Традиционно, макрофаги было трудно изучить в режиме реального времени химиотаксис анализы, потому что клетки медленно движущихся. Этот протокол предоставляет средства для изображения макрофагов, мигрирующих в хемотаксическом градиенте на срок до шести часов или дольше. По сравнению с анализами имплантатов, такими как анализ переноса, этот метод имеет преимущества, которые можно наблюдать макрофаговой морфологии, и такие параметры, как скорость клеток и химиотаксическая эффективность могут быть измерены.
Макрофаги участвуют во многих воспалительных заболеваниях, и этот метод может быть полезен для изучения препаратов, предназначенных для ингибирования хемотаксиса. Он также может быть применен к другим типам клеток, таких как моноциты человека. При попытке этого метода в первый раз, лучше всего на практике заполнения камер хемотаксиса перед работой с клетками.
Одним из наиболее важных аспектов техники является избегание пузырьков воздуха. Начните с предварительной заполнения соединительных каналов одного или двух слайдов хемотаксиса с модифицированным RPMI 1640 HEPES Medium, подготовленным в соответствии с рукописными указаниями. Поместите слайд в блюдо клеточной культуры и установите блюдо на алюминиевый блок, нагретый до 37 градусов по Цельсию.
Затем вставьте вилки в порты один и четыре. Используйте 200 микролитров скошенный наконечник пипетки, чтобы внести 15 микролитров модифицированного RPMI 1640 HEPES Medium в порт три. Затем вставьте наконечник трубы в порт два, и аспирировать 15 микролитров на умеренно быстрой скорости, которая будет предварительно заполнить соединительный канал, а также два фланговых каналов питания.
Обложка заполнения портов два и три с крышками и место chemotaxis слайд на стойке в закрытой камере влажности в противном случае сухой и углекислого газа инкубатора на 37 градусов по Цельсию. Чтобы изолировать макрофаги, вставьте 24 калибра пластиковый катетер в брюшной полости пожертвовал три-четыре месяца мышь, и использовать пять миллилитров пластиковый шприц для лавы полости с ледяной холодной Хэнк буферной соли раствор без кальция или магния. После сбора лавовой среды в трубке, центрифуга его в 300 раз G в течение 6,5 минут.
Откажитесь от супернатанта и повторно приостановьте клетки в 200 микролитров модифицированной среды RPMI 1640. Разбавить aliquot клеток подвески от одного до 20. Затем используйте счетное устройство для подсчета ячеек.
Разбавить клетки до конечной концентрации 10 раз от 10 до шести клеток на миллилитр, и поддерживать их при 37 градусов по Цельсию в нагретом алюминиевом блоке. Pipet клеточной подвески вверх и вниз пять раз, чтобы уменьшить слипания, и осторожно депозит 10 микролитров на порт три камеры хемотаксиса. Поместите наконечник трубы во второй порт и медленно нарисуйте подвеску ячейки в соединительный канал.
Как только ячейка подвеска была введена, удалить пробки в портах один и четыре, чтобы остановить поток, и место шапки на всех четырех заправочных портов. Затем поместите слайды хемотаксиса в камеру влажности 37 градусов по Цельсию в течение двух-трех часов. Осмотрите зону наблюдения с помощью перевернутого микроскопа.
Затем поместите пробки в заполнение портов один и два, и проверить, является ли заполнение порта три заполнены на вершину со средним, и без пузырьков воздуха. При необходимости используйте стерильную шприц-иглу 27 калибра, чтобы выбить пузырьки воздуха. Далее, аспирировать 60 микролитров среды с 100 микролитров механической трубы, и поместите кончик в заполнение порта три.
Используйте кольцо настройки громкости, чтобы медленно и неуклонно впрыскить среду в резервуар, пока он не достигнет вершины заполнения порта четыре через одну-две минуты. Чтобы заполнить второй резервуар, переместите штепсельную вилку из порта один и медленно вставьте ее в порт три. Аспирировать 50 микролитров среды, и поместите кончик трубы в порт четыре, и медленно ввиснуть среду во второй резервуар, так что он достигает верхней части заполнения порта один через одну-две минуты.
Добавьте 495 микролитров среднего до двух миллилитров микро-центрифуг трубки, и добавить пять микролитров патента синий пять. Кратко вихрь смеси, а затем добавить 5,4 микролитров рекомбинантной мыши Дополнение C5a и вихрь снова смешивать. Убедитесь, что неглубокая депрессия в верхней части порта один является средне-бесплатно, и депозит 15 микролитров синего дополнения C5a содержащие средний.
Затем вставьте 200 микролитровый наконечник трубы в заполнение порта четыре, и медленно поверните кольцо настройки громкости, чтобы привлечь среду в противоположном резервуаре. Нарисуйте воздух в короткий вертикальный столбец заполнения порта один до тех пор, пока жидко-воздушный интерфейс находится на полпути в колонне. Затем подключите порт один, прежде чем осторожно подъема трубы из порта четыре, убедившись, что слайд остается на месте, и медленно подключить порт четыре.
Для выполнения изображений промежуток времени, поместите слайд хемотаксиса на стадии перевернутого микроскопа, оснащенного сценическим инкубатором, и изображение области наблюдения с 10X фазы контрастного объектива, сосредоточив внимание на макрофаге lamellipodia. Слайд хемотаксиса, используемый для видеоскопии замедленного действия микроскопии микрофагов мыши перитонеальной имеет три камеры хемотаксиса, каждая из которых имеет четыре порта заполнения. Клетки были посеяны в зоне наблюдения каждой камеры.
И после двух-трехчасовой инкубации камеры медленно заполнялись медиумом. При осмотре камер в зоне наблюдения было вымыто до двух третей камер. Как правило, слабо адепт B-1 клетки были вымыты, а остальные клетки были преимущественно макрофаги.
Чтобы отличить макрофаги от В-клеток, свежеиспосредованные клетки были помечены специфическими антителами. Макрофаги были помечены зеленой флуоресценцией, В-клетки с красным, и ядра клеток с синим. Макрофаг миграции был исследован путем введения дополнение C5a, химиоаттрактор, в одном из двух резервуаров.
Зафиксированы миграционные пути макрофагов, мигрирующих в градиенте дополнения C5. Точка старта каждого пути миграции была нормализована до X равно нулю, а Y равен нулю для создания участка миграции. Затем была рассчитана скорость клеток и химиотаксическая эффективность отдельных макрофагов.
Этот метод был полезен для изучения роли G белковых подразделений, и Rho GTPases, и макрофаг подвижность в хемотаксис.
