Этот метод позволяет количественно оценить изменения физических свойств клеточной стенки растения во время развития и связать эти микроскопические изменения с ростом целого органа. Основным преимуществом этого метода является то, что он не является инвазивным и не требует какого-либо лечения, что позволяет количественной оценке физических свойств клеточной стенки in vivo добавлять субклеточное разрешение относительно быстро. Для начала нанесите тонкий слой силиконового клея в чашку Петри с крышкой и оставьте ее в воздухе на 45 секунд.
С помощью пинцета поместите рассаду на клей и сориентируйте его направление, чтобы избежать контакта между выступающими частями рассады и консолью. Затем аккуратно прижмите корень к слою силиконового клея, чтобы прочно связать его. Оставьте его на 45 секунд и добавьте решение 1X PBS.
Установите стандартный консольный нитрид кремния с пирамидальным наконечником в держатель зонда AFM для жидкости и выровняйте лазер на консольном суставе близко к положению наконечника. Затем переместите фотодиод, чтобы поместить лазерное пятно в центр детектора. Откалибруйте чувствительность отклонения, выполнив углубление с размером рампы 3 микрометра, скоростью отступа и втягивания 0,6 микрометра в секунду и порогом срабатывания 0,5 вольта.
Убедитесь, что зонд не взаимодействует с образцом, и откалибруйте константу пружины консольного аппарата. Используя утилиту тепловой настройки, нажмите на калибровку с последующей тепловой настройкой или на значок тепловой настройки на панели инструментов наноскопа и введите консольную температуру. После выбора частотного диапазона нажмите на кнопку образец гармонического генератора жидкости.
Затем нажмите на полученные данные на панели тепловой настройки. Теперь отрегулируйте среднюю ширину фильтра до трех. Отрегулируйте ширину psD binwidth, чтобы уменьшить шум в полученных данных путем усреднения и установить границы соответствия вокруг первого резонансного пика.
Нажмите на вычисление пружинной константы K, а затем нажмите «да» во всплывающем окне, спрашивая, хочет ли пользователь использовать это значение. С помощью перевернутого оптического микроскопа при увеличении в 10, 20 и 40 раз поместите зонд AFM на поверхность четвертой вытянутой эпидермальной клетки первичного корня, обеспечив ее положение в центре клетки. С помощью ранее рассчитанного значения постоянной пружины получаются силовые кривые с размером рампы 3 микрометра, порогом срабатывания 11 наноньютонов и скоростью отступа и втягивания 0,6 мкм в секунду в выбранных точках.
Получите кривые силы из трех клеток на корень для каждого лечения и захватите не менее 150 кривых силы для каждого корня. На этом графике показан ожидаемый результат при проведении эксперимента по силовому отступу на живых образцах, расположенных в центре ячейки зоны удлинения корней. Когда наконечник AFM начинает вдавливаться, поверхность клеточной стенки, сила начинает увеличиваться из-за оппозиции клеточной стенки к диффамации.
Увеличение силы продолжается до тех пор, пока не будет достигнуто максимальное значение силы. После этого момента начинается разгрузочная часть отступа. Сила растет вслед за параболой в части отступа, что важно для соответствия каждой кривой модели прогнозирования для пирамидальных инденторов, используемых для вычислений.
В качестве параметра подгонки положение точки контакта должно соответствовать поверхности клеточной стенки перед отступом и считается источником смещения наконечника АСМ. Силовые кривые, в которых невозможно обнаружить точку контакта до углубления, должны быть отброшены. Кроме того, кривая нагрузки и разгрузки эксперимента по силовому отступу должна быть лишена шума.
После подгонки каждой кривой силы к модели были получены гистограммы, которые показывали распределение частоты полученных значений кажущегося модуля Юнга. Эта гистограмма показывает частоту, полученную с помощью набора из 201 успешного углубления на девяти различных клетках трех разных растений Columbia Zero, выращенных в контрольных условиях. Отступ может быть затруднен для некоторых генотипов из-за морфологии корня.
Например, TTL 1 PRC 1-1 двойной мутант выращивается в сильном осмотическом стрессе. Эти гистограммы показывают распределение вероятностей полученных значений кажущегося модуля Юнга из девяти различных клеток. Только гистограмма H, соответствующая одной клетке, может быть приспособлена к гауссовскому распределению.
Металл, представленный здесь, может быть объединен с другими методами, такими как исследования скорости роста или анализ химического состава клеточной стенки. Эти другие методы будут дополнительно дополнять информацию, чтобы понять, как химический состав на физические свойства клеточной стенки влияет на рост органа.
