Этот протокол предлагает простой метод получения человеческих кроветворных прародителей и индуцирования их дифференцировки в мегакариоциты. Он может служить основой для лучшего понимания мегакариопоэза Этот метод использует источник, но предлагает преимущество в том, что он доступен и обилен для лабораторных исследований в области кроветворения. Этот метод используется для лучшего понимания мегакариопоезиса для клетки, которая будет использоваться в терапии, они должны быть подготовлены в условиях GMP, что в настоящее время не так.
Понимание шагов, включая коллекцию PBMC, может быть полностью завершено только с визуальной демонстрацией. Перед началом эксперимента подключите фильтр лейкоредукции к пустому 600-миллилитровой передаточной сумке и к набору трубок. В шкафу биологической безопасности впрыскивайте 25 миллилитров фильтрованного буфера элюдения на фильтр лейкоредукции в пустой мешок и используйте шприц объемом 30 миллилитров, чтобы осторожно аспирировать содержимое пакета через фильтр.
Переведите собранные эритроциты в новую 50-миллилитровую трубку и разбавьте клеточную суспензию вдвое 2%-ным декстраном. Хорошо перемешайте, чтобы агрегировать клетки крови и дать клеткам отстой в течение 30 минут при комнатной температуре. Когда эритроциты осядут, перенесите супернатант в 50-миллилитровую трубку и заполните трубку двумя миллимолярными растворами PBS EDTA.
Аккуратно накладывают половину супернатанта на 25 миллилитров среды градиента плотности в каждой из двух 50 миллилитровых трубок, не нарушая поверхность градиента, и разделяют ячейки центрифугированием градиента плотности. Используйте одноразовую пипетку для переноса ячеек с каждого интерфейса на новую 50-миллилитровую трубку. Промывайте клетки два раза по 50 миллилитров двух миллимоляров PBS EDTA за одну промывку.
После второй промывки повторно суспендируют гранулы в одном объеме 50 миллилитров свежего PBS EDTA для подсчета. Здесь можно остановить процедуру, поддерживая собранные клетки под перемешиванием при четырех градусах Цельсия в течение ночи. Для селекции CD34 + клеток определите количество клеток и соберите клетки путем центрифугирования и повторно суспендируем клеточную гранулу в 300 микролитрах двух миллимолярных PBS EDTA на 10-восьмую клетку.
Добавьте соответствующий объем блокирующего рецептор FC реагента и 50 микролитров CD34 микро-шариков на 10 к восьмой клетке. Через 30 минут при четырех градусах Цельсия промыть клетки двумя миллимолярами PBS EDTA и повторно суспендировать гранулу в 500 микролитров свежего двух миллимолярного PBS EDTA, на 10 до восьми клеток. Увлажните и соответствующим образом размер магнитной колонки с помощью PBS EDTA, а затем добавьте образец в колонку.
Промыть колонку два раза тремя миллилитрами двух миллимоляров PBS EDTA за одну промывку. Прежде чем ускользнуть от CD34+ клеток, с двумя пятимиллилитровыми объемами двух миллимоляров PBS EDTA на элюирование. Чтобы оценить чистоту выбранных клеток магнитной бусины, добавьте два микролитра соответствующего человеческого антитела против CD34 к 100-микролитровой аликвоте изолированных клеток и хорошо перемешайте перед инкубацией в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия.
После инкубации промыть клетки в PBS и повторно суспендировали гранулу в 200 микролитрах PBS для анализа чистоты образца клетки методом проточной цитометрии. После подсчета соберите CD34+ клетки путем центрифугирования и немедленно повторно суспендируют гранулу в холодном растворе один до плотности от 10 до шести клеток на миллилитр, прежде чем быстро добавить клеточную суспензию в холодный раствор два. Затем немедленно поместите криотрубку в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов цельсия на 24 часа, прежде чем перенести криотрубку в хранилище жидкого азота.
В этом репрезентативном исследовании клетки были восстановлены путем лейкорезуктной фильтрации, как показано с приблизительной жизнеспособностью 95%. После магнитного отбора шариков была получена более 90% чистой популяции CD34 + клеток. Пролиферация клеток обычно уменьшается после недели культивации, но без значительных изменений жизнеспособности клеток.
К седьмому дню клетки CD34 + должны начать экспрессить CD41, специфический и ранний маркер или для развития мегакариоцитов и тромбоцитов. К 10-му дню большинство клеток в культуре обычно развиваются в зрелые CD41,экспрессирующие мегакариоциты. К 13-му дню расширение тромбоцитов мегакариоцитов и высвобождение тромбоцитов можно наблюдать с помощью световой микроскопии.
Общее количество CD41, CD42, 8 положительных тромбоцитов, высвобождаемых в культуру, затем может быть количественно определено с использованием калиброванного числа флуоресцентных шариков. Этот метод прокладывает путь для усиления основных механизмов мегакариопоэсиса и для увеличения урожайности тромбоцитов в визуальном виде. Даже если этот метод кажется утомительным, он очень прост, нужно просто наберитесь терпения и заранее подготовьте все регионы.
Несмотря на то, что мы критически говорим о мегакариопоэзе, мы получаем клетки CD42, которые могут быть использованы в кроветворных путях.
