Мы предлагаем мягкий биопечатный процесс подготовки микронесущих с хорошей управляемостью и биосовместимостью. После инкапсуляции клетками носители также могут быть использованы в расширении клеток in vitro и функциональной микроткани. Ограниченное смещение, а не сильные силы при аналогичных условиях действуют на сопло во время процесса печати, сохраняя первоначальные физические/химические свойства биочернил в максимальной степени.
В дополнение к обычным микроносителям, блоки с внутренним клеточным распределением или тритозин-инкапсулированными капсульными структурами могут быть построены и применены к сборке различных тканевых структур. Для подготовки сопла загрузите стеклянные микропипетки на съемник в соответствии с инструкциями завода-изготовителя и установите параметры вытягивания съемника. Используйте микрокварку, чтобы отрезать сопло на указанном диаметре, чтобы получить конкретный диаметр наконечника для эксперимента, и стерилизуйте сопло в спирте в течение пяти минут.
Затем промойте сопло три раза стерильной водой, чтобы удалить остаточный спирт. Для приготовления биочернил гидрогеля разводят стерилизованный 4%-ный раствор альгината натрия в 0,9% хлорида натрия в 0,5, 1, 1,5 и 2% массово-объемных концентрациях. Для образования микрокапель загрузите пять миллилитров биочернил в одноразовый стерильный шприц и установите шприц на шприцевой насос.
С помощью одномиллиметрового шланга внутреннего диаметра соедините шприц и печатную насадку. Затяните зажимной винт, чтобы закрепить сопло на месте, и быстро нажмите на шприцевой насос, чтобы загрузить биочернила в сопло. Установите параметры генератора сигналов и заранее задайте траекторию движения и режим срабатывания вибрации для снижения по требованию.
Затем распечатайте капли по заранее разработанным шаблонам. Для образования микроносителей добавьте пять миллилитров сшивающего раствора в чашку Петри и поместите чашку под печатную насадку в качестве подложки. После печати сшивайте микронесущие в течение трех минут, прежде чем перенести суспензию микронесущей в трубку центрифуги.
Затем обогащают микроносители центрифугированием и повторно суспендируют их в соответствующей питательной среде при примерно 600 микроносителях на миллилитр. Перед их инокуляцией замените супернатант клеточной культуры A549 пятью миллилитрами среды без сыворотки, дополненной 10-микромолярным клеточным трекером зеленого красителя CMFDA для 30-минутной инкубации в инкубаторе клеточной культуры. В конце инкубации заменяют раствор красителя свежей средой и повторно суспендируют клетки с плотностью от 1,6 раз 10 до шести клеток на миллилитр среды.
Добавьте один миллилитр суспензии микронесущих к клеткам и один миллилитр клеток A549 к каждой лунке низкоадгезионной шестилуночной культуральной пластины. Поместите пластину на шейкер в инкубаторе клеточных культур со скоростью 30 оборотов в минуту. В конце инкубации извлеките пластину из шейкера и дайте микроносителям осесть в течение 30 минут, прежде чем наблюдать и измерять печатную насадку, чашки Петри и микронесущие клетки с помощью ярко-полевой и конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Используя сопло с 30-микрометровым наконечником, несколько типов биочернил, включая PBS, 1,5% альгината и 1,5% желатина, могут быть стабильно напечатаны на чашках Петри. По мере увеличения вязкости красок процесс печати становится все более сложным, и для получения более крупных капель требуются большие движущие силы. Параметры печати могут быть настроены на печать капель в определенных 2D-схемах, как это наблюдалось в этом эксперименте по печати.
Диаметр наконечника сопла оказывает непосредственное влияние на размер микронесущей, которую можно напечатать. Как видно на этих ярко-полевых и конфокальных изображениях, клетки A549 прилипают к альгинат-коллагеновым микроносителям после двух дней культивирования. Через шесть дней клетки A549 почти полностью покрывают поверхности микроносителей.
После этой процедуры мы покрыли поверхность микронесущей хитозаном и использовали глюконат для растворения альгинатного геля с образованием кистозной структуры, которая может быть применена для создания полых структур, таких как альвеолы. Процесс печати для приготовления микроносителей достаточно щадящий, таким образом, этот метод может широко использоваться для печати ячеистых микроносителей.
