Этот метод обеспечивает идеальный подход для изучения заживления толстой кишки раны и молекулярных и гистологических изменений, которые происходят после травмы. Этот метод также может пролить свет на патогенез IBD. Основным преимуществом этой техники является точное управление расположением травмы и сроками заживления ран.
Лица, выполняющие этот метод в первый раз может возникнуть трудность вставки колоноскопа в толстой кишке мыши и создания последовательных ран. Повторяющиеся практикующие эти методы должны преодолеть эти проблемы. Учитывая многочисленные скоординированные шаги и нюансы, связанные с этой процедурой, визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение.
Перед началом процедуры вставьте в эндоскоп эндоскоп 1,9-миллиметровый жесткий эндоскоп. И прикрепите собранный эндоскоп к источнику света и устройству видеосъемки в соответствии с инструкциями производителя. Используйте предоставленные трубки, чтобы прикрепить воздушный насос к газовой клапану на левой стороне оболочки рядом с рабочим каналом.
Убедитесь, что рабочий канал находится в открытом положении и вставьте три французских биопсии типсов через рабочий канал. Заранее типсов до конца оболочки, не выступая из оболочки. Затем поместите анестезированной мыши на эндоскопической промежуточной платформы на его брюшной стороне и подтвердить соответствующий уровень сетации из-за отсутствия реакции на педаль рефлекс.
После нанесения глазной мази заполните трехми миллилитровый шприц прикрепленной крысиной иглой с комнатной температурой PBS. И вставьте иглу примерно на один сантиметр в анус мыши. Аккуратно настоять с PBS до тех пор, пока фекальный материал был очищен.
Несколько фекальных гранул должны выйти из мыши вместе с PBS, который был пропитан. Вставьте собранный эндоскоп 0,5 сантиметра в анус и заранее биопсии миппы в очищенной люмен прямой кишки, пока полные челюсти типсов находятся за пределами конца оболочки. Поверните типсы на 90 градусов так, чтобы челюсти открылись в восточно-западной ориентации и открыли кончики и заранее force примерно на один сантиметр, закрывая и убирая типсы одним плавным, быстрым движением, чтобы собрать биопсию.
Чтобы избежать полного переливания толстой кишки во время выполнения биопсии, оставьте правую сторону газового клапана открытой. Сразу же после биопсии, угнетать педаль ноги прилагается к колоноскопу записывающее устройство, чтобы инициировать видеозапись. И твердо нажмите указательный палец на правую сторону газового клапана, чтобы полностью покрыть отверстие, заставляя воздух в эндоскоп и, таким образом, в толстой кишке.
Вытягивать типсы обратно из оболочки и в ректальный люмен в то время как в закрытом положении. И поместите типсы против ректальной стенки прямо над раной, пока основание челюстей не будет выровнено с верхним краем смотрового поля. Продолжить полностью insufflating толстой кишки, пока четкое представление о ране можно наблюдать.
Для того чтобы получить самые лучшие измерения кровати раны, будьте терпеливы после этого поместите колоноскоп на точном угле ТАК, что вы получите ваше самое лучшее изображение кровати раны. Откройте видео в соответствующей программе программного обеспечения и заранее видео на кадр, показывающий момент времени, в котором раневая кровать может быть легко визуализирована. И при этом закрытые типсы находятся над раневой кроватью и у ректальной стены, а стена натянута.
В каждый момент времени, получить снимок этого кадра и код имя файла, чтобы убедиться, что измерения раны кровати проводятся в ослепленный образом. Для количественной оценки размера раны кровать, открыть изображения в ImageJ и использовать инструмент выбор свободной руки, чтобы нарисовать периметр вокруг раны. В соответствии с анализом выберите меру.
И значение этого измерения автоматически заполняется в окне Результатов. Когда все измерения были приобретены, рассчитать размер раны в последующие дни по отношению к размеру на нулевой день в таблице. В соответствующей экспериментальной конечной точке откройте слои кожи и брюшной мышцы, чтобы разоблачить полость тела экспериментального животного и поместите закрытые миппы под толстой кишкой.
Аккуратно поднимите толстой кишки, чтобы освободить его от основной мезентерии и сократить ткани в средней точке и на анус, чтобы собрать его с мыши. Используйте 20 миллилитров шприц заполнен ледяной PBS и оснащен иглой крысы gavage, чтобы избавиться от фекального содержимого. И поместите очищенную толстую кишку на лист фильтровальной бумаги.
Откройте толстой кишки продольно, заботясь о том, что мезентерическая сторона лицом вниз против фильтровальной бумаги. И использовать пастер пипетку для покрытия слизистой оболочки с 0,2%метиленовый синий. Через несколько секунд слейте лишнее пятно и просмотрите толстую кишку под рассечением микроскопа, чтобы найти рану.
Используйте четырехдюймовые ножницы Micro Iris, чтобы разрезать по краю кровати, будьте осторожны, чтобы не нарезать мышечный слой. И использовать пинцет тонкой точки для передачи вскрытой ткани в трубку для оснастки замораживания и / или хранения. В соответствующей экспериментальной конечной точке, откройте собранную толстую кишку продольно на листе фильтровальной бумаги, мезентерической стороне вниз.
Аккуратно покройте ткань с помощью фиксации выбора. Обложка ткани с парафильмом в герметичном контейнере в течение 4 до 6 часов до хранения в 70% этанола. В день обработки снимите парафильм и добавьте в ткань 0,2%метиленовый синий, как попродемонстрировано.
После слива избыточного пятна, поместите ткани под рассечение микроскопа, чтобы найти рану кровать. Используя скальпель с номером 10 лезвие, вырезать непосредственно через центр раны кровать и продолжать резки через оставшуюся часть толстой кишки по прямой линии, так что толстой кишки разрезаются пополам вдоль. Для криозирования, вставлять части толстой кишки так, что сторона, которая была сокращена скальпелем лицом вниз в базовой плесени наполовину заполнены ткани замораживания среды.
Безопасные ткани на месте с тонкой пинцетом и место базовой формы на металлическую пластину или толстую алюминиевую фольгу на вершине сухого льда, чтобы затвердеть замораживания среды. После того, как нижняя часть среды заморожена, заполните оставшийся объем базовой формы с замораживанием среды при комнатной температуре. И вернуть плесень в сухой лед, пока весь блок ткани заморожены.
Затем перенесите форму в морозильную камеру на 80 градусов по Цельсию до секции. Здесь показаны репрезентативные изображения приемлемых видов раневей для точной количественной оценки размера раны кровати и скорости закрытия раны. В этом ex-vivo взгляде кровати раны, индикаторы периметра кровати раны и где отрезать ткань для того чтобы включить визуализацию кровати раны на раздельном подстригове можно наблюдать.
На этом репрезентативном изображении отчетливо виден пятно H и E на раневой кровати. Важно, чтобы приобрести мгновенные изображения раны кровать в любое время точек, чтобы обеспечить точную оценку скорости заживления раны. После биопсии щепотку, различные агенты, представляющие интерес могут быть введены в рану, чтобы проверить их влияние на скорость заживления ран.
