Этот протокол представляет собой объединение различных методов, которые позволят исследователям определить роль гена-кандидата в биологии меланоцитов. Это целостный подход к достижению логического вывода. Комбинируя различные методы, можно избежать смешанных факторов, и это может помочь исследователям получить существенный результат.
Чтобы начать анализ, иммобилизуйте 48 эмбрионов HPF 0,016% трикаина. Смонтируйте эмбрионы, используя несколько миллилитров от 1,5 до 2% метилцеллюлозы в чашке Петри. Соберите эмбрионы с помощью пипетки Пастера и поместите их в метилцеллюлозу, чтобы ограничить движение во время визуализации.
Для оптимальной боковой или дорсальной визуализации отрегулируйте их положение с увеличением более чем в 5 раз. Поместите чашку Петри под микроскоп. С помощью манипулятора отрегулируйте рыбок так, чтобы все пять эмбриональных полосок меланоцитов были видны одновременно.
Используя программное обеспечение для сбора данных, сделайте снимки. Если рыба проснется, поместите ее в трикаиновую воду, пока она не стабилизируется. Используя инструмент «Открыть» в программном обеспечении ImageJ, откройте изображение для количественной оценки.
Выберите инструмент «Фигура от руки», чтобы обвести область для анализа. Выберите параметр «Установить измерения», нажмите на среднее значение серого, а затем на область. Чтобы рассчитать среднее значение серого для выбранной области, нажмите на M или перейдите к анализу и выберите измерение.
В зависимости от интересующей стадии перенесите эмбрионы в чашку Петри, содержащую 0,6 миллиграмма на миллилитр проназы. Используя пипетку Пастера, перенесите дехорионированные эмбрионы в чашку Петри, содержащую простую воду для эмбрионов, через пять-10 минут. С помощью стеклянной пипетки Пастера соберите и перенесите около 100 эмбрионов в двухмиллилитровую микроцентрифужную пробирку.
Откажитесь от среды и добавьте 200 микролитров ледяного раствора Рингера для дежелтка. Поместите тюбик на лед и перемешайте содержимое около 20 раз пипеткой, чтобы растворить ярмо. Центрифугируйте пробирки при 100 г в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия дважды и выбросьте надосадочную жидкость.
Перенесите дейожелтированные эмбрионы с помощью пипетки объемом один миллилитр в чашку Петри, содержащую 10 миллилитров раствора трипсина. Смешайте раствор один или два раза с помощью пипетки объемом один миллилитр, чтобы уменьшить агрегацию. Пропустите трипсинизированную суспензию через 70-микрометровое ситечко, помещенное на коническую трубку объемом 50 миллилитров, чтобы собрать одноклеточную суспензию.
Вымойте чашки Петри трипсинизированной суспензией, чтобы удалить прилипшие клетки с поверхности. Для подсчета флуоресцентно меченных клеток с помощью проточного цитометра после создания новой папки эксперимента нарисуйте прямую и боковую диаграмму рассеяния. Составьте гистограмму интенсивности флуоресцеина изотиоцианата.
Сначала загрузите ячейки дикого типа, чтобы установить прямые и боковые ворота рассеяния и порог FITC. После этого загрузите клетки, выделенные из трансгенных эмбрионов линии FTYRP GFP, для подсчета меланоцитов. Поместите эмбрионы в 1,5-2% метилцеллюлозы в чашку Петри.
Поместите его под микроскоп и отрегулируйте в желаемой ориентации с помощью наконечника пипетки. Используя программное обеспечение для сбора данных, приобретите изображения. Для эмбрионов менее 24 HPF, используя 10-кратное увеличение, захватите все изображение, в то время как для эмбрионов более 24 HPF получите несколько полей сканирования и впоследствии соберите их.
После проведения анализа визуализация Brightfield через 48 часов выявила наличие всех пяти пигментированных полос меланофора. На этапе 48 HPF было рассчитано количество латеральных меланофоров и обнаружено, что морфанты гистонного варианта h2afv продемонстрировали меньшее количество меланофоров по сравнению с контролем. Среднее значение серого было измерено для морфантов CA14 и h2afv, что показало, что значения были выше для вариантов, чем для контрольных морфантов.
Используя спектрофотометрический метод поглощения на основе гидроксида натрия, содержание меланина было количественно определено, когда морфанты CA14 показали меньшее содержание, чем контрольные морфанты. Флуоресцентная визуализация была выполнена для оценки морфолиновых изменений на разных стадиях развития меланофора рыбок данио. Количество меланофоров в морфантах CA14 и h2afv анализировали с помощью FACS.
Было отмечено, что количество меланофоров в СА14 оставалось неизменным, в то время как они были достоверно снижены в h2afv по сравнению с контрольным морфантом. Также была рассчитана средняя интенсивность флуоресценции на площадь, демонстрирующая, что морфанты h2afv демонстрируют значительное снижение значения по сравнению с контрольными морфантами. Регулируя рыбу перед визуализацией, убедитесь, что вы можете визуализировать все пять полос меланофора.
Нужно немного наклонить рыбу, чтобы различить две боковые полосы. Установив роль гена-кандидата в развитии меланоцитов, мы можем устранить ген тканеспецифическим способом с помощью технологии CRISPR. Это будет более целенаправленный подход.
