Il nostro team di ricerca sviluppa tecnologie e protocolli per la crio-microscopia elettronica e la tomografia crioelettronica. Abbiamo sviluppato protocolli per la micropatterning di griglie TEM per dirigere la crescita cellulare e il posizionamento per esperimenti crio-ET. La tomografia crioelettronica a cellule intere viene utilizzata per produrre strutture di risoluzione a livello nanometrico di complessi macromolecolari all'interno di cellule conservate in uno stato idratato congelato nativo.
Il micropatterning può aumentare la produttività di esperimenti di crio-ET a cellule intere, microscopia elettronica a luce crio-correlata e fresatura a fascio di ioni crio-focalizzati. Il numero e la distribuzione delle cellule sulle griglie EM sono cruciali per gli studi crio-ET a cellule intere. Questo protocollo fornisce un metodo rapido, riproducibile e ampiamente adattabile per dirigere la crescita cellulare sulle griglie EM attraverso il micropatterning.
Lo sperimentatore dovrebbe essere a suo agio nell'uso di pipette, pinzette, tecniche di coltura cellulare di base e microscopi elettronici a fluorescenza e trasmissione. Quando si esegue la modellazione per la prima volta, utilizzare un tipo di cella ben noto e una combinazione ECM e testarli su coverslip o piatti MatTek. I membri del team di ricerca coinvolti nello sviluppo di questo protocollo sono:Dr.
Brian Sibert, Mr.Joseph Kim e Dr.Jae Yang. Per iniziare, trasferire le griglie a un supporto per la preparazione della griglia e scaricare il bagliore delle griglie lato carbonio verso l'alto. Quindi, trasferire le griglie con il lato in carbonio fino a una slitta di vetro pulita o una slitta di copertura con almeno un centimetro di separazione tra le griglie.
Pipettare 10 microlitri di 0,05 poli-L-lisina su ogni griglia e incubare le griglie in una camera umida per almeno 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare ogni griglia tre volte con 15 microlitri di 0,1 HEPES molare a pH 8,5. Incubare la griglia in ogni lavaggio per 30 secondi, quindi rimuovere la maggior parte del liquido dalla griglia con una pipetta senza lasciare asciugare la griglia.
Dopo il lavaggio finale, lasciare ogni griglia in 15 microlitri di 0,1 HEPES molari. Quindi, preparare la soluzione PEG-SVA e sostituire immediatamente la soluzione HEPES sulle griglie con 10 microlitri della soluzione PEG-SVA, quindi incubare le griglie in una camera umida per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, lavare ogni griglia tre volte con 15 microlitri di acqua sterile, incubando la griglia in ogni lavaggio per 30 secondi.
Dopo il lavaggio finale, lasciare ogni griglia in 15 microlitri d'acqua. Posizionare una goccia d'acqua di un microlitro al centro di una nuova copertura pulita, quindi trasferire con cura la griglia dalla goccia d'acqua di 15 microlitri alla goccia sul nuovo coperchio con il lato in carbonio verso l'alto. Quindi, posizionare con attenzione lo stencil PDMS sulla griglia mantenendo la griglia centrata e riducendo al minimo il contatto dello stencil con la lamina di carbonio della griglia.
Quindi aggiungere un microlitro di gel PLPP sulla griglia e pipettare delicatamente per mescolare. Spostare il coverslip con la griglia in una posizione buia per asciugare. Il gel si asciugherà in 15-30 minuti.
Per il micropatterning, aprire il software con una vista Brightfield dal vivo dal microscopio. Per progettare un nuovo modello per un'esecuzione iniziale, selezionare Aggiungi ROI e scegliere un cerchio di 3.000 micrometri. Posiziona il ROI del cerchio sulla griglia utilizzando l'immagine Brightfield sullo schermo come guida, quindi premi Blocca per proteggere il ROI.
Dopo aver bloccato il ROI, selezionare Aggiungi pattern e scegliere il pattern appropriato. Utilizzando le opzioni di replica, generare copie del modello iniziale per creare un'area quadrata della griglia otto per otto. Regolate la spaziatura e l'angolo in base alle esigenze per allineare i motivi con i quadrati della griglia.
Posizionate la serie in un angolo della griglia. Quindi, duplicare il modello e posizionare una copia in ciascuno dei quattro angoli della griglia spostando lo stadio del microscopio come necessario per ogni regione. Utilizzare le opzioni di replica per modificare un'area quadrata griglia otto per otto in un'area quadrata griglia due per otto da posizionare su entrambi i lati del centro.
Lascia il centro quattro quadrati della griglia non modellati. Per ogni modello, regolare la dose totale se necessario. 30 millijoule per millimetro quadrato è un buon punto di partenza.
In Opzioni esperti,eseguite l'iterazione regolando l'angolo, la posizione, lo spazio tra e il rapporto del modello per perfezionare l'allineamento del modello con i quadrati della griglia. Spostare lo stadio del microscopio per modificare l'area della griglia nella visualizzazione Brightfield. Una volta posizionati il modello e i modelli, deselezionare tutte le regioni tranne una nel pannello delle azioni del software.
Usa lo stadio del microscopio per navigare in quella regione e concentrarti sul foglio di carbonio. Fare clic sull'icona del bulbo oculare nel pannello delle azioni per disattivare la visualizzazione della sovrapposizione del modello. Una volta che la griglia è a fuoco, chiudi l'otturatore Brightfield e premi l'icona Riproduci nell'angolo in basso a destra del software per iniziare il processo di creazione di modelli, che può essere monitorato dal vivo.
Ripetere questo passaggio fino a creare una serie di tutte le aree. Infine, rimuovere il coverslip con la griglia dal microscopio e aggiungere immediatamente 10 microlitri di PBS sterile sulla griglia. Dopo 10 minuti, rimuovere lo stencil con una pinzetta, quindi lavare la griglia tre volte con 15 microlitri di PBS e lasciare ogni griglia in PBS in una posizione buia.
Preparare 15 microlitri della matrice extracellulare per ogni griglia, quindi sostituire il PBS da ciascuna griglia con 15 microlitri della matrice extracellulare e incubare la griglia in una camera umida per almeno un'ora. Dopo l'incubazione, lavare ogni griglia cinque volte con 15 microlitri di PBS sterile come dimostrato in precedenza. Dopo il lavaggio finale, lasciare ogni griglia in PBS.
Utilizzando un microscopio a fluorescenza, rilevare il fluoroforo nella matrice extracellulare per confermare il pattern e che il foglio di carbonio rimane intatto. Le cellule HeLa seminate su griglie TEM micropatternate e non modellate sono visibili mediante colorazione fluorescente utilizzando un test di vitalità cellulare basato su calceina AM e etidio omodimer-1. Utilizzando una matrice extracellulare mista di collagene e fibrinogeno, le cellule HeLa aderiscono prontamente ai modelli attraverso la griglia.
La morfologia complessiva delle cellule che si sono espanse lungo il modello è simile a quella delle cellule cresciute su griglie non modellate. Un'immagine Brightfield di cellule BEAS-2B infette da RSV 18 ore dopo la semina mostra l'adesione e la crescita cellulare lungo la regione centrale del modello. La maggior parte delle cellule infette sono posizionate lungo la regione centrale a densità più elevata del modello di gradiente.
Le varianti RSV si trovano vicino alla periferia delle cellule BEAS-2B infette cresciute su griglie micropatternate. Molte proteine strutturali RSV sono identificate all'interno dei tomogrammi, tra cui il nucleocapside e la proteina di fusione virale. Sulle griglie micropatternate, i neuroni Drosophila con espressione GFP pan-neuronale possono essere facilmente monitorati al microscopio ottico grazie all'etichettatura fluorescente e alla loro posizione all'interno dei micropattern.
I neuroni su griglie non modellate possono anche essere tracciati attraverso la segnalazione GFP mediante microscopia ottica. Tuttavia, localizzarli nella microscopia crioelettronica diventa difficile a causa dei detriti cellulari e della contaminazione dai mezzi. A causa delle dimensioni del corpo cellulare neuronale e dei neuriti estesi, le serie di inclinazione della tomografia crioelettronica vengono raccolte lungo regioni più sottili delle cellule con ingrandimento più elevato.
La membrana cellulare neuronale, i mitocondri, i microtubuli, i filamenti di actina, le strutture vescicolari e le macromolecole come i ribosomi sono ben risolti in montaggi di immagini a ingrandimento più elevato e fette attraverso il tomogramma 3D. Caratteristiche subcellulari simili sono osservate da tomogrammi 3D di neuroni non tagliati. Applicare lo stencil alla griglia e aggiungere il gel PLPP è il passaggio più sensibile che può influenzare i risultati del pattern e deve essere fatto con cautela.
Cryo-CLEM può essere utilizzato per localizzare bersagli di interesse all'interno delle cellule per la raccolta di dati crio-ET. Cryo-FIB-SEM può essere utilizzato per assottigliare le cellule su aree altrimenti troppo spesse per la raccolta dei dati.
