Наша лаборатория исследует метаболические изменения в сетчатке глаза и во всей центральной нервной системе, которые происходят с возрастом, а также при нейродегенеративных заболеваниях. Наша главная цель состоит в том, чтобы использовать эти результаты для определения новых терапевтических мишеней для лечения возрастных нейродегенеративных заболеваний. Обнаружение поглощения глюкозы в тканях сетчатки часто является дорогостоящим и трудоемким процессом, требующим сложных методов визуализации или даже радиоактивных веществ.
Мы разработали этот протокол, чтобы обеспечить новую технику ex vivo для измерения поглощения флуоресцентного аналога глюкозы в образцах сетчатки. Разработанный нами протокол обеспечивает простую и экономически эффективную стратегию измерения поглощения ex vivo флуоресцентных аналогов глюкозы всей интактной сетчаткой. Этот метод также является преимуществом, поскольку позволяет исследователям измерять несколько образцов одновременно.
Этот протокол позволит исследователям оценить изменения в поглощении сетчаткой флуоресцентных аналогов глюкозы, что поможет нам лучше понять, как сетчатка использует глюкозу в качестве энергетического субстрата как с возрастом, так и в здоровом и болезненном состояниях. Для начала приготовьте исходный раствор из пяти миллимоляров 6-NBDG в смеси 50% ДМСО и ПБС. Храните 500 микролитров аликвот раствора при температуре минус 20 градусов Цельсия.
Поместите на лед 50 миллилитровую коническую трубку, содержащую нейробазальную-А среду без глюкозы. Маркируйте 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки как «Глюкозное голодание», «Инкубация 6-NBDG», «Ультразвуковая обработка» и «Сбор образцов для пробного анализа». Добавьте 100 микролитров охлажденной среды Neurobasal-A в предварительно помеченные пробирки со льдом.
Питание на считывателе пластин. Настройте параметры планшета в программном обеспечении для чтения планшетов с помощью функции анализа флуоресцентной конечной точки с возбуждением 483 нанометра, излучением 550 нанометров и пороговым значением 530 нанометров. Разведите пятимиллимолярный стоковый раствор шести NBDG в среде Нейробазал-А для приготовления рабочего раствора 500 микромоляров и накройте его алюминиевой фольгой для защиты от света.
Нанесите 200 микролитров рабочего раствора в предварительно маркированные инкубационные пробирки 6-NBDG и накройте крышкой, как показано на рисунке. После выделения сетчатки от усыпленной мыши с помощью обрезанной передаточной пипетки или пинцета перенесите сетчатку в 1,5-миллилитровую пробирку, содержащую 200 микролитров нейробазальной-А среды для глюкозного голодания. Выдержите трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 20 минут.
Перенесите сетчатку в предварительно помеченную пробирку, содержащую 200 микролитров 500 микромолярных 6-NBDG в среде Neurobasal-A. Выдержите трубку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 60 минут. Чтобы подготовить стандарты 6-NBDG, маркируйте восемь пробирок микроцентрифуг объемом 1,5 мл как стандарты от одного до восьми.
Для стандартного пипетки пипеткой введите 32 микролитра 500 микромолярного стокового раствора 6-NBDG в маркированную пробирку. Затем добавьте в пробирку 368 микролитров Нейробазала-А Medium и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Накройте все трубки алюминиевой фольгой.
После 60-минутной инкубации 6-NBDG снимите трубки с водяной бани при температуре 37 градусов Цельсия. Чтобы промыть сетчатку, удалите раствор 6-NBDG с помощью пипетки, не нарушая ткани сетчатки, и добавьте на лед 500 микролитров свежей ледяной среды Нейробазал-А. Далее с помощью щипцов аккуратно перенесите сетчатку в ультразвуковые трубки, содержащие Нейробазал-А Медиум на льду.
С помощью небольших ножниц для рассечения разрежьте сетчатку на мелкие кусочки. Обрабатывайте каждую сетчатку ультразвуком в течение 5-10 секунд с амплитудой 10 и немедленно поместите трубку обратно на лед. Центрифугируйте образцы при 21, 130 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
Перелейте 100 микролитров надосадочной жидкости в 96-луночный планшет. Вставьте пластину в считыватель пластин. Выберите анализ конечной точки флуоресценции с указанными длинами волн.
Запустите анализ и сохраните результаты. После прогона пипетируйте образцы с 96-луночного планшета в предварительно помеченные пробирки для прокалывания. Используя предварительно разведенные стандарты белка для прокалывания пирса, добавьте по 10 микролитров каждого стандарта в двух экземплярах в 96-луночную прозрачную донную пластину.
Затем переложите в тарелку 10 микролитров образца. Добавьте 150 микролитров прокалывающего реактива во все лунки, содержащие стандарты или образцы. Накройте тарелку крышкой и перемешивайте в вибростенде на средней скорости в течение одной минуты.
Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение пяти минут. Вставьте планшет в считыватель планшетов и выберите конечную точку анализа поглощения с длиной волны 660 нанометров. Измерьте абсорбцию стандартов и образцов, сохраните результаты и постройте стандартную кривую для определения общего микрограмма белка в каждом образце.
Измерения флуоресценции глюкозы показали увеличение поглощения 6-NBDG в сетчатке мышей дикого типа после 30 минут инкубации, достигнув пика через 60 минут, с последующим снижением произвольных единиц через 90 минут. Добавление ингибитора GLUT1, bay 876, снизило поглощение 6-NBDG на 24%, что указывает на участие независимых от GLUT1 механизмов в сетчатке мышей дикого типа.
