Этот протокол важен, потому что он прост в выполнении и находится в пределах досягаемости любой лаборатории. Этот протокол позволяет выделять пептиды HLA или MHC типа I или типа II из образцов человека или мыши. Этот метод может решать научные вопросы, связанные со всеми областями исследований, связанными с иммунной системой, будь то рак, вирусология или аутоиммунные заболевания.
Этот протокол был создан для того, чтобы быть доступным для всех, кто работает в исследовательской лаборатории. Просто следуйте инструкциям. Начните активировать шарики цианогенбромида Сефарозе, веся 80 миллиграммов на образец и перенося их в 15-миллилитровую коническую трубку.
Добавьте пять миллилитров одномиллимолярной соляной кислоты. Пипетка вверх и вниз пять раз, чтобы облегчить повторное суспендирование высушенных шариков, а затем заполнить коническую трубку дополнительными 8,5 миллилитрами одномимолярной соляной кислоты. Вращайте шарики со скоростью 20 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре с помощью ротаторного устройства.
Центрифугируйте шарики при 200x G в течение двух минут при комнатной температуре и удалите супернатант путем аспирации. Добавьте 500 микролитров буфера связи в палитру бусин, затем перенесите суспензию бусины в новую двухмиллилитровую центрифужную трубку и отложите ее в сторону. Для соединения антител с этими шариками добавляют два миллиграмма выбранного антитела в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и составляют объем до одного миллилитра с помощью буферного раствора связи, чтобы получить конечную концентрацию двух миллиграммов на миллилитр.
Перенесите предварительно приготовленный бисерный раствор и добавьте его в раствор антител. Затем поверните трубку микроцентрифуги со скоростью 20 об/мин в течение 120 минут с помощью ротаторного устройства, центрифугируйте шарики, затем удалите супернатант, как описано ранее. Теперь начните блокировку и промывку бусин, сначала добавив один миллилитр 0,2-молярного глицина в микроцентрифужную трубку, содержащую бусины, связанные с антителами, и вращаясь со скоростью 20 оборотов в минуту в течение 60 минут при комнатной температуре с помощью ротаторного устройства.
После центрифугирования и удаления супернатанта вымойте шарики одним миллилитром PBS, удалите супернатант центрифугированием и храните шарики в одном миллилитре PBS при четырех градусах Цельсия до использования. Чтобы выделить пептиды MHC класса I или II, разморозьте замороженную палитру из 100 миллионов клеток, согрев дно трубки ладонью. Добавьте 500 микролитров PBS в палитру и пипетку вверх и вниз, пока суспензия не станет однородной.
Переложите суспензию в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и добавьте равный объем буфера лизиса клеток. Вращайтесь со скоростью 10 оборотов в минуту в течение 60 минут при четырех градусах Цельсия с помощью ротаторного устройства. Центрифугируйте лизат ячейки при 18 000x G в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия с полным тормозом и перенесите супернатант в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.
Восстановление шариков, связанных с антителами, путем центрифугирования и удаления супернатанта. Затем перенесите супернатант лизата клеток в шарики, связанные с антителами, и инкубируйте при 10 оборотах в минуту в течение 14-18 часов в течение ночи при четырех градусах Цельсия с помощью ротаторного устройства. На второй день снимите нижнюю крышку полипропиленовой колонны, поместите колонну на стойку для полипропиленовой колонны и установите пустой контейнер под ней, чтобы собрать сквозной поток.
Теперь промыть полипропиленовую колонну 10 миллилитрами буфера А и дать ей стечь под действием силы тяжести. Если скорость потока жидкостного элюирования слишком низкая, дополнительно отрежьте нижнюю кончик полипропиленовую колонну. Измерьте и соберите смесь шариков и лизата и перенесите ее в полипропиленовую колонну.
Пусть жидкая смесь элюируется под действием силы тяжести. По желанию соберите и заморозьте 20 микролитров аликвоты для вестерн-блоттинга. Теперь промыть бусины, удерживаемые в полипропиленовой колонне, добавив 10 миллилитров буфера А и дав ему элюироваться под действием силы тяжести.
Снимите полипропиленовую колонну со стойки и поместите ее поверх новой двухмиллилитровой микроцентрифужной трубки, удерживая колонну и трубку вместе рукой. Добавьте 300 микролитров 1% TFA в полипропиленовую колонну и перемешайте шарики, пять раз по трубам вверх и вниз. Затем перенесите элюат в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку.
Для обессоливания и элюирования пептидов MHC добавьте 200 микролитров метанола поверх колонки C-18 и центрифугу при 1, 546x G в течение трех минут, чтобы отбросить поток. Добавьте 200 микролитров 80% ацетонитрила в 0,1% TFA поверх колонны C-18 и снова центрифугу, чтобы отбросить проточную. Затем добавьте 200 микролитров 0,1% TFA, отбрасывая проточное средство центрифугированием.
Наконец, загрузите 200 микролитров пептидных комплексов MHC поверх колонны C-18, отбросьте поток путем центрифугирования и повторите до тех пор, пока не будет загружен полный объем. Затем добавьте 200 микролитров 0,1% TFA, центрифугу, чтобы отбросить сквозной поток, переместите колонку C-18 в новую двухмиллилитровую микроцентрифужную трубку и элюйте пептиды MHC, добавив 150 микролитров 28% ацетонитрила в 0,1% TFA. После центрифугирования соберите проточную трубу в новую, 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.
Повторите процесс элюирования дважды для общего объема 450 микролитров и заморозьте при минус 20 градусах Цельсия до анализа LC-MS-MS. Используйте эти очищенные пептиды для идентификации пептидов MHC класса I и II в масс-спектрометре. Эффективность связывания бусин была проиллюстрирована значительным снижением интенсивности окрашивания сигнала легких и тяжелых цепей, когда шарики ковалентно связаны с шариками CNBr, по сравнению с антителом до соединения.
Выделение пептидных комплексов MHC после кислотного элюирования было подтверждено сильным сигналом обнаружения пептидных комплексов MHC с использованием анти-HAL-ABC тяжелоцепочечных антител. Была также оценена внутри- и межиндивидуальная воспроизводимость результатов с использованием действующего протокола. Средний коэффициент вариации числа пептидов, обнаруженных в трех различных биологических репликатах, был небольшим, который варьировался от 1,9 до 11%Однако идентичность пептидов значительно варьировалась, и доля пептидов, воспроизводимо обнаруженных в трех биологических репликатах, варьировалась от 39% до 63%.
Для мышиных пептидов MHC класса I и класса II предикативные сильные или слабые связующие составляли 89 и 87% соответственно. Для человеческих пептидов HLA класса I и класса II предикатные сильные или слабые связующие составляли 97 и 70% соответственно. Также были получены мотивы связывания пептидов мыши и человека для пептидов класса I и класса II БАК.
До оптимизации этого протокола выделение мышиных пептидов MHC класса I и II было довольно сложным. Этот оптимизированный протокол облегчит выделение мышиных пептидов MHC класса I и II из моделей мышей in vivo, например, обычно используемых для проверки многих разнообразных, связанных с заболеваниями исследований.
