Этот метод позволяет присмотреться к одиночным клеткам в живой ткани. Путем отслеживать и манипулировать одиночными клетками, мы можем более лучше понять образование ткани во время развития. Визуальная демонстрация этого метода позволяет потенциальным пользователям решить, может ли этот метод быть полезным для их работы.
Кроме того, это позволяет пользователям видеть, как приложение работает, что было бы трудно понять из текста в одиночку. Этот протокол может быть применен к каждой ткани с оцениваемой поверхностью. Мы ориентируемся на разные клетки в одной и той же ткани, различные ткани одного и того же вида, а также различные виды.
При попытке этого протокола важно оставаться сосредоточенным и работать быстро. Все оборудование должно быть подготовлено перед началом вскрытия. Начните с установки программного обеспечения авто-инжектора и потянув микроинъекции пипетки из борозиликатных стеклянных капилляров с шкивом micropipette.
Храните пипетки до трех дней, защищенные от пыли. Растопить 3%wide диапазон агароза с помощью микроволновой печи. Не позволяйте агарозы затвердеть, удерживая его в водяной бане при 37 градусах по Цельсию.
Оттепель aliquot SCM и тепло от 10 до 12 миллилитров SIM и 20 миллилитров раствора Tyrode до 37 градусов по Цельсию с помощью водяной ванны. Смешайте флуоресцентный трассировщик с другими химическими веществами, которые будут введены, а затем центрифугировать раствор микроинъекции при 16 000 раз G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Соберите супернатант и перенесите его в новую трубку.
Держите раствор микроинъекции на льду до его использования. Используйте головки от E13.5 до E16.5 эмбрионов мыши для подготовки органотипических ломтиков ткани теленцефалона. Удалить кожу и открыть череп с типсами движущихся вдоль средней линии.
Рассекаете эмбриональный мозг из открытого черепа и удалите оковы, покрывающие ткани мозга, начиная с брюшной стороны мозга. Оставьте расчлененный весь мозг в растворе Тирода на нагревательном блоке 37 градусов по Цельсию. Налейте широкий ассортимент расплавленной агарозы в одноразовые встраивания формы.
Когда он охлаждается до 38 до 39 градусов по Цельсию, тщательно перенесите до четырех мозгов в агарозу с помощью пипетки Pasteur. Перемешать агарозу вокруг ткани шпателем или парой типсов Dumont номер один, не касаясь ткани. Пусть агароза затвердевет при комнатной температуре.
После того, как агароза затвердевла, обрезать избыток окружающих ткани. Заполните буферный лоток PBS. Ориентация мозга с ростральной хвостовой оси ткани перпендикулярно лоток и сократить 250 микрометров ломтиками с помощью вибромы.
Заполните 3,5-сантиметровую чашку Петри двумя миллилитров предварительно разогретых средств массовой информации, а затем используйте пластиковую пипету Pasteur для передачи от 10 до 15 ломтиков этого блюда. После завершения, передача чашки Петри с ломтиками в срез культуры инкубатора. Поддерживайте ломтики при 37 градусах Цельсия во влажной атмосфере.
Включите компьютер, микроскоп, микроскоп камеры, манипуляторы, давление установки, и датчик давления. Загрузите приложение, нажав на файл, запустите приложение.py в основной папке, загруженной с GitHub, и укажите настройки устройства на всплывающем экране.
Чтобы предотвратить нежелательное засорение, создайте внешнее давление перед погружением пипетки в раствор. Сдвиньте планку давления компенсации до 24 до 45% и нажмите на установленные значения. Затем настройте давление, повернув ручку клапана механического давления в один-два PSI, как указано датчиком давления.
Перенесите ломтики в центр 3,5-сантиметровой чашки Петри, содержащей два миллилитров предварительно разогретой SIM-карты, а затем поместите чашку Петри на стадию микроинъекции, которая была разогрета до 37 градусов по Цельсию. Загрузите микроинъекцию пипетки с 1,4 до 1,6 микролитров раствора микроинъекции с помощью длинного наконечника пластиковой пипетки и вставьте микроинъекцию пипетки в держатель пипетки. Используя наименьшее увеличение на микроскопе, довейте кусочек в фокус и направляйте микропайпетт к этому полю зрения, чтобы он был сфокусирован на той же плоскости, что и цель среза.
Переключитесь выход микроскопа на камеру, чтобы увидеть FOV и приложение. Нажмите кнопку увеличения в левом верхнем слева от интерфейса, чтобы инициировать калибровку устройства. Когда окно подсказывает выбрать увеличение, выберите 10X и нажмите OK. Программное обеспечение предполагает, что внутренний объектив цели 10X.
Переориентация наконечника пипетки с помощью микрометрического колеса микроскопа и нажмите на кончик пипетки курсором. Затем нажмите кнопку шага 1.1 и нажмите OK в всплывающем окне. Пипетка будет двигаться в направлении.
Нажмите на кончик пипетки и нажмите кнопку шаг 1.2. Наконец, введите 45 в поле угла пипетки и нажмите на угол набора. Введите желаемые параметры в автоматизированную панель управления микроинъекции и установите скорость до 100%После завершения, нажмите набор значений.
Нажмите кнопку края притяжки и перетащите курсор по нужной траектории в всплывающем окне, чтобы определить траекторию впрыска. Для микроинъектирования нейронов, целевой базальной стороне теленцефалона. Принесите пипетку к началу линии и нажмите ее кончик, а затем нажмите траекторию запуска, чтобы начать микроинъектирование.
Повторите этот шаг для каждой плоскости инъекций целевых. Погрузите ломтики в коллагеновую смесь, затем перенесите ломтики вместе с 200-300 микролитров коллагена в 14-миллиметровый колодец 35-миллиметровой стеклянной нижней тарелки. Убедитесь, что ломтики покрыты в наименьшее количество коллагена возможно, что является оптимальным условием для питательных веществ и поглощения кислорода.
Ориентируйте ломтики с помощью двух пар типсов и инкубировать чашку Петри в течение пяти минут при 37 градусах по Цельсию на нагревательном блоке, чтобы коллаген затвердел. Переместите чашку Петри обратно в инкубатор культуры ломтиков еще на 40 минут, затем добавьте два миллилитров предварительно разогретого СКМ. В конце культуры, принять ломтики из среза культуры инкубатора и аспирировать СКМ.
Вымойте коллаген-встроенные ломтики с PBS, а затем добавить 4%paraformaldehyde и оставить ткани при комнатной температуре в течение 30 минут. Перемести его до четырех градусов по Цельсию для ночной фиксации. На следующий день, аспирировать раствор параформальдегида и мыть ломтики с PBS.
Удалите ломтики из коллагена с помощью двух пар типсов под стерео микроскопом. Используйте микроволновую печь, чтобы расплавить 3%low точки плавления агарозы, а затем залить его в одноразовые встраивания формы и дайте ему остыть примерно до 38 или 39 градусов по Цельсию. Передача ткани ломтиками в эту форму убедившись, что кожура стороне ломтик сталкивается вверх, а затем позволить агарозы остыть до комнатной температуры и затвердеть.
Обрежьте дополнительную агарозу, окружающую ломтики. Сориентировать блок агарозы, чтобы убедиться, что срезанной поверхности параллельно вибромы резки лезвия и сократить 50 микрометров толщиной разделов. Заполните 24-хорошо блюдо с PBS и передачи разделов в это блюдо с помощью тонкой наконечником кисти, а затем выполнить иммунофторесценции в соответствии со стандартными протоколами.
Здесь показаны репрезентативные изображения успешно введенных клеток-предшественников и новорожденных нейронов. При введении с Dextran Alexa 488, клетки появляются полностью заполнены красителем. Автоматизированная микроинъекция может обеспечить значительно более высокую пропускную способность по сравнению с ручной микроинъекции.
Кроме того, маркировка EDU подтверждает, что на жизнеспособности клеток автоматизация не влияет. Сохранение органотипического ломтика в культуре позволяет следить за прогрессированием линии микроинъектных клеток. Микроинъекция в одиночные нервные стволовые клетки обеспечивает отличное разрешение одиночных клеток.
Поэтому он был использован для вскрытия клеточной биологии прогрессирования нервных стволовых клеток и перехода судьбы. Этот протокол был использован для изучения соединения в новорожденных нейронов путем введения Люцифер желтый вместе с Dextran A555. Доля новорожденных пирамидальных нейронов были соединены через разрыв соединения с соседними нейронами, что согласуется с идеей, что незрелые нейроны общаться через разрыв соединения.
Мы использовали этот метод для исследования клеточной биологии развития мозга и эволюции мозга. Мы изучили несколько генов-кандидатов, которые влияют на поведение нервных стволовых клеток, и мы смогли обнаружить и понять, как они работают, как они влияют на прогрессирование линии нервных стволовых клеток, и производство нейронов во время развития мозга.
