Наш протокол может быть использован для быстрого и легкого тестирования роли любого гена-кандидата в метастатической колонизации и росте. Протокол также позволяет в режиме реального времени контролировать метастазы, образование и рост, а также количественное количество и размер метастазов у тех же животных без необходимости повторного оплодотворения или гистологического окрашивания. Плита четыре Т1 клетки на 150000 клеток на колодец в 12-хорошо пластины в полном росте средств массовой информации.
Инкубировать при 37 градусах по Цельсию 5%углекислого газа в одночасье. На следующий день, аспирировать рост средств массовой информации из клеток. Добавьте 500 микролитров вирусного супернатанта люциферазы и 500 микролитров флуоресцентного белка вирусного супернатанта, чтобы одновременно заразить клетки как люциферазой, так и флуоресцентными белковых вирусных супернатантами.
Затем добавьте один микролитр по восемь миллиграммов на миллилитр гексадиметрина бромистого и инкубировать при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 24 до 48 часов. Трипсинизировать четыре Т1 клетки с 500 микролитров трипсина. Через две-пять минут перенесите все клетки на шестиметровую тарелку в четыре миллилитров отборных средств массовой информации, тем самым утолив трипсин.
После завершения отбора подтвердите, что инфицированные четыре Т1-клетки выражают флуоресцентный белок с помощью перевернутого флуоресцентного микроскопа при 50-100-м увеличении. Также подтвердите, что инфицированные четыре Т1 клетки выражают люциферазы с помощью коммерчески доступных люцифераза деятельности комплекта. Приступить к проведению оптимизации экспериментального дизайна in vivo, как описано в текстовом протоколе.
Аспирировать средства массовой информации и промыть пластины ячейки с 1X PBS. Трипсинизировать клетки с пятью миллилитров трипсина на 15 сантиметров пластины в течение двух-пяти минут и передать все клетки в конической трубки. Вымойте оставшиеся клетки из ткани культуры блюдо с достаточно полного роста средств массовой информации, чтобы утолить трипсина.
Добавьте стирку в ту же коническую трубку. Подсчитайте ячейки с помощью автоматизированного счетчика ячеек, чтобы определить общий номер ячейки. Затем центрифуга клетки в 122 раза G в течение трех минут, и аспирировать супернатант.
Повторное приостановление клеток в 1X PBS при желаемой концентрации. Здесь в каждую мышь вводится 25 000 ячеек и 100 микролитров PBS. Таким образом, повторно приостановленные клетки находятся на уровне 250 000 клеток на миллилитр.
Держите подвески клетки на льду до инъекции. Работая в капюшоне на животном объекте, аккуратно, но тщательно смешать клетки, инвертирование трубки или с помощью одного миллилитров шприца, чтобы убедиться, что они равномерно повторно приостановлено. Теперь загрузите один миллилитр Luer Lock шприц с клеточной подвеской и изгнать избыток пузырьков воздуха.
Поместите по половину дюйма 30 калибровочных игл на шприц с скошенной и изгнать пузырьки воздуха. Аккуратно поместите мышь в удержатель грызунов. Боковой хвост вены должны быть видны и расширены.
Если нет, аккуратно ущипнуть основание хвоста и окунуть хвост в теплую водопроводную воду, чтобы расширить вены. Используйте спиртовую салфетку для очистки хвоста, затем вставьте иглу в хвостовую вену, скошенную сторону вверх и ввелите 100 микролитров клеточной подвески. Если игла правильно вставлена в вену, она должна легко скользить немного вперед и назад, и не должно быть сопротивления, когда поршень толкнул.
Успешные инъекции должны также привести к флеш, в котором синий цвет вены становится белым в течение нескольких секунд после инъекции. Медленно снимите иглу и, используя стерильную марлю, нанесите давление на место инъекции, чтобы остановить кровотечение. Вернуть мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление.
Включите устройство визуализации живых животных in vivo, откройте программное обеспечение для изображения и войдите в систему. Нажмите кнопку инициализации и подождите, пока машина инициализируется. Измените поле зрения на D.For first time use, отредактировать настройки экспозиции, нажав на правку, предпочтения, приобретение и автоматическое воздействие.
Измените максимальное время экспозиции с 60 секунд по умолчанию до 300 секунд и нажмите кнопку "Хорошо". Загрузите один миллилитр шприц с D-люциферин, а затем добавить пополам дюйма 30 калибровочных игл к шприцу и изгнать пузырьки воздуха. Измерьте и замитьте массу обезболивающей мыши.
Сдерживайте мышь, щипать потертости шеи, используя большой палец и указательные пальцы и хватая хвост между мизинец палец и основание руки. Инвертировать мышь под углом 45 градусов с головой, указывающей вниз. Вставьте иглу, скошенную сторону вверх, в левое боковое IP-пространство мыши.
Подтвердите вход в IP-пространство, оттехав небольшой объем. Там не должно быть цвета в основании иглы при опираясь обратно в пространстве IP. Введать соответствующий объем D-люциферина для дозы 150 миллиграммов на килограмм.
Сразу же после D-люциферина администрации, начать таймер. Поместите мышь плашмя на спину в устройство визуализации с носом в носовой конус, и убедитесь, что от половины до двух с половиной процентов изофлюран в настоящее время вводят. Нажмите на люминесцентные и фото коробки.
Измените время экспозиции на автоматическое, а затем нажмите приобрести в панели управления приобретением. После визуализации, вернуть мышь в клетку и контролировать в течение 15 минут, чтобы обеспечить полное восстановление. После эвтаназии, как описано в текстовом протоколе, изолировать и удалить легкие из каждой мыши и промыть в 1X PBS, чтобы удалить избыток крови.
Приобретайте изображения метастазов в долях 10X в Брайтфилде и флуоресценции с помощью флуоресцентного стереоскопа с фильтром GFP. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки размера и количества метастазов на изображениях. Для обработки и анализа данных с изображений, полученных с помощью устройства визуализации живых животных in vivo, откройте все файлы изображений для каждой мыши в программном обеспечении изображения.
Убедитесь, что блоки находятся в сияния для биолюминесцентных данных и эффективности для флуоресцентных данных, нажав на стрелку в левом верхнем левом верхнем части окна изображения и изменив его на соответствующий блок. Используйте изображение из последней точки времени, чтобы создать область интереса, или рентабельность инвестиций, сначала нажав инструменты roi в окне палитры инструментов. Затем вставьте одну roi, нажав на стрелку и выбрав одну.
Нажмите на границу roi и перемести его к груди мыши. Отрегулируйте размер roi поэтому оно покрывает комод мыши и не исключает сигнал. Затем щелкните меру ROIs и скопировать или ввести необработанный номер в лист Excel.
Участок и анализ данных, описанных в текстовом протоколе. Нажмите правой кнопкой мыши в файле изображения, чтобы скопировать ROI, а затем вставить его в файлы изображений из других точек времени и нажмите кнопку измерения ROIs. Ретровирусный вектор, выражаюющий тандемные шРН-30 на основе миР-30, ориентированные как на YAP, так и на ТАЗ, снижает экспрессию YAP и налоговый белок и транскрипционную активность в четырех клетках Т1.
Четыре клетки люциферазы T1 были стабилико трансдуцированы с помощью йСГрин, выражаю выражали версию этого тандема вектора ЯП/ТАЗ шРНК или управляемой миР-30 на основе шРНК. Биолюминесцентные изображения показывают, что скорость, с которой метастатическое бремя увеличилось, была значительно быстрее у мышей, введенных с контрольными клетками по сравнению с мышами, введенными с яП /ТАЗ нокдаун клеток. Сюжет преобразованного сигнала люциферазы log10, измеренного для каждой мыши в ходе эксперимента, также показывает, что скорость была быстрее у мышей, вводимых с контрольными клетками, по сравнению с мышами, введенными с нокдаунными клетками YAP/TAZ.
Значительно меньше метастазов образуется у мышей, вводимых с ЯП / ТАЗ нокдаун клеток по сравнению с мышами с контрольными клетками при счете вручную. Такая же тенденция наблюдалась при использовании программного обеспечения для анализа изображений. Мало того, что гораздо больше метастазов форме в контроль мышей, но они, как правило, больше.
Последовательно метастатическое бремя в легких также резко уменьшилось в нокдауне YAP/TAZ. Успешная инъекция равного количества здоровых клеток в каждую мышь имеет решающее значение для обеспечения высокого качества данных. Не забудьте соблюдать осторожность и следовать рекомендациям по безопасности при работе с инфекционными ретровирусами и лентивирусами, особенно если вирусы являются инфекционными для человека.
Этот метод позволил нам проиллюстрировать роль генов-кандидатов и метастатической колонизации и роста, обеспечивая способ выявления и тестирования новых терапевтических целей для лечения метастатических заболеваний. После этой процедуры метастазы, содержащие легкие, могут быть дополнительно проанализированы иммунофлуоресцентным или гистологическим окрашиванием, чтобы исследовать, как измененный ген влияет на метастазы и определить другие белки, которые могут быть вовлечены.
