Успешное создание мышиной модели недееспособности ASCJ расширяет простую модель животного с инвалидностью голеностопного сустава и предоставляет новые концепции для изучения клинических заболеваний стопы. Мы создали модель на животных, которая больше соответствует реальной клинической ситуации, которая может быть использована для дальнейших исследований по диагностике и лечению заболеваний стопы. За неделю до эксперимента подвергните мышей тренировке баланса и походки, переходя от одного конца бревна или U-образной трубы к другому, не останавливаясь.
После обезболивания и удаления волос на голеностопном суставе правых задних конечностей мыши продезинфицируйте открытые участки кожи йодным тампоном. Перенесите мышь в операционную микрохирургического животного с помощью стерильной хирургической прокладки. Для поперечной шейной и передней групп талофибулярных связок сделайте семимиллиметровый косой вниз продольный разрез скальпелем на коже над правым голеностопным суставом.
И прощупайте микроскопическими прямыми щипцами в передней части голеностопного сустава. Обеспечив обнажение передней талофибулярной связки у нижней границы тела таранной кости и малоберцовой кости, аккуратно разрежьте ее скальпелем. Разделите длинное и короткое малоберцовые сухожилия, а также сухожилия длинного разгибателя пальцев.
Обнажите шейную связку, и разрежьте ее скальпелем. Для поперечной шейной связки плюс группа дельтовидных связок сделайте восьмимиллиметровый вертикальный разрез на медиальной коже правого голеностопного сустава и тупо отделите ДЛ от медиальной лодыжки, чтобы разрезать ее. Затем разрезают шейную связку, как было показано ранее.
Для бутафорской группы проведите бутафорскую операцию на правом голеностопном суставе. После промывания разреза стерильным физиологическим раствором зашивают хирургической капроновой нитью 5-0 с последующей дезинфекцией зашитого разреза тампоном йода. Как только отек углового сустава уменьшится через две недели после операции, тренируйте мышей в ротационном тренажере для снятия усталости мышей в течение одного часа каждый день.
Для испытания балансиром зажмите круглый деревянный луч, наклоненный под углом 15 градусов, одним концом с помощью зажима для штатива для фотографии, а другой конец поместите на рабочую поверхность, соединенную с закрытой кассетой. За неделю до операции выполните тренировку на бревне, чтобы убедиться, что мыши плавно переходят от одного конца балки к другому. Считайте, что мышь прошла тест, если она проходит через луч дважды за 60 секунд без паузы.
После каждого испытания опрыскивайте балку 75%-ным спиртом, чтобы остаточный запах предыдущей мыши не повлиял на следующую. Выполните тест балансирной балки и запишите среднее время, за которое каждая мышь проходит балансир два раза подряд. И количество соскальзываний правой задней ноги с балки, как зависимые переменные.
Для анализа футпринта поместите U-образный пластиковый канал на экспериментальный стол и соедините один конец пластикового канала с закрытой кассетой. Положите обычную пигментную бумагу в канал. Затем возьмитесь за мышь обеими руками и равномерно покрасьте переднюю и заднюю лапки нетоксичным красным и зеленым пигментом.
Теперь поместите нарисованную мышь на один конец канала и позвольте ей переместиться на другой конец кассеты. Возьмите пигментированную бумагу со следами, отметьте ее и дайте высохнуть в проветриваемом и затененном помещении. Опрыскивайте U-образный пластиковый канал 75%-ным спиртом после того, как каждая мышь проходила мимо, чтобы остаточный запах предыдущей мыши не повлиял на следующую.
Выберите три последовательных четких контура мыши на каждой бумаге. С помощью линейки измерьте длину шага посадочного места правой ноги мыши и ширину шага между левым и правым посадочными местами. Используйте микроскопический пинцет и ножницы, чтобы удалить лишние мягкие ткани вокруг лодыжки.
Затем поместите образцы в центрифужную пробирку, содержащую 10%-ный раствор для декальцинации ЭДТА, и отметьте различные группы. Затем поместите центрифужную пробирку на встряхивающий стол для удаления накипи. Меняйте раствор для удаления накипи один раз в день и определяйте степень декальцинации образцов.
После одного месяца декальцинации обезвоживайте образцы градиентным спиртом, а затем используйте N-бутанол в течение восьми часов для очистки. Наконец, очищенные образцы погружают в парафин в корончатом положении для заделки. Перед разделкой переложите образцы из холодильника с температурой четыре градуса Цельсия в морозильную камеру с температурой минус 20 градусов Цельсия примерно на 10 минут, чтобы облегчить резку всех плоскостей.
Закрепите образцы на микротоме и разрежьте их толщиной в шесть микрометров. В то же время с помощью микроскопа наблюдают, были ли образцы срезаны на ожидаемом уровне для легкого проникновения иглы шприца в костную ткань. Нарезав два-три полных парафиновых участка подряд, перенесите их в таблеточную машину, установленную на 40 градусов Цельсия, для полного расширения.
Затем удалите парафиновые срезы с помощью предметного стекла. Наконец, отметьте слайды группами и номерами. Наблюдать интактную структуру сустава ASCJ под микроскопом.
Поместите секции в инкубатор, установленный при температуре 60 градусов Цельсия, на 40-50 минут. Затем трижды удалите срезы ксилолом, как описано в рукописи. Поместите очищенные от воска срезы в 100%-ный этанол дважды на три минуты, а затем 90%-ный и 80%-ный этанол на пять минут каждый.
Затем промойте срезы двойной дистиллированной водой в течение пяти минут. После замачивания в гематоксилине в течение одной минуты промойте срезы двойной дистиллированной водой до тех пор, пока они не станут бесцветными. Замочите срезы в растворе дифференциации этанола с 1%-ной кислотой на 30 секунд и промойте их дважды дистиллированной водой.
После того, как срезы окрашены 1%-ным раствором аммиака и промыты двойной дистиллированной водой, окрасьте образцы раствором для окрашивания эозином в течение одной минуты. А затем поместите их в 95% и 100% этанол последовательно в течение одной минуты каждый. Наконец, обработайте срезы ксилолом четыре в течение одной минуты.
Высушите срезы на воздухе и накройте их покровным накладкой, предварительно наклеив каплю нейтральной смолы на образцы на предметных стеклах. Затем сделайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в ярком поле в 5 и 20 раз. Замочите окрашенные гематоксилином и аммиаком участки в 0,05%-ном быстром зеленом цвете на две минуты.
Затем следует замачивание срезов в 1%-ном растворе уксусной кислоты на 30 секунд и 0,1%-ном сафранине в течение пяти минут. Затем обработайте предметные стекла этанолом и ксилолом, как было показано ранее. Делайте снимки с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа в ярком поле с 5X и 20X.
После трех дней, восьми недель и 12 недель операции разорванным группам связок потребовалось значительно больше времени, чтобы пройти через бревно, чем фиктивной группе. До операции длина шага правой задней лапы была сопоставима между тремя группами мышей. Тем не менее, через 12 недель после операции длина шага была короче в группе с разрезом связок, чем в группе с фикцией.
До операции время тепловой ноцицептивной реакции ног мышей во время активности было одинаковым среди трех групп мышей. После операции мыши в группе с разрезанными связками показали более длительное время реакции по сравнению с фиктивной группой. В ASCJ правой задней стопы при разрыве связочных групп выявлены шероховатые поверхности, накопление остеофитов, дегенеративные изменения.
И значительно более высокая объемная доля костной ткани, чем в фиктивной группе. Хрящевой слой ASCJ в группе разреза связок показал разрыв и снижение количества хондроцитов. Кроме того, оценки Международного исследовательского общества Малкина и Остеоартрита у мышей с ампутацией связок были значительно выше, чем у фиктивной группы.
Коллаген второго типа в слое суставного хряща ASCJ правой задней ноги был более однородным и выше, чем у двух групп мышей с разорванными связками. Это исследование может быть использовано для диагностики и лечения нестабильности голеностопного сустава, а также является экспериментальным эталоном для клинических методов лечения этого заболевания.
