La transfección de células HEK293T debe realizarse al 90% de confluencia. Además, el uso de un filtro de baja unión a proteínas de 0,45 micras para la filtración de vectores lentivirales y el uso de un cojín de sacarosa para la ultracentrifugación son esenciales. Comience cultivando células HEK293T en medio DMEM que contenga 10% FBS y 1X de estreptomicina de penicilina a 37 grados Celsius en una incubadora humidificada con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno hasta que las células alcancen el 90% de confluencia antes de la siembra para la transfección.
Sembrar cuatro veces 10 a las seis células en 10 mililitros de medio de crecimiento completo en una placa de cultivo de tejido de 100 milímetros y crecer durante la noche en una incubadora de cultivo de tejidos humidificados con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Para cada transfección, diluya un miligramo por mililitro de existencias de ADN plásmido en un mililitro de medios DMEM sin suero en tubos centrífugos de 1,5 mililitros siguiendo la proporción de plásmidos de entrada y envasado como se describe en el manuscrito de texto. Vórtice el tubo durante 10 segundos y gire a 10, 000 veces G durante 30 segundos a temperatura ambiente para recoger.
Luego, agregue 70 microlitros de un miligramo por mililitro de solución madre de polietilenoimina polimérica, o PEI, al tubo. De nuevo, vórtice y gire brevemente el tubo. Para la transección a base de lipofectamina, diluya los vectores en 500 microlitros de medios DMEM sin suero que contengan 45 microlitros de reactivo P suministrados en el kit.
Luego, diluya 70 microlitros de reactivo L usando 500 microlitros del mismo medio. Incubar ambos tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, combine el contenido de ambos tubos e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos para permitir la formación compleja.
A continuación, agregue un mililitro de PEI de ADN o complejos de lipofectamina de ADN a la placa que contiene células e incube durante seis horas a 37 grados Celsius con una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 21% de oxígeno. Después de la incubación, reemplace el medio con 10 mililitros de medios de crecimiento completos frescos y devuelva la placa a la incubadora. Después de dos días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y superponga las células con 10 mililitros de medios de crecimiento completos frescos.
Una vez más, después de tres días de transfección, recoja los medios que contienen el virus y combínelos con los medios recolectados en el punto de tiempo de dos días. Centrifugar el sobrenadante viral a 2.000 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular los desechos celulares. Filtre el sobrenadante utilizando un filtro de baja unión a proteínas de tamaño de poro de 0,45 micras y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta que esté listo para la ultracentrifugación.
Esterilizar las tazas de sujeción de los tubos de la ultracentrífuga lavándolas con etanol al 70% durante 10 minutos. Seque al aire, cierre y coloque las tazas a cuatro grados centígrados. Agregue 36 mililitros en medios filtrados que contengan partículas lentivirales a un tubo de ultracentrífuga estéril.
Llene cinco mililitros de una stripette estéril con cuatro mililitros de solución estéril de sacarosa al 20% preparada en PBS y dispensarla al fondo del tubo que contiene vectores lentivirales, o LVS. Asegúrese de que la solución de sacarosa no se mezcle con el medio y haga un gradiente en la parte inferior del tubo. Equilibre todos los tubos de ultracentrífuga utilizando medios DMEM sin suero, coloque los tubos en vasos de retención de tubos de ultracentrífuga fríos y cierre las tapas.
Gire los tubos a 125, 000 veces G durante dos horas a cuatro grados Centígrados. Después del centrifugado, deseche cuidadosamente el sobrenadante invirtiendo el contenido del tubo en un recipiente que contenga lejía sin molestar el pellet. Marque el pellet si es visible.
Coloque el tubo de la ultracentrífuga en un tubo estéril de 50 mililitros y agregue 200 microlitros de DPBS estéril en la parte superior del pellet. Coloque el tubo a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, mezcle suavemente el contenido de un tubo mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo antes de girar a 13, 000 veces G en una centrífuga de mesa para granular cualquier residuo.
Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y alícue la preparación del virus. Finalmente, guarde los tubos a menos 80 grados centígrados. Después de la transfección, se observó una abundante expresión de GFP en las células HEK293T.
La expresión de proteínas virales dio lugar a la formación de sincitia de células HEK293T donde se fusionan células individuales. Después de la infección, también se observó una marcada expresión de GFP en células progenitoras neurales infectadas por virus. La medición del título de LVS entre el PEI de bajo costo y el reactivo de lipofectamina 3000 no mostró ninguna diferencia significativa en el título viral.
Los títulos virales para vectores basados en PLK 0.1 se muestran aquí. Las células transfectadas lentivirales mostraron más del 80% de viabilidad celular en comparación con las células no transducidas, mientras que ninguna célula sobrevivió al tratamiento. El análisis de Western blot mostró una abundante expresión de L-2-hidroxiglutarato deshidrogenasa en células transducidas con una columna vertebral vectorial vacía.
Sin embargo, no se observó expresión en células transducidas con un vector portador de ARN de horquilla corta. La principal ventaja de esta técnica es el uso de polietilenomimina de polímero catiónico de bajo costo para producir partículas lentivirales mediante la coinfectación de células HEK293T utilizando vectores de entrada y empaquetamiento.
