Общая цель эксперимента состояла в том, чтобы идентифицировать связанные с белком фрагменты ДНК по всему геному, которые отражали статус хроматина. Для достижения этой цели были проведены три специальные операции. В первую очередь были выделены интактные ядра из растительных клеток.
Во-вторых, модификации хроматина были распознаны специфическим антителом in situ. В-третьих, антитело, связывающее белок слияния белка А-транспозазы, транспозазу Tn5, расщепляет хроматин in situ под активацией ионов магния. Затем фрагменты ДНК и сайты связывания модификации хроматина были интегрированы с адаптерами и подготовлены к подготовке ДНК.
Обогащение полимеразной цепной реакции улучшенным секвенированием генерации. Регуляция эпигеномики на хроматическом уровне, включая модификации ДНК и гистонов, поведение факторов транскрипции и некодирующие РНК с их рекрутированными белками, приводят к временному и пространственному контролю экспрессии генов. Технология CUT&Tag, разработанная Henikoff Lab, представляет собой метод ферментного связывания для профилирования эпигеномики хроматина с высокой эффективностью.
Здесь мы используем листья хлопка в качестве экспериментальных материалов и выполняем профилирование хроматина с использованием антитела триметилирования гистона H3 лизина-4 в качестве примера. Мы предоставляем усовершенствованный протокол с видео для производительности CUT&Tag на заводах. Для каждого пробоподготовки с использованием CUT&Tag был собран грамм ткани хлопкового листа.
Лист измельчали в мелкий порошок с жидким азотом и переносили в 50 мл соколиной трубки, содержащей 25 мл охлажденного буфера ядерной изоляции А. Буферный раствор осторожно смешивали, и трубку инкубировали на льду в течение пяти минут с легким встряхиванием, чтобы равномерно рассеять материал. Затем его вращали при 500 относительной центробежной силе или rcf, при 4 градусах Цельсия, в течение пяти минут, чтобы сформировать ячейку гранулы. Супернатант декантировали, а гранулу повторно суспендировали 20 мл охлажденного буфера ядерной изоляции B, дополненного 0,5% тритона.
Трубку осторожно переворачивали, чтобы полностью повторно суспендировать гранулу. Полученный клеточный лизат затем фильтровали комбинацией двух сит, сверху использовали 500-сетчатое сито для удаления более крупных тканевых обломков. А 1000-сетчатое сито использовалось на дне для сбора ядер.
Выбор подходящего размера сетки сит зависит от размеров ядер растений. Стерильная фильтровальная бумага использовалась на обратной стороне сита для поглощения части лизата и мелкоклеточного мусора. Лизат, содержащий ядра, переносили в свежую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку и вращали при 300 rcf в течение четырех минут, при 4 градусах Цельсия, чтобы собрать ядра.
После центрифугирования наконечник пипетки использовался для удаления как можно большего количества супернатанта. В количестве 800 микролитров был добавлен буфер ядерной промывки. И трубка была аккуратно перевернута, чтобы повторно суспендировать ядра.
Трубка снова вращалась при 300 rcf, в течение четырех минут при 4 градусах Цельсия. После трех промывок полученные ядра были объединены в свежую 1,5-миллилитровую центрифужную трубку и вращались при 300 rcf в течение четырех минут при 4 градусах Цельсия. Наконечник пипетки использовался, чтобы удалить как можно больше оставшегося буфера.
Следующим шагом стала инкубация антитела. Аликвота из 50 микролитров ядер была повторно суспендирована в 1 миллилитре буфера антител, дополненного КОКТЭ ЭДТА, БСА, коктейлем ингибиторов протеазы в дигитонине. Аликвоту из 150 микролитров суспензии ядер помещали в свежую 1,5-миллилитровую трубку для одной реакции, в каждую пробирку добавляли по два микролитра антитела.
В этом анализе были созданы две биологические реплики для антигистон-H3-лизин-4-триметилирования антител и иммуноглобулина G отрицательных контрольных групп после добавления антител. Раствор осторожно перемешивали, а трубки оставляли на горизонтальном шейкере для гибридизации на ночь при четырех градусах Цельсия при 12 об/мин. На следующее утро трубки были вынуты, а ядра промыты с использованием 800 микролитров буфера для промывки иммунотрибуции.
Трубку осторожно переворачивали для перемешивания и оставляли на горизонтальном шейкере в течение пяти минут при комнатной температуре в 12 об/мин. После промывки трубку крутили при 300 rcf в течение четырех минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугирования супернатант удаляли с помощью наконечника пипетки.
Это повторялось в общей сложности три стирки. После третьей промывки трубку крутили на 300 rcf в течение двух минут при четырех градусах Цельсия, а наконечник пипетки использовался для максимального удаления оставшегося буфера. Для приготовления транспозазной смеси Tn5 для инкубации.
Один микролитр транспозазы добавляли к каждому 150 микролитрам инкубационного буфера транспозазы. Мы рекомендуем сначала приготовить смесь раствора транспозазы в соответствии с количеством реакций. А затем добавить аликвоту в 150 микролитров к каждой трубке.
Раствор осторожно перемешивали и оставляли на горизонтальном шейкере при комнатной температуре в 12 об/мин в течение двух часов. Тюбики осторожно смешивали каждые 10-15 минут. После инкубации ядра промывали три раза с использованием 800 микролитров буфера иммунопреципитации при комнатной температуре для удаления несвязанной транспозазы Tn5.
После третьей промывки трубку вращали при 300 rcf в течение двух минут при четырех градусах Цельсия, а для удаления оставшегося буфера использовался наконечник пипетки. Для стадии тагментации в реакционную трубку добавляли 300 микролитров буфера метирования. Раствор хорошо перемешивали и инкубировали при 37 градусах Цельсия в течение одного часа.
После инкубации для определения реакции добавляли 10 микролитров по 0,5 моль на литр ЭДТА при 30 микролитрах 10% SDS. Были добавлены следующие 300 микролитров буфера экстракции ДНК. Проводилась нерегулярная экстракция ДНК.
Фрагменты ДНК были растворены в 25 микролитрах стерильной воды. 24 микролитра были использованы для ПЦР-амплификации в построении библиотеки NGS. На этом рисунке показано интактное пятно ядер с DAPI в изображении, под микроскопом получение достаточного количества неповрежденных и относительно чистых ядер является критическим шагом для CUT&Tag.
После ПЦР переносили два микролитра и проверяли размер ДНК на 1,5% агарозного геля. Этот рисунок показывает, что в сравнении с геном иммуноглобулина отрицательный контроль. Основная часть фрагментов ДНК из образца триметилирования гистона H3 Lysine 4 должна составлять от 280 до 500 пар оснований.
Фрагменты ДНК могут быть очищены, а затем профилированы с помощью высокопроизводительного секвенирования. На этом рисунке показаны результаты генерации секвенирования антигистоновой антигистоновой антителы h3 Lysine 4 Trimethylation по сравнению с иммуноглобулином G отрицательных контрольных групп. Эта технология генерирует библиотеки ДНК с высоким разрешением и исключительно низким фоном, используя небольшое количество клеток с упрощенной процедурой по сравнению с ChIP-seq.
CUT&Tag - это новый метод, который все еще находится в стадии разработки.
