Этот протокол имеет важное значение, поскольку он описывает модель для хронической инфекции Pseudomonas aeruginosa раны без необходимости в имплантации иностранного материала или подавления иммунитета. Задержка прививки с Pseudomonas aeruginosa 24 часов после полной толщины excisional раны prostalls быстрого очистки и распространения бактерий, создание инфекции, которая длится от семи до 10 дней. Эта уникальная модель будет полезным инструментом для исследования бактериального патогенеза, взаимодействия патогенов хозяина, а также разработки новых методов лечения хронических инфекций pseudomonas aeruginosa ран.
Помогать мне в демонстрации процедуры будет Дэн Лю, студент-медик из Боллики лаборатории. Перед началом процедуры, вес анестезии от восьми до 12 недель мышь, чтобы получить базовый вес и поместить мышь в положении склонны. Подтвердив отсутствие реакции на педаль рефлекса, подкожно вводят мышь с 250 микролитров предварительно разогретого стерильного 0,9% хлорида натрия на каждом фланге.
Используйте электрическую бритву, чтобы удалить волосы из спинной области мыши и применить тонкий слой крема для депиляжа к открытой коже. Через 20-60 секунд удалите волосы и лишний лосьон с марлей, увлажненной в теплой воде. Для полной толщины excisional раны хирургии, сначала используйте 25 калибровочных иглы подкожно вводить 0,6 до одного миллиграмма на килограмм устойчивого выпуска бупренорфина в середине спинной области мыши и протрите хирургического сайта в круговой образом с тремя альтернативными стерильными бетадина и спирта тампоны.
Поместите пластиковые цепляться-обернуть драпировку над хирургическим сайтом и растянуть кожу тугой caudally. Когда кожа высохла, использовать стерильные шесть миллиметров диаметром кожи биопсии удар, чтобы сделать первоначальный разрез через левый спинной эпидермис, а затем второй разрез на правой спинной эпидермис. Используйте типсы, чтобы палатка кожи из центра левой очерченной области раны и использовать ножницы, чтобы подрезать эпидермальных и кожных слоев.
После повторения разреза справа очерченной области раны для создания симметричных эксцизных ран, промыть обе раны с помощью 50 микролитров стерильного солевого раствора. Когда хирургическое место и окружающая кожа высохли, накройте раны и спину прозрачной пленкой и поместите мышь в чистую клетку на грелку с мониторингом до полного лежачих. Через 24 часа после операции снова взвесим повторно анестезированную мышь и ввишаем животному подкожно 250 микролитров предварительно разогретого стерильного 0,9% хлорида натрия на обоих флангах.
Далее загрузите 100 микролитров люминесцентной подвески штамма P.aeruginosa в 500 микролитровый шприц безопасности tuberculin, оснащенный иглой 27 калибра и введите 40 микролитров подвески бактерий через прозрачную пленку, одеваясь в каждую рану. Убедитесь, что бактериальная суспензия хорошо смешана и что прозрачная повязка не повреждена. Убедитесь, что вы прокол прозрачной повязкой только один раз с иглой безель сторону вверх.
Затем верните мышь в клетку на нагревательной странице с мониторингом и обеспечьте высококалорийную пищевую добавку, зажатую между пищевыми гранулами на полу клетки. Плита оставшихся инокулум на пластине LB агар и рассчитывать колоний, чтобы подтвердить количество бактерий, которые были введены. Для визуализации инфицированных ран следуйте протоколам сдерживания уровня биобезопасности 2 для транспортировки мышей в прибор визуализации и из него и поместите анестезированной мыши в положение, подверженное изображению, в камере визуализации.
В программном обеспечении для визуализации установите время экспозиции, binning, f-stop и поле зрения, как это уместно для эксперимента. Далее создайте область интереса на месте раны и измерьте средний обнаруженный поток в фотонах в секунду. Чтобы измерить фон, создайте область интереса над случайной областью на платформе изображений и вычесть фоновое число фотонов в секунду.
В конце эксперимента, в кабинете биобезопасности, используйте стерильные ножницы и типсы, чтобы подакцизировать раненные кровати и поместить каждую кровать в один миллилитр стерильного PBS в 1,5 миллилитровую полипропиленовую трубку. Измельчите раневую ткань ножницами и инкубировать кусочки ткани на шейкере при четырех градусах Цельсия за 300 оборотов в минуту в течение двух часов. В конце инкубации, вихрь каждой трубки в течение 10 секунд, прежде чем последовательно разбавленной бактериальных сточных вод в PBS и покрытие разбавленных бактериальных стоков на LB агар для количественной оценки бактериального бремени.
Это репрезентативное изображение, полученное с помощью оптической системы визуализации, показывает, что эта модель приводит к обнаруживаемой люминесценции. В этом эксперименте, инфекция достигла пика на третий день после прививки и сохраняется семь дней после прививки на основе как биолюминесценции и колонии рассчитывает. Культура бактерий, изолированных от раны, еще раз показывает, что квантифицированная колония, образуя единицы на рану, коррелирует с обнаруженной люминесценцией.
Хотя есть первоначальная быстрая потеря веса сразу после инъекции, солевые инъекции и дополнительное питание может восстановить мышей их первоначального веса. Расчетная доза прививки, 50% ран которой будут существенно инфицированы, определена примерно в 7,7 раза в 10 раз до второй колонии, образующей единицы на миллилитр. Дозы выше, чем один раз от 10 до четвертой колонии формирования единиц на миллилитр привести к 100% инфекции.
Различные актуальные и системные методы лечения могут быть применены после раны и прививки процедур для изучения новых потенциальных методов лечения Pseudomonas aeruginosa. Вся работа с Pseudomonas aeruginosa и инфицированных мышей должны быть проведены с BSL-2 меры предосторожности в соответствии с институциональной биобезопасности исследователя и животных руководящих принципов комитета.
