Questo protocollo è una fusione di varie tecniche che consentirebbero ai ricercatori di delineare il ruolo del gene candidato nella biologia dei melanociti. È un approccio olistico verso il raggiungimento di un'inferenza logica. Combinando vari metodi, i fattori confondenti possono essere evitati e possono aiutare i ricercatori a ottenere un risultato sostanziale.
Per iniziare l'analisi, immobilizzare i 48 embrioni HPF con 0,016% tricaina. Montare gli embrioni usando pochi millilitri di 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri. Prelevare gli embrioni con una pipetta Pasteur e metterli in metilcellulosa per limitare il movimento durante l'imaging.
Per un'imaging laterale o dorsale ottimale, regolare la loro posizione con un ingrandimento superiore a 5X. Posizionare la capsula di Petri al microscopio. Utilizzando un manipolatore, regolare il pesce in modo che tutte e cinque le strisce embrionali dei melanociti siano visibili contemporaneamente.
Utilizzando il software di acquisizione, catturare le immagini. Se il pesce si risveglia, mettilo in acqua tricaina fino a quando non si stabilizza. Utilizzando lo strumento aperto del software ImageJ, aprire l'immagine da quantificare.
Selezionate lo strumento forma a mano libera per delineare l'area da analizzare. Selezionare l'opzione imposta misure, fare clic sul valore medio del grigio e quindi sull'area. Per calcolare il valore medio di grigio per l'area selezionata, fare clic su M o andare su analizzare e selezionare misura.
In base allo stadio di interesse, trasferire gli embrioni in una capsula di Petri contenente 0,6 milligrammi per millilitro di Pronase. Utilizzando una pipetta Pasteur, trasferire gli embrioni dechorionati in una capsula di Petri contenente acqua embrionale semplice dopo cinque-10 minuti. Con una pipetta Pasteur in vetro, raccogliere e trasferire circa 100 embrioni in una provetta da microcentrifuga da due millilitri.
Scartare il mezzo e aggiungere 200 microlitri di soluzione Ringers deyolking ghiacciata. Posizionare il tubo sul ghiaccio e mescolare il contenuto circa 20 volte con una pipetta per sciogliere il giogo. Centrifugare i tubi a 100 G per un minuto a quattro gradi Celsius due volte e scartare il surnatante.
Trasferire gli embrioni deyolked utilizzando una pipetta da un millilitro in una capsula di Petri contenente 10 millilitri di soluzione di tripsina. Mescolare la soluzione una o due volte utilizzando una pipetta da un millilitro per ridurre l'aggregazione. Far passare la sospensione tripsinzzata attraverso un filtro da 70 micrometri posto su un tubo conico da 50 millilitri per raccogliere una sospensione a cella singola.
Lavare le piastre di Petri con la sospensione tripsinizzata per rimuovere le cellule aderenti dalla superficie. Per contare le celle marcate con fluorescenza utilizzando un citometro a flusso, dopo aver creato una nuova cartella dell'esperimento, disegnare un grafico a dispersione laterale rispetto a un grafico a dispersione laterale. Fai un istogramma per l'intensità dell'isotiocianato di fluoresceina.
Caricare prima le celle di tipo wild per impostare i gate di dispersione anteriore e laterale e la soglia FITC. Successivamente, caricare le cellule isolate dagli embrioni transgenici della linea FTYRP GFP per contare i melanociti. Montare gli embrioni in 1,5-2% di metilcellulosa in una capsula di Petri.
Posizionarlo sotto il microscopio e regolarlo nell'orientamento desiderato utilizzando una punta per pipetta. Utilizzando il software di acquisizione, acquisire le immagini. Per gli embrioni inferiori a 24 HPF, utilizzando un ingrandimento 10X, catturare l'intera immagine, mentre per gli embrioni più di 24 HPF, acquisire più campi di scansione e successivamente assemblarli.
Dopo aver eseguito il test, l'imaging Brightfield dopo 48 ore ha rivelato la presenza di tutte e cinque le strisce melanofore pigmentate. Allo stadio 48 HPF, è stato calcolato il numero di melanofori laterali ed è stato riscontrato che i morfani h2afv della variante istonica hanno dimostrato un numero ridotto di melanofori rispetto al controllo. Il valore medio del grigio è stato misurato per i morfalanti CA14 e h2afv, che hanno rivelato che i valori erano più alti per le varianti rispetto ai morfi di controllo.
Utilizzando un metodo di assorbimento spettrofotometrico basato sull'idrossido di sodio, il contenuto di melanina è stato quantificato dove i morfanti CA14 mostravano un contenuto inferiore rispetto ai morfani di controllo. L'imaging a fluorescenza è stato eseguito per valutare l'alterazione a base di morfolino per diversi stadi dello sviluppo del melanoforo zebrafish. Il numero di melanofori nei morfalanti CA14 e h2afv è stato analizzato utilizzando FACS.
È stato osservato che il numero di melanofori in CA14 è rimasto invariato, mentre sono stati significativamente ridotti in h2afv rispetto al morphant di controllo. È stata calcolata anche l'intensità media di fluorescenza per area, dimostrando che i morfalanti h2afv mostrano una notevole diminuzione del valore relativo ai morfalanti di controllo. Mentre regoli il pesce prima dell'imaging, assicurati di poter visualizzare tutte e cinque le strisce melanofore.
È necessario inclinare leggermente il pesce per distinguere tra le due strisce laterali. Dopo aver stabilito il ruolo di un gene candidato nello sviluppo dei melanociti, possiamo eliminare il gene in modo tessuto-specifico utilizzando la tecnologia CRISPR. Sarà un approccio più mirato.
