Характеристика 3D-модели in vitro с клеточным и субклеточным разрешением имеет решающее значение для полной эксплуатации, но может быть сложной задачей. Поэтому мы предоставили дополнительный протокол для окрашивания и субклеточного разрешения фиксированных 3D-моделей in vitro в диапазоне от 100 микрометров до нескольких миллиметров. 3D-структуры являются радиальными, и ими следует тщательно манипулировать.
Перед пипеткой проверьте расположение ваших 3D-структур внутри трубы, чтобы избежать каких-либо стремлений. Поскольку мы адаптировали классические методы для встраивания небольших структур, таких как органоиды или сфероиды, визуализированные инструкции могут помочь пользователям в первый раз легче выполнять задачу. Демонстрировать процедуру со мной будет Лаура Франкольс, лабораторный техник из Платформы исследований патологии.
Чтобы подготовить образцы для окрашивания цельного 3D-крепления, используйте наконечник пипетки в один миллилитр, предварительно закодированный BSA, чтобы добавить одну миллилитровую 3D-структурную суспензию к 500-микролитровой трубке PBS. Когда 3D-структуры осядут на дно трубки, аккуратно замените PBS 500 микролитрами блокационного раствора для пермеабилизации в течение одного часа инкубации при комнатной температуре с мягким горизонтальным перемешиванием со скоростью от 30 до 50 оборотов в минуту. В конце инкубации позвольте 3D-структурам снова отстояться, прежде чем тщательно промыть 3D-структуры два раза в одном миллилитре 0,1% PBS, дополненном BSA, в течение трех минут на одну промывку.
После последней промывки маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами первичного антитела в PBS в течение двух-трех дней с мягким горизонтальным перемешиванием при четырех градусах Цельсия. В конце инкубации промыть образец пятью трехминутными и двумя 15-минутными промывками в одном миллилитре 0,1% PBS BSA на стирку. После последней промывки маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами соответствующего вторичного антитела в PBS в течение 24 часов при четырех градусах Цельсия с мягким горизонтальным перемешиванием, защищенным от света.
На следующий день маркируйте 3D-структуры 250 микролитрами соответствующей концентрации Hoechst 3342 для двухчасовой инкубации при четырех градусах Цельсия с мягким горизонтальным перемешиванием. В конце инкубации промывайте 3D-структуры пять раз в течение трех минут и два раза в течение 15 минут по одному миллилитру PBS на одну стирку, как показано на рисунке. После последней промывки переложите 3D-структуры на 96-луночную черную полистирольную микропластинку и аккуратно добавьте 200 микролитров очищающего раствора на конструкции, избегая пузырьков.
Затем поместите пластину, покрытую алюминиевой фольгой, при четырех градусах Цельсия на срок не менее 48 часов. Чтобы встроить большие 3D-модели культур клеток, используйте наконечник пипетки с покрытием BSA в один миллилитр, чтобы аккуратно перенести 3D-структуры в стеклянную трубку с плоским дном с крышкой бутылки, выложенной ptFE. После того, как конструкции осядут, осторожно замените PBS 70% этанолом для 30-минутной инкубации при комнатной температуре.
В конце инкубации замените 70%-ный этанол одним миллилитром готового к применению раствора эозина Y. Проведите по трубке и окрашивайте структуры не менее 30 минут. В конце инкубации обезвоживают структуры тремя последовательными 30-минутными промывками в одном миллилитре 100% этанола на промывку.
После последнего обезвоживания очистите 3D-структуры с тремя последовательными 30-минутными промывками в одном миллилитре ксилола за одну стирку под химическим вытяжкой. После последнего погружения в ксилол поместите кусок пропитанной ксилолом биопсийной прокладки в один отсек белой тканевой кассеты microtwin и используйте двухмиллитровую пластиковую пипетку Пастера с покрытием BSA для переноса 3D-структур на прокладку. Накройте 3D-структуры другой пропитанной ксилолом биопсийной прокладкой, чтобы удерживать 3D-структуры на месте, и закройте кассету.
Когда все образцы будут переданы, поместите кассеты в парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на 30 минут, прежде чем поместить кассеты в свежую парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на ночь. На следующее утро добавьте жидкий парафин в одну нагретую встраиваемую форму на 65 градусов Цельсия на образец и поместите один встроенный образец парафина в каждую форму. Осторожно перемешивайте формы до тех пор, пока все 3D-структуры не упадут на дно, и используйте нагретые тонкие щипцы с температурой 65 градусов Цельсия, чтобы расположить 3D-структуры в центре каждой формы.
Охладите форму до тех пор, пока парафин не образует тонкий твердый слой, закрепляя 3D-структуру на месте. Поместите тканевую кассету и добавьте горячий парафин поверх формы. Удалите форму, когда парафин полностью затвердеет.
Чтобы встроить небольшие 3D-модели клеточных культур, аккуратно промывайте 3D-структуры три раза в одном миллилитре TBS за одну промывку. После последней промывки удалите как можно больше TBS, не касаясь структур, и добавьте две капли реагента две из коммерческого набора для встраивания парафина. Аккуратно перемешайте постукиванием и добавьте две капли реагента в одну с постукиванием, пока гель не затвердеет.
Используйте тонкие щипцы для переноса геля из колодца предварительно собранной кассеты из комплекта и обезвоживайте образец геля с помощью 30-минутных восходящих инкубаций этанола и ксилола в вытяжной вытяжке, как указано. После последнего погружения ксилола поместите кассету в парафиновую ванну с температурой 65 градусов Цельсия на ночь, прежде чем использовать тонкие щипцы для переноса образца парафина в центр жидкого парафина, загруженного на 65 градусов Цельсия, нагретой встраиваемой формы. Затем закрепите 3D-структуру еще одним слоем парафина, как показано для больших моделей 3D-культур клеток.
Трехмерное окрашивание целых креплений и конфокальная микроскопия предоставляют визуальную информацию о клеточном составе и пространственном положении моделей 3D-культур на поле глубиной до 200 мкм. Высокое разрешение, которое может быть получено для 3D-структур с использованием этого протокола, позволяет применять алгоритмы клеточной и субклеточной сегментации для количественной оценки числа клеток и обнаружения различных клеточных маркеров в пределах разных подтипов клеток. 3D-анализ целых креплений может быть применен к визуализированным ячейкам глубиной до 200 микрон, независимо от целых структур.
Напротив, 2D-анализ разделов может дать представление о клетках любого размера.
