Различные механические параметры нагрузки могут вызвать сухожилия полученных СТВОЛОВЫх клеток дифференцированы в различные клетки. Мы вводим подробный процесс применения этой трехмерной одноосной механической системы биореакторной стимуляции, чтобы вызвать теногенную дифференциацию стволовых клеток, полученных из сухожилий. Тендинопатия является одним из распространенных спортивных травм в ортопедическом отделении.
Присутствие ахиллесова тендинопатия является наиболее распространенным с до 29% для среднего и дальнего бегунов, в то время как наличие тендинопатии пателлы также высока у спортсменов волейбола, баскетбола, легкой атлетики, гандбола и футбола. Однако, из-за ограниченной способности самовосстановления сухожилия и отсутствия эффективного лечения, тендинопатия по-прежнему оказывает значительное негативное влияние на качество жизни пациентов. Тендон производных STEM-клеток, известный как TDSCs как важные клетки-предшественники клеток сухожилий, играют важную роль в развитии тендинопатии, а также их функциональное и структурное восстановление после тендинопатии.
Однако различные параметры механической нагрузки, такие как нагрузка, частота загрузки, тип загрузки и период загрузки могут вызвать дифференцирование TDSCs в различные клетки. Таким образом, эффективный и действительный режим механической нагрузки очень значителен для генезиса сухожилий. Есть семь этапов настоящего протокола, в том числе изоляция мышей TDSCs, культуры и расширения мышей TDSCs, подготовка стимуляции культуры среды для формирования клеточного листа, формирование клеточного листа путем культивирования в стимуляции среды, подготовка 3D сухожилия STEM клеточной конструкции, сборка одноосных клеток растяжения механической стимуляции комплекса, а также оценка механических стимулировали в пробирке сухожилия, как ткани.
Изоляция мышей TDSCs. Используется у мышей, которые от шести до восьми недель мышей при вывихе шейки матки. Урожай сухожилий коленной чашечки и ахилловых сухожилий.
Дайджест сухожилия с шестью миллилитров типа 1 коллагеназы в течение трех часов. Соберите клетки и культуры его в полном альфа-MEM, содержащий 10% FBS и 1% стрептомицина и пенициллина смеси в течение семи дней. идентифицировать TDSCs с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток по цитометрии потока, экспрессии маркеров поверхности клеток, включая CD44, CD90 и Sca-1.
Отсутствие выражения CD34 и CD45. Прохождение и замораживание клеток. Проходные ячейки будут использоваться для дальнейших шагов.
Культура и расширение мышей TDSCs. Возьмите разогретые сухожилия мышей STEM клетки. Медленно добавьте дополнительные четыре-пять миллилитров полного альфа-MEM.
Перенесите смесь в 15-миллилитровую центрифугу трубчатой трубой. Пополнить со средним в общей сложности восемь миллилитров на пипетки. Поместите трубку в центрифугу, чтобы сбалансировать колодец.
Клетки центрифуги по 347 г в течение пяти минут. Выньй трубку из центрифуги. Проверьте гранулы внизу.
Decant свободной среде. Повторно приостанавливайте ячейки мягко в один-два миллилитра полной среды. Избегайте слишком много пузырьков.
Передача повторно приостановленных ячеек в колбу T75 пипеткой. Используйте пипетку, чтобы добавить полную среду альфа-MEM в колбу, чтобы достичь общего объема 10 миллилитров с конечной концентрацией 13 000 ячеек на квадратный сантиметр. Поместите колбу в инкубатор и культуры его на 37 градусов с 5%углекислого газа.
Изменение среды каждые три дня. Наблюдайте и отслеживайте клетки под микроскопом при изменении среды до тех пор, пока клетки не будут выучены до 100% слияния. Подготовка стимуляции культуры среды для формирования клеточного листа.
Налейте 15 миллилитров полной альфа-MEM среды в 15 миллилитров стерильной трубки. Добавьте шесть микролитров аскорбиновой кислоты в 15 миллилитров среды до конечной концентрации 4,4 микрограмма на миллилитр. Смешайте осторожно, инвертирование вверх и вниз.
Формирование клеточного листа путем культивирования в среде стимуляции. Отбросьте не нормальную полную альфа-МЕМ-среду тщательно. Избегайте прикосновения к клеткам, прикрепленным к нижней части колбы.
Добавить 10 миллилитров стимуляции среды медленно. Избегайте каких-либо нарушений в полностью стеченных клеток. Культура клеток в среде стимуляции в течение девяти дней и изменить средний каждые три дня, чтобы достаточно генерировать лист клеток при 37 градусах с 5% углекислого газа.
Подготовка 3D сухожилия STEM клеточной конструкции. Вывихи колбу из инкубатора. Выброс стимуляции среды полностью.
Вымойте лист ячейки монослой с PBS, закрученных колбу. Отбросьте PBS полностью. Используйте пипетку, чтобы добавить один миллилитр, 0,25%трипсина в угол колбы.
Нажмите на угол колбы, чтобы отсоединить лист ячейки монослой до тех пор, пока угол листа клетки не смоет нижнюю часть колбы. Немедленно добавьте 9 миллилитров вполне средство альфа MEM для того чтобы остановить реакцию трипсинизации. Продолжить закрученного колбу, чтобы полностью снять монослой лист клетки.
Вылейте итог, чтобы прикрепить лист клетки в чашку Петри со средним. Используйте стерильный пинцет, чтобы забрать один угол листа клетки и вращаться по часовой стрелке в течение 15 раз. Возьмите другой конец листа клетки и поверните в направлении против часовой стрелки в течение 10 раз, чтобы сформулировать сухожилие, как в пробирке построить.
Сборка одноосного растяжения механического комплекса стимуляции в уникальном разработанном биореакторе. Подключите крючки к разъему, затем отрегулируйте до двух сантиметров между двумя крючками. Аккуратно ветер 3D TDSCs построить на демо-крюк в течение трех раз на каждом крючке.
Закрепить крючки с клеточной конструкцией на камеру биореактора, затягивая винты на двух концах. Заполните камеру полной альфа-средой MEM. Подключите ускоритель к культурной камере по кабелю.
Разрежьте разъем крючков стерильным пинцетом. Включите контроллер питания и канала, чтобы начать механическую стимуляцию. Положите крышку на камеру, отслеживать индикатор огни, и заверить биореактор может функционировать должным образом.
Поместите биореактор в инкубатор и подвергте конструкцию 3D-клеток механическому растяжению. Режим погрузки составляет 6%, частота герц 0,25, восемь часов с последующим 16-часовой отдых в течение шести дней. Оценка механических стимулировали в пробирке сухожилия, как ткани.
ослабить винты отверткой и снять сборку тщательно. Положите сухожилия, как ткань в 4%PFA для фиксации в течение 15 минут, Место фиксированной сухожилия, как ткань в биопсии кассеты с биопсией от домашних животных. Процесс обезвоживания образца.
И, наконец, оценить по HD гистологического положения. Повторите весь протокол и извлечь РНК из сухожилия, как ткани для оценки экспрессии теногенных маркеров по qPCR. Перед механической стимуляцией TDSCs вырастет до 100% слияния в полной среде и будет отображать дезорганизованную внешнюю структурную морфологию.
Через шесть дней вы увидели растяжения, механической нагрузки, дополнительной клеточной матрицы, и клетки выравнивания были хорошо ориентированы. Клетки были хорошо заселены и хорошо окутаны ECM после механической нагрузки. Морфология клеток была представлена, чтобы быть расположены и был больше похож на нормальные клетки сухожилия по сравнению с тем, с без растяжения.
Плотность ячейки в конструкции ячейки с загрузкой была выше, чем у нее без загрузки. Результаты qPCR показали, что нынешние вопросы увеличили экспрессию теногенных маркеров, в том числе склераксиса, мохока, теномодулина и коллагена типа 1 по сравнению с теми, которые лечатся заявленной культурой. С точки зрения механической стимуляции биореакторной системы, отделенная камера с линейным двигателем была использована в нашем нынешнем протоколе.
Потому что это может обеспечить точную механическую нагрузку, и это портативный и легко регулировать по сравнению с тем, как традиционные 2D-клетки листа и биаксиальной стрейч, 3D-клеточная конструкция больше похожа на реальную форму сухожилия. И одноосный стрейч больше похож на сильные характеристики клеток сухожилий. Это обеспечивает теоретическую основу использования 3D одноосной растянутой системы для стимулирования дифференциации TDSCs.
Таким образом, лист 2D ячейки, наконец, был переправлен в конструкцию 3D-ячейки и прошел одноосный в настоящем протоколе. По данным нашей биореакторной системы, наш режим загрузки составляет 6%, частота 0,25 Герца, восемь часов с последующим 16-часовым отдыхом в течение шести дней. Наконец, эффективность протокола продемонстрировала морфология и уровень экспрессии теногенных маркеров.
Весь процесс работы прост, но оператор должен быть обратить внимание, чтобы сохранить окружающую среду TDSC стерилизованы во все времена. Есть много приложений нашего протокола. Процесс стимулирования TDSCs имитировать дифференциацию in vivo полезен для исследования патологического процесса тендинопатии.
Кроме того, этот протокол обеспечивает воспроизводимый метод направленной дифференциации ТДК в сухожилия, как ткани. Таким образом, он может быть использован просто и эффективно для потенциальной инженерии сухожилия культуры. Таким образом, применение 3D одноосной системы биореакторной стимуляции является простым, экономическим, воспроизводимым и действительным методом для индуцирования теногенной дифференциации TDSCs.
Наш протокол подробно предоставляет весь процесс.
