Крио-ЭМ-анализ с одной частицей стал рутинным методом в наборе инструментов структурного биолога, применимым к широкому спектру образцов, включая мембранные белки, амилоидные фибриллы, белки, связывающие нуклеиновые кислоты, и вирусы. После завершения подготовки образцов и загрузки сеток в микроскоп сбор данных может осуществляться удаленно во многих крио-ЭМ-объектах, таких как Лаборатория биоструктуры Астбери и eBIC. Основные препятствия для успешного определения структуры часто лежат на этапах подготовки образцов и скрининга сетки с несколькими итерациями, иногда требуемыми в рамках этого процесса.
Здесь мы продемонстрируем дистанционный скрининг сетки и сбор данных из одной частицы. На вкладке автозагрузчика пользовательского интерфейса микроскопа откройте диалоговое окно параметров с помощью стрелки и нажмите кнопку инвентаризации. Это будет последовательно проверять каждую позицию в кассете, чтобы определить, присутствует ли картридж.
Инвентаризация будет выполняться на каждом слоте последовательно. Когда все занятые слоты будут нанесены на карту, инвентарь остановится. Выделите сетку для переноса в столбец микроскопа и нажмите кнопку «Загрузить».
Метка слота превратится из синего в желтый после успешной загрузки сетки на сцену. Чтобы отобразить сетки, откройте программное обеспечение EPU. На странице подготовки выберите оптику и настройки сбора, а затем выберите стиль атласа в раскрывающемся меню.
Выберите соответствующие предустановки настройки луча и нажмите set set, чтобы отправить параметры в микроскоп. Нажмите, чтобы открыть клапаны колонны и вставить экран от гриппа. Убедитесь, что луч виден и достаточно распространен и центрирован, чтобы покрыть детектор.
При необходимости перейдите в более тонкую область сетки с помощью джойстика или виртуальных ручных панелей для управления движениями сцены в X и Y.Поднимите экран гриппа и сделайте снимок с помощью кнопки предварительного просмотра в EPU. В EPU перейдите на страницу атласа и нажмите новый сеанс. Выберите формат изображения MRC и введите подходящее имя папки и расположение для сохранения сеанса скрининга, затем нажмите кнопку Применить.
Выберите экран в меню слева. Установите флажки рядом с каждой сеткой, чтобы получить атласный монтаж, а затем начните сеанс скрининга в EPU. Атлас приобретается для каждой проверенной сетки, а доступные квадраты сетки перечисляются по завершении.
Каждый атлас можно просмотреть, выделив его на странице показа. По завершении просмотрите собранные атласы и определите сетки, подходящие для оценки качества образцов при более высоких увеличениях. Выделите выбранную сетку в меню экранирования EPU и нажмите кнопку Загрузить образец.
В меню экранирования атласа выберите загруженную в данный момент сетку и переместите сцену в квадрат сетки, содержащий заполненные отверстия, щелкнув правой кнопкой мыши нужное место на изображении сетки и выбрав этап перемещения здесь. Вернитесь на страницу подготовки EPU и выберите предустановленный квадрат сетки. Откройте страницу автофункций EPU и запустите автоматический эйцентрический наклон по шагам с предустановленным квадратом сетки, чтобы переместить образец на эйцентрическую высоту.
При подготовке EPU создайте новое изображение квадрата сетки. Обратите внимание на значения серого цвета в разных отверстиях, указывающие на разную толщину льда. Переместите рабочую область через отверстие с помощью щелчка правой кнопкой мыши и переместите стадию здесь.
Выберите предустановленное отверстие или высоту эйцентрика, затем нажмите кнопку предварительного просмотра. Выберите предустановку сбора данных и установите увеличение, которое позволяет легко идентифицировать частицы. Установите смещение дефокуса на отрицательные три-пять микрометров.
Итерация шагов для переоценки диапазона толщины льда для распределения, ориентации и загрязнения частиц по всей сетке. В зависимости от наличия микроскопа, переходите непосредственно к сбору данных или сетки могут быть удалены из микроскопа для будущего сбора, в том числе на других участках. Соберите атлас, если он недоступен после скрининга, настроив параметры атласа и выбрав сетку для получения атласа.
Приобретите атлас и нажмите на местоположение сетки, чтобы увидеть выходные данные. Как только атлас будет завершен, определите каждый из предустановок настройки луча в соответствии с экспериментальными потребностями проекта. Выполните калибровку сдвига изображения.
Настройте сеанс EPU, выбрав страницу настройки сеанса EPU, а затем выбрав новый сеанс или новый из настроек. После выбора нового сеанса появится всплывающее окно с возможностью использования предыдущих настроек. Настройки будут автоматически загружаться с предыдущего на текущий сеанс EPU.
Кроме того, можно выбрать новый из настроек и выбрать файл с сохраненными настройками, чтобы предварительно загрузить эту информацию в текущий EPU. Заполните название сеанса чем-нибудь информативным. В поле Тип выберите Вручную.
Для режима съемки выберите точное центрирование отверстий или более быстрое получение, если коллекция сдвигов изображения без аберрации доступна и желательна. Выберите нужный формат изображения, затем выберите папку хранения, и EPU создаст каталог с именем сеанса. Выберите подходящую сетку, в соответствии с которой используется расстояние между отверстиями сетки, и нажмите «Применить».
Выберите начальный квадрат сетки и задайте шаблон сбора. Перейдите к выделению квадрата. Если все квадраты зеленые, нажмите «Отменить выделение всех» в левом верхнем углу.
Откройте плитки, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав команду Открыть плитку. Добавьте или выберите квадрат сетки, щелкнув выбрать, затем щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав переместить этап в квадрат сетки. Перейдите к выбору отверстий и нажмите auto-eucentric.
Подождите, пока не будет получено квадратное изображение сетки. Если автофункция не работает, это может быть связано с тем, что высота значительно снизилась. Его можно настроить вручную с помощью экрана гриппа при квадратном увеличении сетки.
Чтобы измерить размер отверстия, переместите и отрегулируйте желтые круги так, чтобы они находились над отверстиями с правильным размером и расстоянием. Нажмите найти отверстия. Проверьте, правильно ли найдены отверстия.
Если нет, измените размер отверстия и нажмите найти отверстия еще раз. Если этот процесс постоянно терпит неудачу, рассмотрите возможность перехода к меньшему числу или более яркому размеру пятна при увеличении квадрата сетки. Используйте гистограмму качества фильтра льда справа, чтобы настроить выбор отверстий.
Это может быть полезно для исключения участков с толстым льдом и тонким льдом. Это запомнится будущим квадратам сетки, выбранным в ходе сессии. Оптимизируйте выделение отверстий с помощью инструментов в меню выбора вверху.
Например, щелкните Удалить отверстия рядом с панелью сетки. Перейдите к определению шаблона и нажмите приобрести. Нажмите кнопку Найти и поцентрировать отверстие.
Измените задержку после сдвига этапа и задержку после сдвига изображения на одну-пять секунд, затем, если это возможно, проверьте максимальное значение сдвига изображения по желанию. Нажмите добавить область сбора и нажмите в любом месте изображения. Переместите область приобретения в нужное место.
Добавьте диапазон расфокусировки в правом верхнем углу. Типичный список расфокусировки для проекта мембранного белка составляет отрицательную 0,8 до отрицательной трехмикрометровой расфокусировки, затем добавьте другие области сбора, расположив их таким образом, чтобы области захвата не подвергались двойному воздействию пучка. Щелкните Добавить область автофокусировки и щелкните в любом месте изображения.
Переместите область автофокусировки в углерод, окружающий отверстие. Стандартной практикой является автофокусировка после центрирования при использовании AFIS или каждые пять-15 микрометров в зависимости от изменения высоты Z по квадрату. Щелкните Добавить область измерения дрейфа.
Измерение дрейфа выполняется один раз на квадрат сетки с установленным порогом 0,05 нанометра в секунду в качестве стандартной настройки. Область измерения дрейфа может перекрываться непосредственно с областью автофокусировки. Убедитесь, что ни область дрейфа, ни область автофокусировки не перекрываются с областью приобретения.
Вернитесь к выделению квадратов и выберите квадраты для получения в сетке. Используйте количество областей сбора и ожидаемую скорость сбора данных, чтобы предсказать, сколько областей сбора требуется. Когда все нужные квадраты выбраны, нажмите подготовить все квадраты.
После сбора каждого квадрата перемещайтесь между квадратами сетки и тонко настраивайте отверстия с помощью кисти выделения. Переместитесь в место стадии над образцом и используйте автоматические функции для установки эйцентрической высоты. Выполните выравнивание микроскопа с помощью программного обеспечения микроскопа, как описано ранее и в тексте.
Выполните выравнивание без комы в рамках автофункций перед повторной вставкой и центрированием диафрагмы объектива и коррекцией астигматизма объектива с помощью EPU. Убедитесь, что оба выравнивания сходятся на подходящих значениях. Перед началом автоматического сбора убедитесь, что турбонасос автозагрузчика выключен и при необходимости вставлено целевое отверстие.
В автоматизированном сборе данных нажмите запустить запуск, чтобы начать автоматический сбор данных. Используя этот протокол, сломанные или сухие сетки могут быть просеяны и выброшены на этапе атласа. Градиент льда наблюдается на большинстве сеток.
Во время скрининга идеальное распределение частиц монодисперсируется с видимым диапазоном ориентаций частиц. Если лед слишком тонкий, он может растаять при освещении электронным пучком, вызывая чрезмерное движение на микрофотографии. Это чаще всего наблюдается, когда в буфере есть моющее средство.
Лед должен быть стекловидным, поэтому области сетки, где большинство изображений показывают кристаллический лед, были исключены. Графическое резюме данных было включено для оценки качества микрофотографии и принятия решения о необходимости внесения поправок в сбор данных. Сборщики частиц, такие как crYOLO, работают достаточно хорошо для первого прохождения данных, что позволяет перейти к усреднению 2D-класса.
Классы, которые показывают детали вторичной структуры, должны быть выбраны для 3D-анализа, в то время как мусорные частицы должны быть отброшены. Подмножество частиц может быть использовано для создания исходной модели для 3D-классификации и уточнения. В случае RagAB набор данных содержал три различных конформера, которые могут быть разделены во время 3D-классификации.
Важно помнить, что успех на этапах сбора данных и последующего анализа изображений зависит от получения и идентификации хорошо оптимизированных сеток на этапе скрининга. Как только 3D-карта плотности ЭМ получена, ее можно дополнительно интерпретировать путем подгонки и уточнения белковой модели или построения атомной модели de novo. Крио-ЭМ анализ одной частицы позволяет структурировать определение многих мишеней, которые ранее были невозможны.
Примечательно, что эти рабочие процессы в последнее время используются для решения структур макромолекул, связанных с COVID-19.
