Анализ боковых популяций клеток является одним из широко используемых методов выделения и идентификации раковых стволовых клеток из опухолевых тканей и линий опухолевых клеток. Этот анализ удобен, быстр и экономичен. Этот метод может способствовать лучшему пониманию влияния генов или других внеклеточных и внутриклеточных сигналов на свойства стволовых клеток опухолевых клеток.
Многие факторы могут влиять на процент SP-клеток в этом анализе, поэтому очень важно изучить надлежащие условия до формального эксперимента. Засевают опухолевые клетки в шестиямяцную пластину и инкубируют их в инкубаторе с 37 градусами Цельсия, снабженном 5% углекислым газом. Когда плотность клеток достигнет около 90%, аспирируют культурную среду и дважды промывают клетки тремя миллилитрами PBS.
Затем добавьте 500 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА в каждую лунку и инкубируем пластину при 37 градусах Цельсия в течение одной-трех минут. Осторожно постучите по пластине, чтобы отсоединить клетки, добавьте три миллилитра PBS, дополненных 2% FBS, в каждую лунку, и пипеткой клетки вверх и вниз три-пять раз, чтобы рассеять сгустки клеток. Исследуйте клеточную суспензию под микроскопом.
Если клеточные сгустки присутствуют, пропустите суспензию через 70-микрометровый сетчатый фильтр. Переложите ячейки в 15-миллилитровую центрифужную трубку и центрифугируют их в 200 раз в г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендировать клетки в трех миллилитрах PBS, дополненных 2% FBS, пипетируя клетки вверх и вниз три-пять раз для смешивания.
Подсчитайте клетки под микроскопом с помощью гемоцитометра и разбавьте их в PBS, дополненном 2% FPS, до конечной концентрации в один раз 10 до шести клеток на миллилитр. Подготовьте две пятимиллилитровую, полистирольные, круглодонные пробирки и добавьте по одному миллилитру клеточной суспензии в каждую пробирку. Пометьте одну трубку как пробирку, а другую как блокируруюруюрую управляя трубку.
Готовят раствор блокатора, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в блокатор контрольной трубки и хорошо перемешайте, затем инкубируйте трубку при 37 градусах Цельсия в течение 30 минут. Встряхивая тюбик каждые 10 минут.
Готовят раствор Hoechst 33342, разбавляя его до соответствующей концентрации. Добавьте его в пробирку и блокатор контрольной трубки отдельно и хорошо перемешайте, затем инкубируйте пробирки при 37 градусах Цельсия в течение 60 минут. Встряхивая тубы каждые 10 минут.
После инкубации центрифугируют клетки в течение пяти минут при 200 раз г и четырех градусах Цельсия, затем осторожно аспирируют супернатант. Повторно суспендировать клетки в каждой трубке одним миллилитром ледяного PBS, дополненного 2% FBS, затем пипеткой клетки вверх и вниз для смешивания. Добавьте один микролитр одного миллиграмма на миллилитр йодида пропидия, или PI, в каждую трубку и перемешайте.
Перейдите на вкладку Параметры в программном обеспечении проточного цитометра. Сначала выберите параметры FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Во-вторых, выберите логарифмическую шкалу для параметра PI.
Наконец, выберите шкалы площади и ширины для параметров FSC, SSC, Hoechst Blue, Hoechst Red и PI соответственно. Сначала запустите ячейки из пробирки, затем запустите ячейки из блокаторной контрольной трубки, используя те же напряжения и затворы. Соберите от 20 до 100 000 событий из каждого образца, чтобы проанализировать процент SP-клеток.
Этот метод был использован для определения доли SP-клеток в клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-231. Точечный график FSC-A против PI-A показал популяцию мертвых клеток, клеточного мусора и основную популяцию PI-отрицательных клеток, которая была подвергнута дальнейшему анализу. Для анализа доли клеток, обработанных резерпином, была использована популяция одной клетки, выделенной из точечного графика FSC-A против FSC-W и точечного графика SSC-A против SSC-W, которая составляла около 0,9% в необработанных клетках и около 0,09% в клетках, обработанных резерпином.
Различные концентрации окрашивания Hoechst 33342 были протестированы на клетках MDA-MB-435, и было определено, что два микрограмма на миллилитр были оптимальными для анализа SP. Низкие концентрации затрудняли различие SP-клеток от других популяций, в то время как высокие концентрации вызывали исчезновение SP-клеток. Верапамил и резерпин были протестированы для определения правильного блокатора для клеток MDA-MB-435.
Около 0,4% клеток изгоняли краситель после лечения верапамилом, но соотношение снизилось примерно до 0,1% после лечения резерпином, демонстрируя, что резерпин является более подходящим блокатором для этой клеточной линии. Этот протокол также использовался для определения доли SP-клеток в клетках аденокарциномы легкого A549 человека, обработанных активатором STAT3 коливелином, и в клетках рака молочной железы человека T47D, обработанных ингибитором FRA1 SKLB816. Этот анализ дает ключ к регуляторным эффектам сигнальных путей на особенности раковых стволовых клеток и облегчает открытие новых механизмов, которые в конечном итоге могут направлять таргетную терапию опухолей.
