Nuestro protocolo se puede utilizar para probar rápida y fácilmente el papel de cualquier gen candidato en la colonización metastásica y el crecimiento. El protocolo también permite el monitoreo en tiempo real de la metástasis, la formación y el crecimiento, así como la cuantificación del número y tamaño de la metástasis en los mismos animales sin necesidad de resección o tinción histológica. Placa cuatro células T1 a 150.000 células por pozo en una placa de 12 pozos en medios de crecimiento completos.
Incubar a 37 grados Celsius 5% dióxido de carbono durante la noche. Al día siguiente, aspirar los medios de crecimiento de las células. Añadir 500 microlitros de sobrenadante viral luciferasa y 500 microlitros de sobrenadante viral de proteína fluorescente para infectar simultáneamente las células con la luciferasa y los sobrenadantes virales de proteína fluorescente.
Luego, agregue un microlitro de ocho miligramos por mililitro de bromuro de hexadimetrina e incubar a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono durante 24 a 48 horas. Trypsinize las cuatro células T1 con 500 microlitros de trippsina. Después de dos a cinco minutos, transfiera todas las células a un plato de seis centímetros en cuatro mililitros de medios de selección, apagando así la trippsina.
Una vez completada la selección, confirme que las cuatro células T1 infectadas expresan proteína fluorescente ZsGreen utilizando un microscopio fluorescente invertido de 50 a 100 veces el aumento. También confirme que las cuatro células T1 infectadas están expresando luciferasa utilizando un kit de actividad de luciferasa disponible comercialmente. Proceda a realizar la optimización del diseño experimental in vivo como se describe en el protocolo de texto.
Aspirar el medio y enjuagar las placas celulares con 1X PBS. Pruebe las células con cinco mililitros de tripina por placa de 15 centímetros durante dos a cinco minutos y transfiera todas las células a un tubo cónico. Lave las células restantes del plato de cultivo de tejido con suficientes medios de crecimiento completos para saciar la trippsina.
Agregue el lavado al mismo tubo cónico. Cuente las celdas utilizando un contador de celdas automatizado para determinar el número de celda total. A continuación, centrifugar las células a 122 veces G durante tres minutos, y aspirar el sobrenadante.
Vuelva a suspender las células en 1X PBS a la concentración deseada. Aquí, se inyectan 25.000 células en cada ratón y 100 microlitros de PBS. Así que las células re-suspendidas están en 250.000 células por mililitro.
Mantenga las suspensiones celulares sobre hielo hasta la inyección. Trabajando en una campana en la instalación animal, mezcle suavemente pero a fondo las células invirtiendo el tubo o utilizando una jeringa de un mililitro para asegurarse de que se vuelvan a suspender uniformemente. Ahora, cargue una jeringa Luer Lock de un mililitro con la suspensión celular y expulse el exceso de burbujas de aire.
Coloque una aguja de calibre 30 de media pulgada en la jeringa con el bisel hacia arriba y expulse las burbujas de aire. Coloque suavemente el ratón en un limitador de roedores. La vena lateral de la cola debe ser visible y dilatada.
Si no es así, pellizca suavemente la base de la cola y sumerge la cola en agua tibia del grifo para dilatar las venas. Use una toallita con alcohol para limpiar la cola, luego inserte la aguja en la vena de la cola, bisele el lado hacia arriba e inyecte 100 microlitros de suspensión celular. Si la aguja se inserta correctamente en la vena, debe deslizarse ligeramente hacia adelante y hacia atrás, y no debe haber resistencia cuando se empuja el émbolo.
Las inyecciones exitosas también deben dar lugar a un lavado en el que el color azul de la vena se vuelve blanco durante unos segundos después de la inyección. Retire lentamente la aguja y, con una gasa estéril, aplique presión en el lugar de la inyección para detener cualquier sangrado. Vuelva a colocar el ratón en su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa.
Encienda el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, abra el software de imágenes e inicie sesión. Haga clic en el botón de inicialización y espere a que el equipo se inicialice. Cambie el campo de visión a D.Para el primer uso, edite la configuración de exposición haciendo clic en editar, preferencias, adquisición y exposición automática.
Cambie el tiempo máximo de exposición de los 60 segundos predeterminados a 300 segundos y haga clic en Aceptar. Cargue una jeringa de un mililitro con D-luciferina, luego agregue una aguja de calibre 30 de media pulgada a la jeringa y expulse las burbujas de aire. Mida y registre la masa de un ratón anestesiado.
Restringe el ratón pellizcando el rasguño del cuello usando los dedos del pulgar y el puntero y agarrando la cola entre el dedo meñique y la base de la mano. Invierta el ratón en un ángulo de 45 grados con la cabeza apuntando hacia abajo. Inserte la aguja, biselada hacia arriba, en el espacio IP del lado izquierdo del ratón.
Confirme la entrada en el espacio IP recuperando un pequeño volumen. No debe haber color en la base de la aguja al volver a dibujar en el espacio IP. Inyectar el volumen adecuado de D-luciferina para una dosis de 150 miligramos por kilogramo.
Inmediatamente después de la administración de D-luciferin, inicie un temporizador. Coloque el ratón plano sobre su espalda en el dispositivo de imágenes con su nariz en el cono nasal, y asegúrese de que se está administrando un medio a dos y medio por ciento de isoflurano. Haga clic en los cuadros luminiscentes y fotográficos.
Cambie el tiempo de exposición a automático y, a continuación, haga clic en adquirir en el panel de control de adquisición. Después de la toma de imágenes, devuelva el ratón a su jaula y monitoree durante 15 minutos para garantizar una recuperación completa. Después de la eutanasia, como se describe en el protocolo de texto, aislar y eliminar los pulmones de cada ratón y enjuagar en 1X PBS para eliminar el exceso de sangre.
Adquiera imágenes de metástasis ZsGreen en los lóbulos a 10 veces en Brightfield y fluorescencia utilizando un estereoscopio fluorescente con un filtro de banda ancha GFP. Utilice el software de análisis de imágenes para cuantificar el tamaño y el número de metástasis de las imágenes. Para procesar y analizar los datos de las imágenes adquiridas con el dispositivo de imágenes de animales vivos in vivo, abra todos los archivos de imagen para cada ratón en el software de imagen.
Asegúrese de que las unidades estén radiantes para los datos bioluminiscentes y la eficiencia de los datos fluorescentes haciendo clic en la flecha en la parte superior izquierda de la ventana de la imagen y cambiándola a la unidad adecuada. Utilice la imagen desde el último punto de tiempo para crear una región de interés, o ROI, haciendo clic primero en Las herramientas de ROI en la ventana de la paleta de herramientas. A continuación, inserte un ROI haciendo clic en la flecha y seleccionando uno.
Haga clic en el borde del ROI y muévalo al pecho del ratón. Ajuste el tamaño del ROI para que cubra el pecho del ratón y no excluya la señal. A continuación, haga clic en medir ROI y copie o escriba el número sin procesar en una hoja de Excel.
Trazar y analizar los datos como se describe en el protocolo de texto. Haga clic con el botón derecho en el archivo de imagen para copiar el ROI, luego péguelo en archivos de imagen de los otros puntos de tiempo y haga clic en medir ROI. El vector retroviral que expresa shRNAs basados en en tándem miR-30 dirigidos a YAP y TAZ reduce la expresión y actividad transcripcional de proteínas fiscales y YAP en cuatro células T1.
Cuatro células luciferasas T1 fueron transducidas de forma estable con una versión ZsGreen que expresaba este vector YAP/TAZ shRNA tándem o un arnesco controlado basado en miR-30. Las imágenes bioluminiscentes muestran que la velocidad a la que aumentó la carga metastásica fue significativamente más rápida en los ratones inyectados con células de control en comparación con los ratones inyectados con células knockdown YAP/TAZ. Una gráfica de la señal de luciferasa transformada log10 medida para cada ratón en el transcurso del experimento también muestra que la velocidad fue más rápida en los ratones inyectados con las células de control en comparación con los ratones inyectados con células de derribo YAP/TAZ.
Significativamente menos metástasis formadas en los ratones inyectados con las células knockdown YAP/TAZ en comparación con los ratones con células de control cuando se cuentan manualmente. Se observó la misma tendencia cuando se utiliza el software de análisis de imágenes. No sólo se formaron muchas más metástasis en los ratones de control, sino que generalmente eran más grandes.
Consistentemente, la carga metastásica en los pulmones también se redujo drásticamente por derribo de YAP/TAZ. La inyección exitosa de igual número de células sanas en cada ratón es fundamental para garantizar datos de alta calidad. Recuerde tener cuidado y seguir las pautas de seguridad cuando trabaje con retrovirus infecciosos e lentivirus, especialmente si los virus son infecciosos humanos.
Esta técnica nos ha permitido ilustrar las funciones de los genes candidatos y la colonización y el crecimiento metastásicos, proporcionando una manera de identificar y probar nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de la enfermedad metastásica. Después de este procedimiento, las metástasis que contienen pulmones se pueden analizar más a fondo mediante tinción inmunofluorescente o histológica para investigar cómo el gen alterado está influyendo en las metástasis e identificar otras proteínas que pueden estar involucradas.
