Наша исследовательская группа разрабатывает технологии и протоколы криоэлектронной микроскопии и криоэлектронной томографии. Мы разработали протоколы микроструктурирования сеток ТЭМ для управления ростом и позиционированием клеток для крио-ET экспериментов. Цельноклеточная криоэлектронная томография используется для получения структур с разрешением нанометрового уровня макромолекулярных комплексов внутри клеток, сохраненных в нативном замороженном гидратированном состоянии.
Микроструктурирование может увеличить пропускную способность цельноклеточной крио-ET, криокоррелятивной световой электронной микроскопии и крио-сфокусированных ионно-лучевых фрезерных экспериментов. Количество и распределение клеток на ЭМ-сетках имеют решающее значение для исследований крио-ET целых клеток. Этот протокол обеспечивает быстрый, воспроизводимый и широко адаптируемый метод для направления роста клеток на электромагнитных сетях посредством микроструктурирования.
Исследователю должно быть удобно использовать пипетки, пинцет, основные методы культивирования клеток, а также флуоресцентные и просвечивающие электронные микроскопы. При создании узора в первый раз используйте известный тип клеток и комбинацию ECM и протестируйте их на крышках или посуде MatTek. Члены исследовательской группы, участвующие в разработке этого протокола: Dr.
Брайан Сиберт, г-н Джозеф Ким и д-р Чжэ Ян. Для начала перенесите сетки в держатель для подготовки сетки и разряжайте тлеющие сетки углеродной стороной вверх. Затем перенесите сетки с карбоновой стороны на чистую стеклянную горку или крышку с расстоянием между сетками не менее одного сантиметра.
Пипетка 10 микролитров по 0,05 поли-L-лизина на каждую сетку и инкубирует сетки во влажной камере не менее 30 минут. После инкубации промыть каждую сетку три раза 15 микролитрами 0,1 молярного HEPES при рН 8,5. Инкубируйте сетку в каждой стирке в течение 30 секунд, затем удалите большую часть жидкости из сетки пипеткой, не давая сетке высохнуть.
После окончательной стирки оставьте каждую сетку в 15 микролитров 0,1 молярного HEPES. Далее готовят раствор PEG-SVA и сразу же заменяют раствор HEPES на сетках 10 микролитрами раствора PEG-SVA, затем инкубируют сетки во влажной камере в течение не менее одного часа. После инкубации промыть каждую сетку три раза 15 микролитрами стерильной воды, инкубируя сетку в каждой стирке в течение 30 секунд.
После окончательной стирки оставьте каждую сетку в 15 микролитров воды. Поместите одну микролитровую каплю воды в центр нового чистого покровного листа, затем аккуратно перенесите сетку с капли воды объемом 15 микролитра на каплю на новом крышке карбоновой стороной вверх. Затем аккуратно поместите трафарет PDMS над сеткой, сохраняя сетку в центре и сводя к минимуму контакт трафарета с углеродной фольгой сетки.
Затем добавьте один микролитр геля PLPP на сетку и аккуратно перемешайте. Переместите крышку с сеткой в темное место для высыхания. Гель высохнет через 15-30 минут.
Для микроструктурирования откройте программное обеспечение с живым видом Brightfield из микроскопа. Чтобы создать новый шаблон для начального запуска, выберите Добавить рентабельность инвестиций и выберите круг длиной 3 000 микрометров. Расположите окупаемость инвестиций по кругу над сеткой, используя изображение Brightfield на экране в качестве направляющей, затем нажмите кнопку Lock, чтобы закрепить рентабельность инвестиций.
После фиксации окупаемости инвестиций на месте выберите «Добавить шаблон» и выберите соответствующий шаблон. Используя параметры репликации, создайте копии исходного шаблона, чтобы создать квадратную область сетки восемь на восемь. Отрегулируйте интервал и угол наклона по мере необходимости, чтобы выровнять узоры с квадратами сетки.
Расположите узор в одном углу сетки. Затем продублируйте узор и поместите копию в каждый из четырех углов сетки, перемещая ступень микроскопа по мере необходимости для каждой области. Используйте параметры репликации, чтобы изменить квадратную область сетки восемь на восемь в квадратную область сетки размером два на восемь, которая будет размещена по обе стороны от центра.
Оставьте четыре центральных квадрата сетки без помечи. Для каждой схемы при необходимости скорректируйте общую дозу. 30 миллиджоулей на квадратный миллиметр — хорошая отправная точка.
В разделе Параметры эксперта выполните итерацию по регулировке угла, положения, пространства между и соотношения узора, чтобы уточнить выравнивание узора с квадратами сетки. Переместите область микроскопа, чтобы изменить область сетки на дисплее Brightfield. После размещения шаблона и шаблонов снимите флажки со всех областей, кроме одной, на панели действий программного обеспечения.
Используйте стадию микроскопа, чтобы переместиться в эту область и сосредоточиться на углеродной фольге. Нажмите на значок глазного яблока на панели действий, чтобы отключить отображение наложения узора. Как только сетка будет в фокусе, закройте затвор Brightfield и нажмите значок воспроизведения в правом нижнем углу программного обеспечения, чтобы начать процесс создания шаблона, который можно контролировать в режиме реального времени.
Повторяйте этот шаг до тех пор, пока не будут сформированы шаблоны для всех областей. Наконец, снимите крышку с сеткой из микроскопа и сразу же добавьте в сетку 10 микролитров стерильного PBS. Через 10 минут удалите трафарет пинцетом, затем трижды вымойте сетку 15 микролитрами PBS и оставьте каждую сетку в PBS в темном месте.
Подготовьте 15 микролитров внеклеточного матрикса для каждой сетки, затем замените PBS из каждой сетки 15 микролитрами внеклеточного матрикса и инкубируйте сетку во влажной камере в течение не менее одного часа. После инкубации вымойте каждую сетку пять раз 15 микролитрами стерильного PBS, как показано ранее. После окончательной стирки оставьте каждую сетку в PBS.
Используя флуоресцентный микроскоп, обнаружите флуорофор во внеклеточном матриксе, чтобы подтвердить паттерн и то, что углеродная фольга остается неповрежденной. Клетки HeLa, посеянные на микропятнистые и неструктурированные сетки TEM, видны флуоресцентным окрашиванием с использованием анализа жизнеспособности клеток на основе кальцеина AM и этидия гомодимера-1. Используя смешанный коллаген и фибриноген внеклеточный матрикс, клетки HeLa легко прилипают к паттернам по всей сетке.
Общая морфология клеток, которые расширились вдоль рисунка, аналогична морфологии клеток, выращенных на неструктурированных сетках. Изображение Brightfield инфицированных RSV клеток BEAS-2B через 18 часов после посева показывает адгезию и рост клеток вдоль центральной области узора. Большинство инфицированных клеток расположены вдоль центральной области градиента с более высокой плотностью.
Варианты RSV расположены близко к периферии инфицированных клеток BEAS-2B, выращенных на микроструктурированных сетках. Многие структурные белки RSV идентифицируются в томограммах, включая нуклеокапсид и белок вирусного слияния. На микроструктурированных сетках нейроны Drosophila с паннейрональной экспрессией GFP могут быть легко отслежены с помощью световой микроскопии благодаря флуоресцентной маркировке и их расположению в микроструктурах.
Нейроны на неструктурированных сетках также могут быть отслежены с помощью сигнализации GFP с помощью световой микроскопии. Однако найти их в криоэлектронной микроскопии становится трудно из-за клеточного мусора и загрязнения из сред. Из-за размеров тела нейронной клетки и расширенных нейритов криоэлектронные томографические наклонные ряды собираются вдоль более тонких областей клеток с более высоким увеличением.
Мембрана нейрональных клеток, митохондрии, микротрубочки, актиновые нити, везикулярные структуры и макромолекулы, такие как рибосомы, хорошо разрешаются в монтажах изображений с более высоким увеличением и срезах через 3D-томограмму. Подобные субклеточные особенности наблюдаются на 3D-томограммах неструктурированных нейронов. Нанесение трафарета на сетку и добавление геля PLPP является наиболее чувствительным шагом, который может повлиять на результаты моделирования и должен выполняться с осторожностью.
Cryo-CLEM может быть использован для локализации мишеней, представляющих интерес в клетках, для сбора крио-ET данных. Cryo-FIB-SEM можно использовать для истончения ячеек на участках, слишком толстых для сбора данных.
