Высокая пропускная способность изготовления монодисперсных микрогелевых строительных блоков для микропористых отожженных каркасов частиц обеспечивает улучшенный контроль пористости каркасов. Это может повлиять на размер пор и последующие результаты интеграции тканей. Этот протокол использует высокопроизводительный микрофлюидный подход для генерации больших объемов монодисперсных микрогелей, которые не могут быть достигнуты с помощью других методов, таких как микрофлюидика с фокусировкой потока, периодная эмульсия и электромолы.
Полученные микрогели могут быть сформированы в микропористые отожженные каркасы частиц, которые выгодны для применения в регенеративной медицине из-за пористости клеточного масштаба, которая обеспечивает быструю ткань и рост. Начните с подготовки одного стеклянного слайда на микрофлюидное устройство PDMS. Используйте ленту, фильтрованный воздух или промывку изопропиловым спиртом, чтобы удалить пыль с слайда.
Поместите стеклянный слайд в конструкцию устройства PDMS рядом друг с другом на крышке пластины с 96 лунками и поместите его в плазменный очиститель. Закройте дверцу и клапан воздушного потока и включите вакуумный насос. Дайте ему поработать не менее 30 секунд, затем выключите его.
Подключите газовую трубку кислородного баллона к клапану воздушного потока. Дайте плазменной камере заполниться кислородом в течение 30 секунд, затем выключите кислород и закройте клапан воздушного потока. Включите вакуумный насос и установите высокий уровень радиочастоты.
Подождите, пока камера приобретет фиолетово-розовый цвет и дайте пройти 30 секунд. Когда таймер погаснет, выключите плазму и вакуум, затем медленно откройте клапан воздушного потока, чтобы освободить вакуум. Извлеките лоток из плазменного очистителя.
Осторожно переверните устройство PDMS на стеклянный слайд, чтобы связать их. По мере того, как происходит склеивание, обратите внимание на небольшую разницу в прозрачности PDMS. Для достижения наилучших результатов храните связанные устройства при температуре 60 градусов Цельсия непосредственно перед использованием.
Подготовьте обработку поверхности, разбавляя pfocts и масло Novec и используйте один миллилитр для трех-четырех устройств. Перенесите объем на шприц в один миллилитр и прикрепите иглу 25 калибра. Вырежьте кусок трубки Tygon размером от 10 до 12 сантиметров на устройство.
Вырежьте кусок трубки PEEK примерно на один дюйм в длину. Вставьте пару миллиметров трубки PEEK в конец трубки Tygon, чтобы игла не проколола входные отверстия трубки Tygon. Выньте устройства из нагреваемой камеры и вставьте не-PEEK конец трубки Tygon в водное входное отверстие.
Вставьте иглу шприца для обработки поверхности в трубку PEEK и закройте выходное отверстие масляной камеры. Вводите процедуру медленно и убедитесь, что она заполняет устройство без пузырьков. Подождите, пока сначала заполнятся водные камеры, затем меньшие каналы, а затем масляная камера.
Снимите трубку Tygon с устройства. После того, как устройство будет заполнено, дайте ему отдохнуть в течение 10 минут при комнатной температуре. Наполните пятимиллилитровой шприц только маслом и прикрепите иглу 25 калибра.
Аспирировать обработку поверхности из устройства через входные и выходные отверстия. Вставьте трубку Tygon в водный вход. Вставьте шприц с маслом в трубку PEEK и промывайте каждое устройство маслом.
Аспирируйте масло из устройства. Повторите промывку масла дважды и снимите трубку Tygon. Вставьте не-PEEK конец трубки Tygon во входные отверстия микрофлюидных устройств.
Вставьте оставшийся кусок трубки Tygon без трубки PEEK на конце в розетку микрофлюидного устройства. Добавьте не менее трех миллилитров масла к пятимиллилитровому пластиковому шприцу и прикрепите его к игле 25 калибра. Осторожно вставьте иглу в трубку PEEK на одном из входов Tygon.
Аккуратно промойте трубку и устройство маслом. Соберите масло с выходного отверстия в коническую трубку. Повторите промывку масла на другом входе Tygon.
Установите шприцевые насосы на желаемые скорости потока. Подключите шприц, содержащий поверхностно-активное вещество, к входному отверстию масла с помощью иглы 25 калибра и осторожно дозируйте достаточно масла для загрунтовки трубки и масляного канала микрофлюидного устройства. После того, как устройство и масляные входы будут установлены, добавьте 0,5 миллилитра масла в новый пятимиллилитровой шприц, который будет содержать предшественник геля.
Используйте это небольшое количество масла, чтобы помочь промыть раствор предшественника через микрофлюидное устройство. В конической трубке соедините 1,5 миллилитра магистрального раствора ПЭГ и 1,5 миллилитра поперечного раствора. Вихрь в течение 30 секунд и быстро перенесите комбинированный раствор предшественника геля на пятимиллилитровой шприц.
Соедините шприц с раствором-предшественником геля с водным входом с помощью иглы 25 калибра. Аккуратно дозируйте достаточное количество раствора, чтобы загрунтовать трубку и водный канал. Зажмите шприцы на шприцевых насосах и нажмите.
Ищите частицы одинакового размера из каналов. Соберите микрогели с выходного отверстия в коническую трубку. Как только гелеобразование будет завершено, используйте пипетку, чтобы аккуратно удалить масляную фазу со дна трубки.
Поместите его в соответствующий контейнер для отходов для фторированных отходов. Добавьте больше масла в пробирку для сбора микрогелей. Перемешайте, аккуратно перевернув коллекционный тюбик.
Дайте трубке для сбора отстояться в течение пяти минут, чтобы фазы разделились. Ищите масляную фазу внизу и водную микрогелевую фазу вверху. Повторите промывки маслом как минимум в два раза больше.
Добавьте больше масла с гелем, как показано ранее, затем добавьте PBS в гель. Инвертировать, чтобы перемешать несколько раз. Чтобы отделить слои, центрифугируйте трубку при 2000 RCF в течение примерно 30 секунд.
Ищите масляную фазу в нижней части трубки, гель в середине и PBS сверху. Снимите масляную фазу с помощью пипетки и выбросьте ее в контейнер для отходов. Повторите промывки маслом и PBS дважды.
Ищите гель, чтобы перейти от непрозрачного к прозрачному к окончательной стирке. Удалите все масло. Не удаляйте PBS из конической трубки.
В химическом вытяжном шкафу используйте стеклянную пипетку, чтобы добавить гексаны в трубку в объеме, равном PBS. Вихрьте коническую трубку в течение 30 секунд или до тех пор, пока она не будет тщательно перемешана. Центрифуга при 4, 696 RCF в течение пяти минут.
После разделения ищите гексаны в верхнем слое, PBS в середине и гель внизу. Снимите слой гексана и выбросьте его в контейнер для органических отходов. Аспирировать PBS.
Повторный гексан в PBS смывается по крайней мере дважды или до тех пор, пока гель не станет почти полупрозрачным. Вымойте гель PBS еще раз, чтобы удалить оставшиеся остатки гексана. Центрифуга при 4, 696 RCF в течение пяти минут и аспирация слоя PBS.
Около 67-75% из 20 килодалтонов ПЭГ-малеимид модифицировали с помощью метакриламидов функциональных групп для обеспечения высокой эффективности отжига. Процент модификации определяли путем анализа пиков 1H ЯМР-спектров. Начало гелеобразования дало представление о продолжительности генерации микрофлюидных микрогелей.
Рекомендуется выбирать рН предшественника геля, который может инициировать гелеобразование от 30 минут до двух часов. После очистки и отека микрогели имели равномерный размер и индекс полидисперсности между 1,00 и 1,02, определяемый как монодисперсная популяция. После отжига микрогели образовали пористый каркас, визуализируемый с помощью двухфотонной микроскопии.
Правильное подключение устройства PDMS к стеклянному слайду и правильная обработка поверхности устройства имеют решающее значение для наилучшей производительности микрофлюидного устройства. Этот метод позволяет быстро производить однородные микрогелевые строительные блоки для формирования каркасов карт, которые могут быть использованы для различных регенеративных применений in vivo, включая заживление ран.
