Этот протокол демонстрирует, что теперь мы можем определить эффект миграстатических ингибиторов подробно в 3D-моделях рака. Основным преимуществом является простота и все-в-одном подход, с помощью которого эта техника может быть выполнена. Этот метод позволяет оценить миграстатические препараты в исследованиях рака в 3D-настройках, что позволяет тестировать препараты в более опухолевой среде, соответствующей условиям.
Этот метод может быть применен к тестированию цитотоксических препаратов при раке или, например, для оценки влияния радиации на распространение рака и миграцию клеток. Полезно практиковать средний шаг удаления и замену коллагена с обычными пластинами 96-хорошо, чтобы стать уверенным. Кроме того, обучение на конфокальный микроскоп имеет важное значение.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для исследователей, чтобы понять необходимую деликатную обработку сфероидов и их использование в конфокальные микроскопии. В первый день экспериментов, имеют стандартную культуру среды, в данном случае, U251, готовы к соответствующей линии ячейки. В капюшоне культуры ткани, добавить 0,5 миллилитров трипсина в культуру, чтобы трипсинизировать раковые клетки.
Подсчитайте раковые клетки на гемоцитометре и разбавляйте до концентрации в пять раз от 10 до третьих клеток на миллилитр. Держите подвески клеток в четко обозначенных, стерильных универсальных трубках. Resuspend клетки нежной инверсии, чтобы избежать клетки слипания.
Используйте пипетку, чтобы добавить 200 микролитров клеточной культуры к каждому колодец в 96-хорошо пластины. Добавьте 200 микролитров 1X PBS к каждому пустой колодец, чтобы избежать испарения. Инкубировать клетки в инкубаторе при 37 градусах по Цельсию.
Через 24 часа проверьте клетки с помощью ярко-полевой микроскопии. Клеточные линии, такие как линии раковых клеток глиомы образуют сфероиды в нижней части колодеца в течение 24 часов. Инкубировать сфероиды в течение еще 48 часов, чтобы 3D клеточной архитектуры в форме.
На третий день поместите коллаген, 5X культурную среду, гидроксид натрия с одним моляром и одну 20-миллилитровую трубку на льду. Аккуратно и медленно добавьте 10,4 миллилитров холодного коллагена в охлажденную культурную трубку. Избегайте пузырей.
Затем аккуратно добавьте 1,52 миллилитров холодной стерильной среды культуры 5X. Избегайте пузырей. Перед использованием аккуратно добавьте 72 микролитров холодного стерильного гидроксида натрия и держите раствор на льду.
Смешайте осторожно, трубчатые и избегая пузырьков. Эффективное смешивание приводит к изменению цвета от красного до оранжево-красного в среде. Оставьте смесь на льду до использования.
Далее, чтобы удалить 190 микролитров супернатанта из 96-хорошо пластины подготовлены в первый день, используйте пипетку под углом к стороне от хорошо. Будьте очень осторожны, чтобы не нарушить сфероиды, которые образуются в нижней части хорошо. Аккуратно добавьте 100 микролитров коллагеновой смеси к каждой хорошо, трубя вниз по стороне колодец.
Избегайте пузырьков и любых нарушений сфероидов. Храните любую оставшуюся коллагеновую смесь в 20-миллилитровой трубке при комнатной температуре для оценки полимеризации. Инкубировать пластину в инкубаторе, по крайней мере 10 минут, чтобы коллаген полимеризуется.
Когда оставшийся коллаген становится полутвердым и губчатым, сфероиды готовы к лечению ингибитором. Добавьте ингибиторы при концентрации 2X в пять миллилитров среды культуры. Pipette 100 микролитров среды мягко вниз стороне каждого хорошо, чтобы избежать нарушения сфероидов.
Наблюдайте и изображения каждого сфероида с помощью ярко-полевой микроскопии во время нулевого часа, 24 часов, 48 часов и 72 часов для оценки активности наркотиков. Затем верните тарелку в инкубатор. Теперь поместите пластину в капюшон культуры тканей и аккуратно замените супернатант 100 микролитров 1X PBS.
Позаботьтесь, чтобы не беспокоить сфероид, и избежать прикосновения к коллагену. Повторите этот шаг мытья еще три раза. Удалите окончательную стирку в каждой хорошо, и заменить 100 микролитров 4%формальдегида в 1X PBS.
Поместите 96-хорошо пластины на скамейке лаборатории, накрыть фольгой, и оставить на 24 часа при комнатной температуре. На следующий день осторожно удалите формальдегид и замените 1X PBS. Повторите эту стирку еще три раза.
Затем замените мытье 1X PBS 100 микролитров свежеприготовленного раствора Triton X-100. Инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре. В то же время, подготовить блокирующий раствор с 50 миллилитров 1X PBS и 05% обезжиренного сухого молока в 50-миллилитровой трубке, и тщательно перемешать.
Через 30 минут, удалить Triton X-100, и мыть три раза с 1X PBS. Добавьте 100 микролитров блокирующего раствора в каждую колодец и инкубировать в течение 15 минут. Далее разбавляют антимышки IgG ацетилированным тубулином антителом в блокирующего буфера в соотношении от одного до 100.
Центрифуга основной блокирующей антитела буферной смеси в течение пяти минут в 15, 682 раза г. Аккуратно удалите блокирующий раствор в каждой хорошо, и добавьте от 25 до 50 микролитров антитела, блокирующего буферный супернатант из трубки. Инкубировать в темноте при комнатной температуре в течение одного часа.
Затем удалите раствор антитела из каждой хорошо, и мыть три раза с 100 микролитров 1X PBS. Разбавить вторичное антитело в блокирующего буфера при рекомендуемой концентрации в дополнение к любым дополнительным флуоресцентным пятнам. Опять же, центрифуга вторичного раствора антител в течение пяти минут в 15, 682 раз г.
Удалите блокирующий раствор из каждой хорошо, и добавить от 25 до 50 микролитров вторичного антитела supernatant. Инкубировать в темноте в течение 1 1 / 2 часа при комнатной температуре. Удалите вторичный раствор красителя антитела, и мыть три раза с 1X PBS, 100 микролитров на колодец.
Тщательно поднимите отдельные коллагеновые пробки путем всасывания с пластиковой 200-микролитровой пипеткой на центр стеклянной горки. Добавьте одну каплю подходящего крепления, чтобы покрыть коллагеновую вилку. Распоимить крышку поверх образца и хранить слайд при комнатной температуре в темноте.
Трехмерная технология сфероидов продвигает понимание лекарственно-опухолевых взаимодействий, поскольку она более репрезентативна для среды, специфичной для рака. В этом исследовании были выявлены потенциальные анти- или промигрущие эффекты. Это особенно заметно в KNS42 с, казалось бы, без миграции ни в контроле или обработанных сфероидов.
Гибель клеток наблюдалась при самой высокой концентрации ингибитора в 10 микромоляров. Ядерная фрагментация и мигрирующие клетки были очевидны в клетках U251. U251 клеточных сфероидов были шипы, излучающие от оригинального сфероида, с увеличением клеток округливания в клетках очевидно с увеличением концентрации ингибитора.
В KNS42 наблюдались обрушения микротрубочек и фрагментация ядерного оружия. Листовые выступы с одноклеточными шипами указывают на миграцию KNS42. При самой низкой концентрации ингибитора, этот фенотип был выражен, но был потерян с увеличением концентрации ингибитора.
Очень важно оставить все реагенты на льду до готовности. В противном случае, коллаген начинает полимеризации, прежде чем все это было добавлено в сфероиды. Существует возможность количественной оценки изображений, генерируемых конфокальные микроскопии для оценки влияния, например, миграстатических препаратов на морфологию клеток.
Это позволило нам впервые подтвердить влияние миграстатического ингибитора МИ-192 на уровни ацетилирования микротрубочек и изучить это дальше с точки зрения миграции клеток. При обработке формальдегида следует позаботиться о дополнительном уходе за шагом фиксации. Применяются обычные правила охраны труда и техники безопасности.
