 4 ° C'de 1 saat inkübe edin.
   10. Viral peleti yeniden askıya alın, birkaç kez hassas bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyin ve viral çözeltiyi aliquot.
3. Iletim
   1. Tohum 2x10 6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına⁴ fibroblast. Moleküler analiz (örneğin, PCR) ve transdüksiyon kontrolleri (örneğin, GFP analizleri) (isteğe bağlı) için kuyuları dahil edin.
   2. Ertesi gün, 1 mL besiyerini çıkarın ve 1 μL heksadimetrin bromür (8 μg/mL) ve 50 μL viral solüsyon ekleyin.
   3. 3 ila 4 saat inkübe edin, ardından tam bir orta değişim (2 mL) (Gün 0).
   4. Hücreleri 5 gün boyunca kültürleyin, her 2 günde bir ortam değiştirin.
   5. Önceden% 0.1 jelatin kaplı ve MEF plakalarını madde 1.1.3'te açıklandığı gibi hazırlayın.
   6. Hücreleri ayırmak ve hücreleri yeniden programlama ortamında yeniden plakalamak için, 1 mL fosfat tamponlu tuzlu su çözeltisi (PBS) kullanarak kuyuları yıkayın. PBS'yi kaldırın.
   7. Oyuk başına 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   8. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 300 x g'da 5 dakika boyunca santrifüjleyin ve bunları 1-3 mL iPSC kültür ortamında yeniden süspanse edin.
   9. Hücreleri bir Neubauer odası veya bir hücre sayma ekipmanı kullanarak sayın ve bunları 1-2 x 10⁴ konsantrasyonda daha önce% 0.1 jelatin kaplı ve MEF kaplı kuyucuklara tohumlayın.
   10. iPSC kültür ortamını her 2 günde bir değiştirin.
   11. iPSC kolonileri (pasaj 0, P0'da) yeniden programlama periyodunun yaklaşık 10 gününde görünecektir. Koloniyi ve çevresindeki MEF'leri ayırmak için 26 G'lık bir iğne kullanarak morfolojik olarak tipik kolonileri (yuvarlak kenarlar ve yüksek nükleer-sitoplazma oranına sahip hücreler) manuel olarak seçin.
   12. Klonal kültür ve varsayılan iPSC hücre hatlarının karakterizasyonu için 10 veya 100 μL'lik bir pipet ucu kullanarak yeni kuyucuk başına 1 koloniyi ayrı ayrı aktarın.
4. Domuz iPSC geçişi
   1. Manuel pasaj ve koloni toplama
      1. Ters çevrilmiş bir mikroskobu temizleyin ve laminer akış başlığına aktarın.
      2. Mikroskobu ultraviyole (UV) ışıkla 15 dakika sterilize edin.
      3. Koloni transferinden önce önceden jelatin ve MEF kaplı kuyuları PBS ile yıkayın. PBS'yi kaldırın.
      4. 2 mL iPSC ortamı ekleyin.
      5. Kullanılacak kuyuda ilgilenilen koloniyi bulun.
      6. Bir insülin şırınga iğnesinin eğimini kullanarak, koloniyi çevredeki hücrelerden ayırın.
      7. Koloni küçükse, ortamı 10 μL'lik bir pipetle kenarlarında yukarı ve aşağı pipetleyerek kuyudan ayırın.
      8. Daha büyük bir koloni ise, iğne ile birkaç küçük parçaya bölün.
      9. Koloni veya koloninin parçalarını 10 μL'lik bir pipetle aspire edin.
      10. Yeni kuyuya aktarın.
   2. Klonal hatların enzimatik geçişi
      1. PBS kullanarak kuyuları yıkayın. PBS'yi kaldırın.
      2. Oyuk başına 1 mL ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
      3. Yaklaşık 100 μL hücreyi yeni bir kuyuya aktarın. Bu miktar farklı hücre hatları arasında değişebilir; Bu nedenle, izdihamın günlük görsel analizi şiddetle tavsiye edilir.

2. Domuz iPSC'lerinin NPC'lere indüksiyonu

1. Deney hazırlığı
   1. B27-Eksi Vitamin A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), 1 mM glutamin (10 μL/mL), penisilin-streptomisin (1 μL/mL) ile desteklenmiş %50 Nörobazal ortam ve %50 DMEM/F-12'den oluşan Nöral İndüksiyon Ortamı (NIM) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtrede süzün ve sırasıyla 0.1 μM ve 10 μM'lik bir nihai konsantrasyonda BMP sinyal inhibitörü LDN193189 ve ALK inhibitörü SB431542 ekleyin.
   2. 6 oyuklu bir plakanın kuyularını 1 mL matris çözeltisi ile kaplayın ve 37 ° C'de en az 30 dakika inkübe edin. Matris çözeltisini çıkarın ve iPSC kültürü için E8 ortamı ekleyin.
   3. İndüksiyon protokolünün 13. gününde, B27-Eksi Vitamin A (20 μL/mL), N2 (10 μL/mL), NEAA (10 μL/mL), 1 mM glutamin (10 μL/mL), penisilin-streptomisin (1 μL/mL) ile desteklenmiş %50 Nörobazal ortam ve %50 DMEM/F-12'den oluşan Nöral Genişleme Ortamı (NEM) hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μm'lik bir filtrede süzün ve 10 ng / mL'lik bir son konsantrasyonda olacak şekilde FGF2 ve EGF ekleyin.
2. İndüksiyon protokolü
   1. iPSC'ler %100 birleşmeye ulaşmadan bir gün önce, hücreleri yeni bir kuyuya aktarın (1:1 bölünmüş). 1 mL PBS ekleyerek kuyuyu yıkayın. PBS'yi kaldırın.
   2. 1 mL 0.5 mM EDTA ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   3. EDTA'yı çıkarın ve 1 mL E8 kültür ortamı ekleyin.
   4. Hücreleri kuyudan nazikçe yıkayın ve içeriği daha önce matris çözeltisi ile kaplanmış yeni bir kuyuya aktarın.
   5. Ertesi gün, kuyuları PBS ile yıkayın. PBS'yi çıkarın ve 2 mL NIM ekleyin.
   6. İndüksiyon ortamını 14 gün boyunca her gün değiştirin.
   7. 14. günde, PBS kullanarak kuyuları yıkayın. PBS'yi kaldırın.
   8. Oyuk başına 1 mL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
   9. Hücreleri konik bir tüpe aktarın ve hücreleri 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve 6 mL NEM ortamında yeniden süspanse edin.
   10. 60 μL (10 μL/mL) çözülme sonrası geri kazanım çözeltisi ekleyin ve çözeltinin 2 mL'sini her matris kaplı kuyucuğa aktarın.
   11. NEM ortamını ertesi gün ve ardından her iki günde bir değiştirin.
       NOT: İndüksiyon protokolünden geçen her kuyunun yeni bir NPC hattına yol açtığı kabul edilir. Bu nedenle, ilgili hücreleri karıştırılmamalıdır.

3. NPC geçişi

1. 1 mL PBS ile iyice yıkayın. PBS'yi kaldırın.
2. 1 mL hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin.
3. Kuyu hücrelerini nazikçe yıkayın ve içeriği konik bir tüpe aktarın.
4. Çözeltiyi 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 6 mL NEM ekleyin.
5. Peleti nazikçe homojenize edin ve 2 mL çözeltiyi daha önce matris çözeltisi ile kaplanmış yeni bir kuyucuğa aktarın.

piPSC'nin karakterizasyonu
Karakterizasyon, yeniden programlanmış hücrelerin pluripotentliğinin edinimini belirlemeyi amaçladı. Bu amaçla, embriyoid oluşumu, pluripotens belirteçleri için immünofloresan boyama ve gen ekspresyonu ve embriyoid cisimlere (EB'ler) spontan farklılaşma gerçekleştirildi.

Oluşturulan hücre kolonileri, piPSC'ler^{16, 17} için beklendiği gibi ...

Bu protokol sayesinde, fibroblastlar in vitro OCT4, SOX2, c-MYC ve KLF4'ün eksojen ekspresyonu kullanılarak yeniden programlandı. Yeniden programlanan hücreler, 20'den fazla geçiş için in vitro olarak tutuldu. Bu soylar kimyasal inhibitörler kullanılarak nöronal farklılaşmaya tabi tutulduğunda, nöronal progenitör hücrelerin belirteçleri Nestin ve GFAP'ı eksprese ettiler, RT-qPCR ile doğrulandılar ve immünofloresan ile Nestin, β-Tu...

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Prof. Kristine Freude, protokoller ve bilimsel tartışmalar konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 ve # 2017/02159-8), Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq # 433133/2018-0) ve Yüksek Öğretim Personelinin Geliştirilmesi Koordinasyonu (CAPES) (finansman kodu 001).