Я изучаю механизмы гибели клеток при отслойке сетчатки, и моя цель — обеспечить прослеживаемость данных in vitro до экспериментов in vivo. В нашей команде мы продемонстрировали участие различных механизмов клеточной смерти во время дегенерации фоторецепторов. Существует множество описанных способов вызвать отслойку сетчатки у грызунов.
Этот протокол был разработан для решения двух задач: воспроизводимости и безопасности. Предоставление воспроизводимого и безопасного протокола при отслойке сетчатки обеспечит эффективность в такого рода исследованиях. Для начала установите нескошенный 10-миллиметровый металлический наконечник канюли 30-го калибра, закрепленный на шприце объемом 25 микролитров, на микроинжектор.
Чтобы вызвать долгосрочную отслойку сетчатки, используйте 2% гидроксипропилметилцеллюлозу или от 1% до 5% гиалуроната натрия. Загрузите приготовленный раствор в шприц. Далее нанесите одну каплю 0,5% тропикамида на один глаз крысы, находящейся под наркозом, чтобы получить мидриаз.
Нанесите одну каплю оксибупрокаина в оперируемый глаз. Для проведения операции используйте офтальмоскопический микроскоп, подключенный к ножному переключателю. Чтобы обнажить склеру, закрепите два подтягивающих веко швов на внешней четверти пальпебрального края на верхнем и нижнем веках.
Натяните швы, чтобы добиться мягкого выпуклости глаза. С помощью иглы 30-го калибра создайте склеральный канал через височную бульбарную конъюнктиву примерно в одном-двух миллиметрах от лимба роговицы. Наносите слезный гель в качестве интерфейса линзы глаза на протяжении всей процедуры.
Чтобы визуализировать пластину сетчатки, поместите на поверхность глаза плоскую контактную линзу диаметром восемь миллиметров. Используйте ножной переключатель микроскопа, чтобы сфокусироваться на плоскости сетчатки. Теперь вставьте канюлю вертикально через предварительно сформированный склеральный канал.
Медленно приближайтесь к сетчатке и мягко надавливайте на нее до тех пор, пока не будет наблюдаться отбеливание сетчатки. Сохраняйте стабильность наконечника во время инъекции через ретинотомию, образованную потоком инъекции После инъекции удалите наконечник из ретинотомии. Затем аккуратно извлеките всю канюлю из полости стекловидного тела, следя за тем, чтобы не задеть линзу.
Убедитесь, что красный зрачковый рефлекс изменен отслойкой сетчатки, не наблюдая за кровотоком в полости стекловидного тела. Снимите швы на веках, затем тщательно промокните любое кровотечение. Кратко оцените внутриглазное давление вручную.
Для послеоперационного ухода нанесите на прооперированный глаз глазную мазь с хлорамфеникол ретинолом. Затем введите один миллилитр 5% моногидрата глюкозы внутрибрюшинно. Вводят 0,9 миллиграмм на килограмм атипамезола подкожно.
Наконец, переведите животное в камеру с регулируемой температурой и следите за ним, пока оно не проснется. Успешная субретинальная инъекция была подтверждена прозрачной субретинальной жидкостью на оптической когерентной томографии и отсутствием субретинального кровоизлияния на фотографировании глазного дна. И отчетливая отслойка сетчатки наблюдалась в обеих модальностях.
Иногда наблюдались незначительные интравитреальные кровоизлияния, в первую очередь вблизи места инъекции, но не распространялись в субретинальное пространство.
