В этом протоколе описывается производство иммунотерапевтических резус Т-клеток, которые выражают два белка: противовирусный рецептор химерного антигена и рецептор хемокина CXCR5, который нацелен на клетки лимфоидных фолликулов. Эта относительно быстрая девятидневная процедура производит Т-клетки с менее дифференцированным фенотипом центральной памяти с потенциалом для длительного стойкого после вливания в животных. Адаптация этого метода к клеткам человека позволит выработать иммунотерапевтические Т-клетки, которые могут вызвать долгосрочную ремиссию к ВИЧ без введения антиретровирусных препаратов.
Этот метод может быть широко использован для производства резус Т-клеток, выражаюх другие белки, представляющие интерес. И с незначительными изменениями, он может быть использован для генерации транс индуцированных Т-клеток в других видах, включая людей. Успех трансдукции зависит от здоровых стимулированных ПКМК.
Необходимо позаботиться о сборе, транспортировке и хранении. Перед трансдукции, важно визуально оценить стимуляцию клеток. Начните с оттаивания первичных РЕЗУС ПКМК.
Инкубировать клетки в 37 градусов по Цельсию водяной бане с нежным возбуждением, пока только небольшое количество льда остается. Аккуратно пипетку клетки в коническую трубку. Затем промыть флакон одним миллилитром основной среды и медленно добавить его в клетки.
Медленно добавьте в клетки дополнительные девять миллилитров теплой основной среды. Поместите трубку в аэрозольную канистру и центрифугировать ее в 600 раз г в течение пяти минут при 22 градусах Цельсия. Аспирировать супернатант и повторно гранулы в небольшом количестве среднего роста.
Чтобы подсчитать клетки, добавьте 10 микролитров клеток в 10 микролитров трипан-синего цвета. Загрузите слайд камеры и вставьте его в счетчик. Нажмите кнопку захвата, чтобы посчитать ячейки.
Рассчитайте общее количество клеток путем умножения концентрации клеток по объему и разбавляйте их до двух миллионов клеток на миллилитр в среде роста. Добавьте анти-CD28 для окончательной концентрации в пять микрограмм на миллилитр. Затем пипетки от трех до шести миллионов клеток на колодец в анти-CD3 покрытием пластин.
Инкубировать пластины в течение двух дней при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Разогреть центрифугу до 32 градусов по Цельсию, запуская ее в 2000 раз г в течение примерно 30 минут. Между тем, тепло как сыворотки свободных и роста средств массовой информации в 37 градусов по Цельсию водяной бане и оттепели вирус с нежным закрученного в 37 градусов по Цельсию водяной бане.
Затем поместите его на лед. Разбавить вирус до предопределенного оптимального множественности инфекции в среде, свободной от сыворотки. Добавьте два миллилитров разбавленного ретровируса к каждому колодец фибронектиновой пластины, используя только средства массовой информации для отрицательных контрольных клеток.
Поместите пластины в довоенную центрифугу в микроплесяные носители и центрифуга их на 2000 раз г в течение двух часов. При немедленном использовании аспирировать препарат вируса из скважин и добавить два миллилитров среднего роста. Проверьте стимулируемые ПМГ под перевернутым микроскопом.
Клетки должны быть круглыми, яркими, и они должны рефрактировать свет. Они также должны иметь слипшиеся внешний вид, указывающий на стимуляцию. Соберите клетки-мишени и перенесите их в коническую трубку на 50 миллилитров.
Промыть каждый хорошо один раз с одним миллилитром среднего роста и добавить, что в трубку. Затем подсчитайте ячейки, как это было продемонстрировано ранее. Пеллет клетки центрифугирования их в 600 раз г в течение пяти минут при 32 градусов по Цельсию.
Аспирировать средства массовой информации из гранул и повторного перерасхода клеток в среде роста в концентрации 1,5 миллиона клеток на миллилитр. Добавьте один миллилитр клеточной суспензии к каждому вирусу покрытием хорошо и добавить MAC трансдуцовых клеток фибронектин покрытием скважин, которые не получили вирус. Центрифуга пластин на 1000 раз г в течение 10 минут при 32 градусах по Цельсию и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 48 часов.
Работа с резус-клетками и гамма-ретровирусами требует использования средства индивидуальной защиты, такого как лабораторные пальто и перчатки, и работа должна проводиться в кабинете биобезопасности. Все пипетки и растворы должны быть обеззаражены. Pipette содержание каждого хорошо вверх и вниз с пяти миллилитров пипетки для повторного перерасхода клеток и передать их в 50 миллилитров конической трубки.
Добавьте один миллилитр среды роста к каждой хорошо и пипетки вверх и вниз, чтобы удалить приверженцы клеток. Затем подсчитайте ячейки, как описано ранее. Центрифуга клетки при 600 раз г в течение 10 минут при 25 градусах по Цельсию.
Затем аспирировать средства массовой информации и повторно использовать клетки в средствах расширения концентрации одного миллиона клеток на миллилитр. Семя пять миллилитров клеток в каждый газ проницаемой хорошо из шести-хорошо пластины и тщательно слой дополнительных 25 миллилитров расширения средств массовой информации на колодец. Затем инкубировать клетки спокойно при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение четырех дней.
Чтобы собрать клетки из колодцев, удалите и выбросьте 20 миллилитров средств массовой информации, заботясь о том, чтобы не беспокоить клетки. Pipette оставшихся средств массовой информации вверх и вниз, чтобы выбить клетки. Используйте стерильную трубу передачи, чтобы промыть каждый колодец с тремя миллилитров средств массовой информации и собирать остаточные клетки.
Затем подсчитайте их, чтобы проверить номер ячейки и жизнеспособность. Этот протокол был использован для трансдукции и расширения клеток от шести различных животных. Газоназные скважины были посеяны при стартовой плотности в пять миллионов клеток, и после четырех дней роста была достигнута средняя плотность 55,6 миллиона клеток на скважину.
Жизнеспособность ячеек, контролируемых trypan синим исключением, поддерживалась на уровне от 83 до 95% на протяжении всего протокола. Цитометрия потока использовалась для наблюдения за совместной экспрессией транс индуцированных генов. На пятый день, медиана 42,8% клеток были трансдуцированы как с CD4-MBL CAR и CXCR5.
В то время как на девятый день, медианное выражение было 47,6% с одним раундом трансдукции. Цитометрия потока также использовалась для мониторинга фенотипа памяти. До трансдукции и расширения были выявлены наивные популяции центральной памяти и памяти эффектора.
Наивное население было потеряно с культивированием и клетки были главным образом центральными клетками памяти днем 5 и днем 9. Успех в трансдукции зависит от использования высококачественных реагентов, высоко жизнеспособных клеток и титульного вируса, а также последовательно следуя срокам протокола. Клетки могут быть использованы для функциональных анализов, включая миграцию и вирусное подавление анализов, а также для вливания в животных для доклинических исследований, чтобы проверить эффективность иммунотерапии.
Мы продвинулись вперед с доклинологическим тестированием Т-клеток CAR и CXCR5 у животных и надеемся в скором времени протестировать эту иммунотерапию у ВИЧ-инфицированных людей.
