Этот протокол является первым полным протоколом лазерной абляции на раннем эмбрионе ламинарии. Процедура предлагает надежный подход к исследованию судьбы и взаимодействия клеток во время эмбриогенеза у бурых водорослей. Локальная клеточная лазерная абляция позволяет проводить временную и специальную абляцию с высоким уровнем точности и тканей на клетках.
Этот подход является перспективным методом изучения клеточных судеб и взаимодействия в раннем зародыше бурых водорослей. Он может быть применен к другим системам водорослей с небольшими изменениями. Начните с визуализации всей чашки Петри, чтобы найти эмбрионы для отбора на этапе абляции и контролировать последующее развитие выбранных эмбрионов.
Запустите сканирование плитки. Запишите положение четырех сторон света чашки Петри. Введите параметры, определенные в текстовой рукописи, и получите передаваемые или флуоресцентные изображения всей чашки Петри с низким разрешением.
Сохраните изображение сканирования плитки и оставьте его открытым в окне программного обеспечения для получения изображений. Измените цель, не снимая чашку Петри. Найдите эмбрионы, представляющие интерес на сканировании.
Чтобы откалибровать лазер, откройте драйвер лазера и пакет программного обеспечения для получения изображений. Затем инициализируйте лазерный путь. Синхронизируйте оба пакета программного обеспечения, нажав на кнопку Начать приобретение в пакете программного обеспечения драйвера лазера.
Настройте параметры для лазерной абляции и нажмите на live. Выберите пустую область на тарелке и опустите уровень сцены до 20 микрометров ниже верхней поверхности чашки Петри, чтобы сосредоточиться на стеклянном дне. Чтобы найти интересующую область, нажмите на кнопку выберите AOI и нажмите на края изображения в пакете программного обеспечения драйвера УФ-лазера.
Нажмите «Начать калибровку» и выберите ручную калибровку, чтобы установить траектории абляционного лазера и лазера визуализации. Убедитесь, что все жалюзи открыты. Выберите мощность лазера, достаточно высокую, чтобы увидеть черную точку в центре живого изображения, соответствующую отверстию в скольжении стеклянной крышки.
Нажмите курсором мыши на центральную черную точку и выберите 18 дополнительных точек, предложенных программным обеспечением для завершения процедуры выравнивания. Нажмите на режим щелчка и выстрела. Проверьте калибровку на том же листе крышки и нажмите на слой стекла, где виден лазерный удар.
Выберите интересующий эмбрион на сканировании плитки и переместите сцену, щелкнув по ней. Запустите временные ряды. Проверьте параметры таймлапса в режиме реального времени и при необходимости настройте.
Запустите покадровую запись в программном обеспечении для получения изображений на максимальной скорости. Отрегулируйте масштаб, чтобы сфокусироваться на интересующей области и визуализировать весь эмбрион. Чтобы проследить за эмбрионом во время записи абляции, нажмите на кнопку, получите последнее изображение.
Установите параметры на 45% лазерной передачи, соответствующей максимуму 40 микроватт и продолжительности импульса в одну миллисекунду. Нанесите повреждающее облучение на клетки эмбриона, представляющие интерес, с помощью программного обеспечения лазерного драйвера щелчка и функции огня. Под 688 нанометрами контролируйте выброс автофлуоресцентных хлоропластов из цитоплазмы.
Если содержимое ячейки остается в ячейке, используйте функцию щелчка и запуска еще раз, чтобы увеличить размер нарушения в ячейке. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока большая часть содержимого клеток не будет освобождена, сводя количество выстрелов к минимуму. Прекратите запись замедленной съемки после того, как эмбрион стабилизируется, и дальнейшее межклеточное движение не может быть обнаружено.
Обновите аннотацию на изображении сканирования плитки, перезапишите существующее сканирование плитки и сохраните изображение. Определите выживаемость, контролируя количество эмбрионов, которые развиваются после лазерной абляции и сравнивайте их с теми, которые умирают. Определите задержку роста, измеряя длину эмбрионов лазерного снимка каждый день и сравнивая ее с интактными эмбрионами.
Найдите соседнее повреждение, наблюдая за реакцией клеток, прилегающих к абляционным клеткам. Целевыми клетками, представляющими интерес, были наиболее апикальные клетки, самые базальные клетки и срединные клетки. После сканирования плитки всей чашки Петри интересующий эмбрион был идентифицирован как подходящий кандидат для лазерной съемки.
Клетка высвобождала свое содержимое при выстреле импульсным УФ-лазерным лучом на 45% мощности, в то время как клетка, прилегающая к облученным клеткам, расширялась в межклеточное пространство. Положение облученных эмбрионов регистрировали каждые 24 часа в течение 10 дней. Большинство облученных эмбрионов продолжали развиваться, но показали изменение роста.
Напротив, эмбрионы, протестированные с другими лазерными параметрами, быстро показали признаки сильного стресса, такие как отбеливание клеток, выцветание или изменение формы. Почти все эмбрионы, снятые таким образом, умерли в течение пяти дней после эксперимента. Некоторые параметры, такие как формат изображения или масштаб, не должны изменяться после калибровки.
Мониторинг во время и после лазерной абляции необходим, чтобы иметь представление о том, что произошло. Лазерная абляция прокладывает путь к новым открытиям в изучении развития бурых водорослей и более глубокому пониманию взаимодействий различных метаболитов или компонентов их клеток.
