Этот метод может быть использован для генерации клеточных сфероидов из отдельных и нескольких типов клеток с помощью платформы lab-on-a-CD, новаторской системы быстрого поколения сфероидов. Техника использует центробечные силы для депонирование клеток в назначенных микроуровн, что позволяет последовательное восторг нескольких типов клеток для производства различных сфероидов. Для изготовления чипов культуры CMS сначала сделайте поликарбонатные формы для верхних и нижних слоев чипа культуры с помощью компьютерной обработки численного управления.
Следующая смесь PDMS базы и PDMS лечения агента на 10 к одному соотношению в течение пяти минут, прежде чем поместить смесь в desiccator в течение одного часа, чтобы удалить пузырьки воздуха. Налейте дегазированную смесь PDMS в формы чипа культуры CMS, и поместите формы в desiccator еще на один час, чтобы удалить любые пузырьки воздуха. В конце второго дегазации, вылечить смесь в тепловой камере при температуре 80 градусов по Цельсию в течение двух часов, прежде чем поместить чипы в пылесос плазменный очиститель с поверхностями, которые будут связаны лицом вверх.
Подвергайте культурные чипы плазме с воздухом мощностью 18 Вт в течение 30 секунд и свяжьте два слоя чипа в тепловой камере при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 30 минут, чтобы увеличить силу адгезии. Затем стерилизовать чип культуры CMS в автоклаве при 121 градусе по Цельсию в течение 15 минут. Чтобы подготовить клетки к образованию сфероидов, оттаивать один миллилитровый флакон, содержащий от пяти до 10 раз 10 до пяти клеток, представляющих интерес в 36,5 градусов по Цельсию водяной бане в течение двух минут, прежде чем добавить один миллилитр DMEM в клетки с нежным смешивания.
Затем добавьте клетки в чашку Петри диаметром 150 миллиметров, содержащую 15 миллилитров среды 36,5 градусов по Цельсию, и поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры в течение 24 часов. На следующий день замените супернатант на 15 миллилитров свежего DMEM и верните клетки в инкубатор. Чтобы отделить клетки, создать культуру с четырьмя миллилитров трипсина в течение четырех минут при 36,5 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа, останавливая реакцию со свежей средой, когда клетки подняли со дна блюда.
Чтобы обозначить клетки, тепло соответствующий краситель флуоресценции клеток к комнатной температуре, прежде чем добавить 20 микролитров антетрия диметилсульфсид для флакона, чтобы получить один миллимолярный раствор. Разбавить флуоресценцию до окончательной рабочей концентрации одного микромолара в DMEM, и добавить краситель в клеточной подвески интереса с нежным смешивания. Затем поместите клетки в инкубатор культуры клеток на 20 минут.
Для формирования монокультурного сфероида сначала добавьте 2,5 миллилитров 4%Pluronic F-127 раствора в отверстие в входе чипа культуры CMS при повороте чипа на 500-1000 вращений в минуту. Когда все решение будет добавлено, поверните чип на 4000 оборотов в минуту в течение трех минут с помощью системы CMS. В конце вращения инкубировать культуру чип ночь на 36,5 градусов по Цельсию на 5%углекислого газа.
На следующее утро снимите раствор Pluronic и вымойте культурный чип DMEM. После высыхания чипа в течение 12 часов на чистой скамейке, добавить 2,5 миллилитров среды в порт вход, и повернуть чип на 4000 оборотов в минуту в течение трех минут. В конце вращения замените 100 микролитров среды в входном порту на 100 микролитров подготовленной клеточной подвески, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 вращений в минуту.
Затем поверните чип на 3000 вращений в минуту в течение трех минут, чтобы поймать клетки в каждом микроуэлле центробежной силой, прежде чем поместить чип в инкубатор культуры клеток в течение трех дней, обновляя среду, как помояно каждый день. Для генерации концентрической сфероидной кокультуры добавьте первую популяцию клеток в 100 микролитров среды в входный порт чипа, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту, а затем три минуты вращения при 3000 вращениях в минуту. В конце вращения добавьте 100 микролитров второй популяции клеток, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту, и поверните чип на 3000 оборотов в минуту в течение еще трех минут.
Когда оба тома клеток были введены, поместите чип в инкубатор клеточной культуры на 1000-2000 вращений в минуту в течение 24 часов. Для образования сфероидов Janus добавьте 100 микролитров первой популяции клеток, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 вращений в минуту, а затем три минуты при 3000 вращениях в минуту. В конце вращения поместите чип в инкубатор клеточной культуры для вращения на 1000-2000 вращений в минуту в течение трех часов.
В конце инкубации добавьте 100 микролитров второй популяции клеток, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту, прежде чем вращать чип при 3000 вращениях в минуту в течение трех минут. Затем поместите клетки в инкубатор клеточной культуры на 1000-2000 вращений в минуту в течение 24 часов. Для формирования сфероидов сэндвича сначала добавьте 100 микролитров первой клеточной популяции, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 вращений в минуту, а затем три минуты вращения при 3000 вращениях в минуту.
В конце вращения поместите чип на ротатор в инкубаторе клеточной культуры в течение двух часов при 1000-2000 вращениях в минуту, прежде чем добавлять 100 микролитров второй популяции клеток, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 вращений в минуту. Поверните чип при 3000 об/мин в течение трех минут и поместите чип обратно в инкубатор для трехчасовой инкубации с вращением. Затем добавьте еще 100 микролитров первой популяции клеток, в то время как чип вращается со скоростью от 500 до 1000 оборотов в минуту, и поверните и культуру клеток, как только что продемонстрировано в течение 12 часов.
Следуя протоколу, как было продемонстрировано, чип культуры CMS диаметром шесть сантиметров может быть успешно изготовлен. Канал чипа культуры CMS включает в себя порт входов, а также центральные, слайды и микроуровне регионов. Покадровые изображения двух типов клеточной культуры, сделанные со скоростью 2000 вращений в минуту в течение первых 24 часов культуры в отдельных микросхемах CMS, как попродемонстрировано, показывают успешное образование сфероидов.
Изображение микроуровн после трех дней культуры показывает, что сфероиды демонстрируют отличную однородность и сферичность. Также могут быть созданы кокультурные сфероиды с конентрическими, янусными и сэндвич-структурами. Кроме того, клеточные культуры подвергаются воздействию высокой гравитации в течение семи дней, а затем жить / мертвых окрашивания, показывают, что большинство клеток выжить долгосрочной культуры в чипах.
Верхние и нижние слои чипа культуры CMS должны быть тщательно выровнены, когда они связаны, в противном случае количество ячеек в каждом микроуэлле может быть не равным. Это исследование может снизить входной барьер для исследований сфероидов совместной культуры и может быть широко использовано в исследованиях совместной культуры, например, для скрининга новых препаратов, представляющих интерес.
