Протокол, продемонстрированый в этом видео, позволяет понять роль метаболитов кишечника в грибковом гипхал-морфогенезе. Этот метод ex vivo более или менее ближайшее приближение кишечника для изучения грибкового гипального морфогенеза таким образом, что ни одно исследование in vitro не может повторить. Этот метод может быть применен для изучения роли метаболитов кишечника на других кишечных патогенов.
Вскрывать мышей с помощью автоклавных стерилизованных ножниц и типсов. После эвтаназии, закрелите животное на поверхности вскрытия, прижав все конечности, чтобы разоблачить живот. Спрей брюшной области с 70% этанола, чтобы предотвратить меха от прилипания к тибры, ножницы, или кишечника разделов.
Используйте щипц, чтобы ущипнуть и поднять участок кожи у основания живота и создать небольшой разрез через кожу и основные фасции заботиться, чтобы избежать прокола cecum или кишечной стенки. Продлите этот разрез до грудной клетки, частично обнажая брюшную полость, затем сделайте разрез, начиная с точки первоначального разреза с обеих сторон и расширяя вверх и боково. Потяните эти закрылки боковой и приколоть их к поверхности вскрытия, чтобы полностью разоблачить брюшной полости.
Извлекайте желудочно-кишечный тракт с помощью ножниц, чтобы сделать порезы выше желудка и в дистальной области толстой кишки, чтобы обеспечить сбор наибольшего количества содержимого кишечника. При удалении желудочно-кишечного тракта, позаботьтесь, чтобы избежать разрыва отдельных компонентов. Отделять желудок, тонкий кишечник, cecum, и толстой кишки на проксимальных и дистальных концах.
Для сбора содержимого кишечника из каждого раздела, сделать один разрез на дистальной конце, а затем вручную изгнать содержимое кишечника в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки с типсами. Храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию для анализа ex vivo. Streak свежей культуры C.albicans SC5314 на YPD агар пластины и инкубировать его на ночь при 30 градусов по Цельсию.
На следующий день, выбрать два или три средних отдельных колоний и повторно использовать их в один миллилитр PBS. Извлеките замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры и оттайте их при 25 градусах Цельсия. Перенесите около 150 миллиграммов содержимого кишечника в новую 1,5 миллилитровую трубку и повторно посовелите их 150 микролитров PBS.
Vortex образца на высокой скорости в течение 30 секунд, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника и позволить ему сидеть при комнатной температуре около минуты. Центрифуга гомогенатов на 1000 раз G в течение трех минут, а затем передать супернатант в новую трубку 1,5 миллилитров заботы, чтобы не передавать мусор. После повторения центрифуги добавьте 10 микролитров инокулума C.albicans в супернатант, хорошо перемешайте и инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение четырех-пяти часов.
Чтобы проверить влияние экзогенных метаболитов на C.albicans, добавьте желаемую концентрацию метаболитов в содержание кишечника и смеси PBS, затем вихрь образца на высокой скорости в течение 30 секунд, дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут, и выполнять центрифугации и прививки, как описано ранее. Центрифуга грибковой клеточной культуры на 1000 раз G в течение двух минут и отказаться от супернатанта. Зафиксировать образцы в 100 микролитров 2%PFA в течение 15 минут, затем повторить центрифугации и отказаться от супернатанта.
Вымойте образцы дважды одним миллилитром PBS в соответствии с рукописными указаниями, затем инкубировать образцы при комнатной температуре в 100 микролитров PBS с поликлональным антителом C.albicans в течение 30 минут. После инкубации, мыть образец еще три раза с PBS, работая в тусклом свете, чтобы избежать фотоотливания. В темной комнате, инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 15 минут в 100 микролитров PBS, содержащих анти-кролик IgG Alexa Fluor 488 антитела на один до 500 разбавления.
После мытья образца три раза с одним миллилитров PBS, повторно использовать его в 100 микролитров PBS и передать его на 96-хорошо пластины для визуализации. Изображение грибковых клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием объективных линз 20X и 40X и зеленого флуоресцентного белкового фильтра. Когда C.albicans выращивается ex vivo в экстрактах гомогената кишечника, взятых из желудка, тонкого кишечника и толстой кишки необработанных контроля и обработанных антибиотиками мышей, он обычно развивается с дрожжами морфологии.
Однако, когда выращивается в экстракте cecal от антибиотиков обработанных мышей, C.albicans легко проходит морфогенез в результате дрожжей и гифы формы. Это указывает на то, что лечение антибиотиками вызывает изменения в cecal окружающей среды, которые вызывают гипхальный морфогенез C.Albicans. Экзогенное добавление глюкозы в цикальный гомогенат обработанных антибиотиками мышей показало массивное развитие гифаля ex vivo.
Эти результаты показывают, что добавление метаболитов кишечника обратно в цикал гомогенат антибиотико-обработанных мышей дифференциально регулирует морфогенез C.albicans. При попытке этого протокола, имейте в виду, что оптимизация разбавления содержимого кишечника обеспечивает достаточный сбор метаболитов кишечника без сбора мусора. Не превышать два к одному медиа-кишки содержание разбавления и стремиться к более низкой разбавления, если это возможно.
Этот метод в настоящее время используется для изучения того, как конкретные метаболиты в кишечнике влияние гипхал развития, что позволяет исследователям лучше понять роль метаболитов кишечника на грибковый патогенез.
