Этот протокол описывает оптимизированный метод хемилюминесценции на основе L-012 для обнаружения продукции АФК в режиме реального времени при обнаружении PAMP в тканях риса. Этот метод прост, стандартизирован и легко воспроизводим в строго контролируемых условиях. Продемонстрирует эту процедуру Он Ин, аспирант из моей лаборатории.
Для начала стерилизуйте очищенные семена риса 70% этанолом в течение одной минуты, затем 40% гипохлоритом натрия в течение одного часа. Промойте семена пять раз стерильной водой, чтобы удалить остатки хлора. В методе рисовой оболочки непосредственно поместите семена в стерильный стеклянный сосуд со средой Murashige и Skoog или MS.
Чтобы разместить семена методом листового диска, положите их на пластины MS на пять-семь дней, а затем пересадите в матрицу роста или почву. Выращивайте рассаду в комнате для выращивания с 12-часовым светом, 12-часовым темным фотопериодом. Разрежьте оболочку с 10-дневных рассад риса на трехмиллиметровые сегменты острым бритвенным лезвием или хирургическим лезвием для предварительной обработки за день до анализа АФК.
Поместите пять сегментов оболочки в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов. Срежьте листовые диски с четырех-шестинедельных рисовых растений с помощью биопсийного перфоратора с поршнем. Всегда обрезайте листовые диски от средней трети второго листа основного культиватора, чтобы уменьшить отклонение данных.
Затем поместите один листовой диск в отдельную лунку из 96-луночной микротитровальной пластины, содержащей 100 микролитров двойной дистиллированной воды, на 10-12 часов для предварительной обработки. Держите все листовые диски плавающими и обращенными вверх в лунках микротитровальной пластины для предварительной обработки воды, чтобы избежать отклонений, связанных со стороной листа. Приготовьте раствор для выявления, комбинируя 9,4 миллилитра 50 микромолярного Tris Hcl, 400 микролитров раствора L012, 100 микролитров пероксидазы хрена и 100 микролитров Flg22.
Добавьте в лунки 200 микролитров раствора. Запустите программное обеспечение и нажмите кнопку экспериментов, чтобы создать новый протокол или использовать существующий протокол. Нажмите «Процедура» во всплывающем окне, чтобы настроить пластину, и выберите скважины из пластины, которые необходимо контролировать.
Нажмите кнопку start kinetic и установите время выполнения на 30 минут или больше, в зависимости от экспериментальных требований. Выберите минимальный интервал, чтобы получать показания как можно чаще. А для времени интеграции выберите одну секунду или дольше в зависимости от интенсивности сигнала.
Нажмите «Подтвердить», затем «ОК», чтобы подтвердить настройки, затем нажмите «Обнаружить новую пластину» во всплывающем окне и подождите, пока программное обеспечение не предложит диалоговое окно загрузочной пластины. Осторожно удалите двойную дистиллированную воду из лунок, содержащих предварительно обработанные ткани, избегая повреждения тканей или высыхания. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить 200 микролитров раствора в лунки, содержащие ткани.
Поместите тестируемую пластину на носитель и начните обнаружение. Для индуцирования АФК с помощью Flg22 использовались листовые диски и трехмиллиметровые ножны. Генерация АФК контролируется в течение 35 минут.
Столбцы обозначают средние значения стандартных отклонений, рассчитанные на основе пяти технических повторов. В рисе увеличение производства АФК было впервые обнаружено через одну-две минуты, достигло пика через 10-12 минут и вернулось к исходному уровню примерно через 30-35 минут. Общее количество АФК рассчитывалось по кривой.
Чтобы получить общее количество значений ROS, примените формулу к соответствующим наборам данных, чтобы вычислить ROS, сгенерированные за каждый интервал времени, которые можно объединить, применив сумму формулы для расчета общей сгенерированной суммы. Одно отверстие или две половинки листового диска помещали в лунки 96-луночной микротитровальной пластины, предварительно обработанной 100 микролитрами двойной дистиллированной воды в течение 10-12 часов, а затем обрабатывали Flg22 для индукции АФК. Значения показаний двух образцов половинного диска намного выше, чем у всего листового диска.
В среднем, общие значения из двух образцов полудиска почти в 1,6 раза выше, чем для всего листового диска, что пропорционально длине края, а не площади образцов. Этот результат подтверждает, что АФК в основном генерируются в клетках в месте раны. Пытаясь выполнить эту процедуру, работайте с тканями осторожно и не делайте лишних надрезов, которые могут быть источником вариации данных.
Этот метод может быть применен к любым другим физиологическим процессам, продуцирующим АФК в тканях растений.
