Questo protocollo descrive un metodo di chemiluminescenza ottimizzato basato su L-012 per rilevare la produzione di ROS in tempo reale dopo l'elicitazione di PAMP nei tessuti di riso. Questo metodo è semplice, standardizzato e altamente riproducibile in condizioni saldamente controllate. A dimostrare questa procedura sarà On Ying, uno studente di dottorato del mio laboratorio.
Per iniziare, sterilizzare i semi di riso decorticati con etanolo al 70% per un minuto, quindi con ipoclorito di sodio al 40% per un'ora. Risciacquare i semi cinque volte con acqua sterile per rimuovere il cloro residuo. Nel metodo della guaina di riso, placcare direttamente i semi nel recipiente di vetro sterile con Murashige e Skoog o MS medium.
Per placcare i semi nel metodo del disco fogliare, placcarli su piastre MS per cinque o sette giorni e poi trapiantarli nella matrice di crescita o nel terreno. Coltiva le piantine in una stanza di crescita con un periodo di luce di 12 ore, un periodo di foto scure di 12 ore. Tagliare la guaina da piantine di riso di 10 giorni in segmenti di tre millimetri con una lama affilata o una lama chirurgica per il pretrattamento un giorno prima del test ROS.
Posizionare cinque segmenti di guaina in un singolo pozzetto di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di acqua bidistillata per 10-12 ore. Tagliare i dischi fogliari da quattro a sei settimane di piante di riso usando un punzone bioptico con uno stantuffo. Tagliare sempre i dischi foglia dal terzo centrale della seconda foglia della fresatrice principale per ridurre la variazione dei dati.
Quindi, posizionare un disco fogliare in un pozzetto individuale di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti contenente 100 microlitri di acqua bidistillata per 10-12 ore per il pretrattamento. Mantenere tutti i dischi fogliari galleggianti e rivolti verso l'alto nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per il pretrattamento dell'acqua per evitare variazioni associate al lato fogliare. Preparare la soluzione di elicitazione combinando 9,4 millilitri di 50 micromolari Tris Hcl, 400 microlitri di soluzione di L012, 100 microlitri di perossidasi di ravanello equino e 100 microlitri di Flg22.
Aggiungere 200 microlitri di soluzione di elicitazione ai pozzetti. Avviare il software e fare clic sul pulsante esperimenti per creare un nuovo protocollo o utilizzare un protocollo esistente. Fare clic sulla procedura nel popup per impostare la piastra e selezionare i pozzetti dalla piastra da monitorare.
Fare clic su start kinetic e impostare il runtime su 30 minuti o più, a seconda dei requisiti sperimentali. Selezionare l'intervallo minimo per ottenere le letture il più frequentemente possibile. E per il tempo di integrazione, scegli un secondo o più a seconda dell'intensità del segnale.
Fare clic su convalida, seguito da OK per confermare le impostazioni, quindi fare clic su rileva la nuova piastra nel popup e attendere che il software richieda la finestra di dialogo della piastra di carico. Rimuovere con cura l'acqua bidistillata dai pozzetti contenenti i tessuti pretrattati, evitando danni ai tessuti o disseccamenti. Utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 200 microlitri della soluzione di elicitazione ai pozzetti contenenti i tessuti.
Posizionare la piastra da testare sul supporto e iniziare il rilevamento. Per indurre ROS da Flg22, sono stati utilizzati dischi fogliari e guaine lunghe tre millimetri. La generazione di ROS viene monitorata per 35 minuti.
Le barre indicano le medie delle deviazioni standard calcolate da cinque ripetizioni tecniche. Nel riso, l'aumento della produzione di ROS è stato rilevato per la prima volta in uno o due minuti, ha raggiunto il picco di 10-12 minuti ed è tornato alla linea di base in circa 30-35 minuti. La quantità totale di ROS è stata calcolata dalla curva.
Per ottenere la quantità totale di valori ROS, applicare la formula ai set di dati corrispondenti per calcolare il ROS generato in ogni intervallo di tempo, che può essere combinato applicando la somma della formula per calcolare l'importo totale generato. Un singolo foro o due metà di un disco fogliare sono stati posti nei pozzetti di una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti pretrattata con 100 microlitri di acqua bidistillata per 10-12 ore e quindi trattata con Flg22 per l'induzione ROS. I valori di lettura dei due campioni di mezzo disco sono molto più alti di quelli dell'intero disco fogliare.
In media, i valori totali dei due campioni di mezzo disco sono quasi 1,6 volte superiori a quelli dell'intero disco fogliare, che è proporzionale alla lunghezza del bordo, non all'area dei campioni. Questo risultato supporta che i ROS sono generati principalmente nelle cellule nel sito della ferita. Quando si tenta di eseguire questa procedura, operare con i tessuti delicatamente e non fare ulteriori tagli che potrebbero essere una fonte di variazione dei dati.
Questo metodo può essere applicato a qualsiasi altro processo fisiologico che produce ROS nei tessuti vegetali.
