Drosophila обеспечивает отличную модель для изучения генетических основ чувствительности алкоголя, потому что вы можете количественно чувствительность алкоголя именно под контролируемым генетическим фоном и условий окружающей среды. Современные методы измерения чувствительности алкоголя в Дрозофила тест групп мух. Мы представляем простой, недорогой, высокой пропускной метод для оценки чувствительности алкоголя в большом количестве одиночных мух.
Изменение чувствительности алкоголя в дрозофиле может быть переведено на аналогичные фенотипы у людей, потому что мухи разделяют около 75% своих генов с человеческими ортопедами. Разработанный ими анализ также может быть применен для измерения воздействия острой токсичности летучих веществ на других насекомых, включая другие виды мух или переносчиков болезней. Начните с создания картонного шаблона 24-хорошо пластины клеточной культуры.
След вокруг пластины, и вырезать назначенную область. Затем используйте картонный шаблон, чтобы создать кусок небольшой сетки экрана насекомых размером с тарелку. Поместите небольшую линию горячего клея по периметру 24-хорошо культуры пластины, и прикрепить сетку экрана на верхней части колодцев.
Затем используйте горячий клей пушки для обеспечения деревянные ремесла придерживаться трех сторон культуры пластины. Подготовь как можно больше тарелок в съемочной камере. Для создания съемочной камеры вырежьте отверстие размером с объектив видеокамеры с одной стороны полистироловой коробки и дополнительную щель размером с осветительные площадки на противоположной стороне.
Вставьте осветительные площадки в щель, и распоить камеру в отверстие объектива над подсветкой колодки. Поместите все испытательные материалы в контролируемую среду, предпочтительно поведенческую камеру с влажностью около 30%, температурой 25 градусов по Цельсию, равномерной воздушной потоком и уровнем шума менее 65 децибел. Используйте ранее сделанный картонный шаблон, чтобы нарезать два куска марли.
Затем пипетка один миллилитр 100% этанола через экран сетки в каждой хорошо. Высушите сетку и поместите два куска марли сверху. Вырезать небольшой кусочек тонкой, гибкой, пластиковой разделоченной доски с помощью картонного шаблона в качестве руководства для расширения области на один-два сантиметра на одной из коротких сторон.
После резки, убедитесь, что пластик по-прежнему помещается между тремя деревянными палочками ремесла на испытательном аппарате, но висит с одного конца. Подготовь аспиратор в соответствии с рукописными указаниями, и использовать его для передачи одной мухи на скважину в 24-хорошо пластины клеточной культуры, охватывающих любые скважины с ранее аспирированных мух с гибким пластиком. Завехать положение хорошо и любую соответствующую генотипную или фенотипную информацию каждой мухи.
Держите гибкий пластиковый флеш с верхней частью пластины культуры клеток, содержащих мух, и инвертировать пластину на верхней части модифицированной пластины культуры клеток с этанолом. Используйте палочки корабля для выравнивания перевернутой пластины культуры клеток, убедившись, что каждый хорошо с этанолом выравнивается с каждым хорошо содержащие муху. Убедитесь, что осветительные площадки освещены на полной яркости, и начать запись с видеокамеры.
Выставить мух на этанол, тщательно удаляя пластик между двумя пластинами, убедившись, чтобы не выбить марлю. Когда есть подозрение, что все мухи потеряли постуральный контроль, нажмите твердо в центре пластины. Если есть движение, продолжать записывать, нажав каждые одну-две минуты, пока движение не происходит.
Прекратите запись, как только не будет движения. Чтобы восстановить мух, удалить верхнюю пластину из испытательного аппарата, и аспирировать отдельных мух в выбранные контейнеры. Замените этанол в модифицированных пластинах культуры клеток по крайней мере один раз в час, чтобы поддерживать последовательное воздействие этанола на протяжении всего анализа, и повторить эксперимент для столько образцов, сколько хотелось бы.
Посмотрите видеозапись, чтобы определить время сеяния мухи, которое определяется как момент, когда муха теряет постуральный контроль и способность локомотива. Чтобы обеспечить точность, смотреть фильм в обратном направлении, и записывать время, что муха начинает двигаться. Этот метод может быть использован для генерации данных о большом количестве мух в течение 10 минут.
Две пластины 24-колодец были использованы для одновременного измерения времени эдации этанола для 48 отдельных мух двух линий DGRP с разной чувствительностью к алкоголю. Большие размеры выборки повышают точность и уменьшают погрешность до экологических изменений. RAL_555 были менее чувствительны, чем мухи RAL-177.
Мужчины и самки RAL_177 сексуально диморфического эффекта, в то время как самки линейных RAL_555 менее чувствительны к воздействию этанола, чем самцы. При попытке этого протокола, крайне важно выполнить стремление мух и инверсии пластины клеточной культуры с точностью для достижения желаемого результата. Поскольку способность оценивать одиночных мух позволяет избежать смешанных эффектов из-за групповых взаимодействий, этот анализ повышает полезность модели Дрозофилы для высокой пропускной способности исследований об остром воздействии воздействия алкоголя.
