Этот протокол обеспечивает воспроизводимую модель пневмонии, которая приводит к сильному острому повреждению легких. Еще одним преимуществом данной модели является то, что она может быть использована для воспроизведения инфекционного ОРДС или острого респираторного дистресс-синдрома у мышей. Как я уже упоминал, эта модель обладает высокой воспроизводимостью, где уровень смертности и травмы может быть легко титрован для оценки ранних и поздних стадий острого повреждения легких и их разрешения, что служит платформой для оценки терапевтических стратегий.
Несмотря на то, что этот протокол не предусматривает нового подхода к диагностике или лечению повреждения легких, он является надежной моделью, позволяющей протестировать новые методы лечения, что особенно полезно для областей, связанных с иммунологией, легочными заболеваниями и инфекционными заболеваниями. Одним из преимуществ данной методики является ее воспроизводимость. Тем не менее, люди, выполняющие эту технику впервые, могут испытывать трудности при введении катетера внутритрахеально.
Именно поэтому в идеале люди, изучающие эту технику, должны начать практиковаться на усыпленных животных. Для начала прогрейте тарелку с кровяным агаром в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия в нагретом шейкере или инкубаторе. Достаньте из морозильной камеры новый флакон с бактериальными бульонами и разморозьте его путем осторожного перемешивания на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия до полного размораживания флакона.
Не прикасайтесь к уплотнительному кольцу или колпачку теплой водой. Чтобы вручную подсчитать колонии бактерий на планшете, выполните разведение в 1 раз 10 до шестой и наберите 200 микролитров от последнего разведения на предварительно подогретую кровяную агаровую пластину. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.
На следующий день определите новую концентрацию бактерий, применив данную формулу. Поместите мышь под наркозом на чистую и стерилизованную поверхность. Повесьте мышь за резцы и аккуратно обмотайте передние конечности скотчем.
Побрейте область шеи и продезинфицируйте область хлоргексидином и 70%-ным спиртом. Затем с помощью хирургических ножниц сделайте разрез шеи шириной в один сантиметр поверхностно-срединно, чтобы визуализировать трахею. Если наблюдается обилие жировой ткани, тщательно рассеките жировую ткань вертикально, чтобы визуализировать трахею.
Осторожно вытяните язык наружу и введите через рот ангиокатетер 20-го калибра, продвигая катетер в трахею. Слегка надавите на трахею, чтобы облегчить интубацию. После интубации подключите мышь к респиратору для подтверждения интубации.
Установите параметры аппарата ИВЛ на 200 микролитров дыхательного объема и 200 ходов в минуту. После подтверждения интубации отсоедините мышь от респиратора и осторожно введите 50 микролитров бактериального агента через ангиокатетер с помощью пипетки объемом 200 микролитров, загружающего гелевый наконечник. После установки снова подключите мышь к респиратору, чтобы помочь возобновить дыхание.
Оставьте мышь на респираторе на 30–60 секунд, чтобы контролировать дыхание. Если наблюдается замедленное дыхание, снова подключите мышь к респиратору. Закройте разрез, добавив одну каплю клея на кожу.
Сведите вместе кожные складки и слегка надавите, пока клей не высохнет. Уложите усыпленную мышь лежа на чистой хирургической доске и подвесьте ее за резцы. Распылив на кожу мыши 70% этанола, с помощью ножниц сделайте небольшое поверхностное иссечение по средней линии шеи, чтобы визуализировать трахею.
Канюлируйте трахею с помощью катетера 20-го калибра и осторожно добавьте один миллилитр свободного кальция PBS внутритрахеально с помощью одномиллилилитрового шприца. Дайте легкому полностью расшириться, затем аспирируйте жидкость с помощью того же шприца. Повторите процедуру два раза, в общей сложности два миллитра.
Переведите бронхоальвеолярный лаваж, или БАЛ, в двухмиллилитровую аликвоту. С помощью ножниц вскройте грудную полость, чтобы обнажить легкое, сердце и трахею. Осторожно рассеките диафрагму и удалите грудную клещу, следя за тем, чтобы не защемить легочную ткань.
Пересеките брюшную аорту, чтобы обеспечить обескровливание. Перфузируйте легочную ткань, сделав небольшой разрез примерно в один-два миллиметра в правом желудочке с помощью ножниц и введя пять миллилитров холодной PBS с помощью катетера 20 калибра. При успешной перфузии легочная ткань становится белой и бледной, и PBS выходит из внутрисосудистого компартмента через брюшную аорту.
Затем аккуратно извлеките легкое и рассеките его из трахеи. В качестве альтернативы, если легкое используется для гистологии, осторожно вставьте катетер 20-го калибра, чтобы надуть легкие до 25 сантиметров раствором формалина. После того, как легкие будут инсуффляированы, проденьте шовный нить длиной около пяти сантиметров под трахею и дважды крепко завяжите его, чтобы формалин оставался в легочной ткани.
Аккуратно рассеките легкое от остальных тканей и поместите его в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую 10 миллилитров раствора формалина. Центрифугируйте BAL при 500 G при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут и удалите бесклеточную надосадочную жидкость в отдельной пробирке. Лизируйте эритроциты, добавив 100 микролитров лизирующего буфера на одну минуту.
Нейтрализуйте реакцию лизинга, добавив один миллилитр PBS. Центрифугируйте BAL и удалите надосадочную жидкость перед повторной суспензией гранулы в 100-300 микролитрах PBS. Затем выполните подсчет клеток с помощью 0,4% трипанового синего красителя с помощью автоматического подсчета клеток.
Аккуратно рассеките легкое от тканей в конической трубке объемом 15 миллилитров, содержащей пять миллилитров холодного PBS. После вскрытия извлеките легкое из ПБС и высушите его, используя бумажное полотенце. Отделите правое и левое легкое от других тканей, которые также были удалены, таких как трахея.
Приготовьте коктейль для пищеварения, как описано в рукописи текста, и перенесите легкое в С-образную трубку, содержащую один миллилитр коктейля для пищеварения. Перенесите трубку в тканевый диссоциатор и следуйте стандартизированному протоколу обработки легочной ткани. После диссоциации добавьте в пробирку 10 миллилитров холодного PBS и хорошенько перемешайте.
Отфильтруйте одноклеточную суспензию с помощью ситечка 70 микрон на вершине конической трубки объемом 50 миллилитров на льду. Центрифугируйте суспензию и удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллиметр лизирующего буфера на одну минуту при комнатной температуре.
Затем добавьте 10 миллилитров холодного PBS, чтобы остановить реакцию лизирования и удалить надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте клетки в PBS и выполните подсчет клеток с помощью трипанового синего окрашивания с помощью автоматического подсчета клеток. После поражения легких, вызванного бактериальной пневмонией, у мышей инфицированные группы демонстрировали меньшую массу тела по сравнению с неинфицированной контрольной группой.
Группа Streptococcus pneumoniae или Spn восстановила массу тела к исходному уровню, в то время как мыши, инфицированные Klebsiella pneumoniae, или Kpn-инфицированные, показали медленное восстановление после шести дней заражения. Концентрация белка BAL и общее количество клеток как для БАЛ, так и для легких были заметно выше в инфицированных группах. Репрезентативные гистологические срезы, показывающие воспалительный процесс в обеих моделях, были получены на второй, четвертый и шестой день после прививки, что свидетельствует о стойком альвеолярном воспалении у мышей, инфицированных Kpn, даже на 10-й день.
Мыши, инфицированные Kpn, продолжили травму к 10-му дню, в то время как мыши, инфицированные Spn, устранили воспаление легких к шестому дню. Иммунный клеточный ландшафт с помощью многоцветной проточной цитометрии после шести дней инфекции Spn показал повышенное количество гранулоцитов, интерстициальных макрофагов, моноцитов, В-клеток и Т-клеток, включая естественные киллеры. При попытке использования этого метода введение катетера является ключом к возникновению воспроизводимых инфекций.
Это надежный метод, который служит платформой для идентификации мишеней для изучения острого повреждения легких и его разрешения.
