Трансфекция клеток HEK293T должна выполняться при 90% конфюляции. Кроме того, использование 0,45-микронного фильтра с низким содержанием белка для лентивирусной векторной фильтрации и использование сахарозной подушки для ультрацентрифугирования имеют важное значение. Начните с культивирования клеток HEK293T в среде DMEM, содержащей 10% FBS и 1X пенициллина стрептомицина при 37 градусах Цельсия в увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% углекислого газа и 21% кислорода, пока клетки не достигнут 90% конфюляции перед посевом для трансфекции.
Посейте четыре раза от 10 до шести клеток в 10 миллилитрах полной питательной среды в 100-миллиметровой тканевой культуральной пластине и выращивайте в течение ночи в инкубаторе культуры увлажненной ткани с атмосферой 5% углекислого газа и 21% кислорода. Для каждой трансфекции разводят один миллиграмм на миллилитр запасов плазмидной ДНК в одном миллилитре бессывороточной СРЕДы DMEM в 1,5-миллилитрных центрифужных пробирках, следуя соотношению плазмид входа и упаковки, как описано в текстовой рукописи. Вращайте трубку в течение 10 секунд и вращайтесь при 10 000 G в течение 30 секунд при комнатной температуре для сбора.
Затем добавьте в пробирку 70 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр запасного раствора полимерного полиэтиленимина, или PEI. Снова вихрь и ненадолго раскрутите трубку. Для трансекции на основе липофектамина разбавляют векторы в 500 микролитрах бессывороточных DMEM-сред, содержащих 45 микролитров реагента P, поставляемого в комплекте.
Затем разбавляют 70 микролитров реагента L, используя 500 микролитров той же среды. Инкубируйте оба тюбика при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем соедините содержимое обоих трубок и инкубируйте при комнатной температуре в течение 20 минут, чтобы обеспечить образование комплекса.
Затем добавьте по каплям один миллилитр ДНК PEI или ДНК-липофектаминных комплексов к пластине, содержащей клетки, и инкубируйте в течение шести часов при 37 градусах Цельсия с атмосферой 5% углекислого газа и 21% кислорода. После инкубации замените среду 10 миллилитрами свежей полноценной среды роста и верните пластину в инкубатор. После двух дней трансфекции собирают вирусосодержащие среды и накладывают на клетки 10 миллилитров свежих полноценных питательных сред.
Опять же, после трех дней трансфекции, соберите вирусосодержащие носители и объедините их со средами, собранными в двухдневный момент времени. Центрифугируйте вирусный супернатант в 2000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия в гранулированный клеточный мусор. Отфильтруйте супернатант с помощью фильтра с низким содержанием белка размером пор 0,45 микрона и храните при четырех градусах Цельсия до готовности к ультрацентрифугированию.
Стерилизуйте чашки ультрацентрифужных трубок, промыв 70% этанолом в течение 10 минут. Высушите воздухом, закройте и поместите чашки при температуре четыре градуса Цельсия. Добавьте 36 миллилитров в фильтрованный материал, содержащий лентивирусные частицы, в стерильную ультрацентрифужную трубку.
Заполните пять миллилитров стерильной полосы четырьмя миллилитрами стерильного 20%-ного раствора сахарозы, приготовленного в PBS, и дозируйте его на дно пробирки, содержащей лентивирусные векторы, или LVS. Убедитесь, что раствор сахарозы не должен смешиваться со средой и образует градиент в нижней части трубки. Сбалансируйте все ультрацентрифужные трубки с помощью бессывороточной среды DMEM, поместите трубки в чашки для хранения холодной ультрацентрифуги и закройте крышки.
Вращайте трубки в 125 000 раз G в течение двух часов при четырех градусах Цельсия. После отжима осторожно выбросьте супернатант, перевернув содержимое трубки в контейнер, содержащий отбеливатель, не нарушая гранулу. Отметьте гранулу, если она видна.
Поместите ультрацентрифужную трубку в 50-миллилитровую стерильную трубку и добавьте 200 микролитров стерильного DPBS в верхнюю часть гранулы. Поместите трубку при четырех градусах Цельсия на ночь. На следующий день аккуратно перемешайте содержимое трубки, пипеткой вверх и вниз перед вращением в 13 000 раз G в настольной центрифуге, чтобы гранулировать любой мусор.
Перенесите супернатант в новую трубку и аликвотируйте вирусный препарат. Наконец, храните трубки при минус 80 градусах Цельсия. После трансфекции в клетках HEK293T наблюдалась обильная экспрессия GFP.
Экспрессия вирусных белков привела к образованию синцитии клеток HEK293T, где отдельные клетки сливаются. После заражения заметная экспрессия GFP также наблюдалась в инфицированных вирусом нейронных клетках-предшественниках. Измерение титра LVS между недорогим PEI и липофектамином 3000 реагентом не показало каких-либо существенных различий в вирусном титре.
Вирусные титры для векторов на основе PLK 0.1 показаны здесь. Лентивирусные трансфектированные клетки показали более 80% жизнеспособности клеток по сравнению с нетрансдуцированными клетками, в то время как ни одна клетка не пережила лечение. Анализ вестерн-блоттинга показал обильную экспрессию L-2-гидроксиглутаратдегидрогеназы в клетках, трансдуцированных с пустой векторной основой.
Однако экспрессии не наблюдалось в клетках, трансдуцированных вектором, несущим короткие РНК шпильки. Основным преимуществом данной методики является использование недорогого катионного полимера полиэтиленимина для получения лентивирусных частиц путем котрансфекции клеток HEK293T с использованием векторов ввода и упаковки.
